四种重要致病性分枝杆菌DHPLC检测鉴别方法的建立 被引量：8

1

作者 陈茹 毕英佐 +6 位作者 刘志玲 刘志辉 马静云 曾碧健 吴晓薇 周科 林志雄 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期41-45,52,共6页

目的运用多重核酸扩增（PCR）联合变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC）分析技术原理,针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及副结核分枝杆菌建立多重PCR-DHPLC快速检测方法,实现同时... 目的运用多重核酸扩增（PCR）联合变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC）分析技术原理,针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及副结核分枝杆菌建立多重PCR-DHPLC快速检测方法,实现同时检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌。方法根据四种分枝杆菌特异基因序列分别设计菌种特异核酸扩增引物,通过筛选优化试验建立四重核酸扩增体系,对核酸扩增产物采用DHPLC设备进行检测分析,每一菌种的核酸扩增产物分别形成DHPLC特征峰图。对结核分枝杆菌等51株分枝杆菌标准株和分离株样品以及沙门氏菌等22株常见微生物样品进行特异性检测试验 对四种分枝杆菌特异的核酸扩增产物分别制备克隆质粒,通过对梯度稀释的阳性质粒的检测试验,进行多重PCR-DHPLC灵敏度测试 对疑似病人痰液样品和疑似发病牛的组织样品进行检测,并与细菌分离培养法进行比较以验证临床检测效果。结果该方法能快速检测鉴别上述四种分枝杆菌,检测灵敏度达到102~103基因拷贝,从131份疑似病人临床样品中检出91份结核分枝杆菌阳性,从40份来自疑似发病牛群的临床样品中检出31份牛分枝杆菌阳性,检出率均高于细菌分离培养法。结论研究表明所建立的多重PCR-DHPLC方法能快速检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌,为人畜结核、副结核病诊断提供一种新型分子生物学技术手段。 展开更多

关键词 变性高效液相色谱 结核分枝杆菌 牛分枝杆菌 禽分枝杆菌 副结核分枝杆菌 多重PCR

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食品中五种致病性弧菌MPCR-DHPLc检测方法的建立 被引量：5

2

作者 邵碧英 王传得 +4 位作者 郑晶 黄晓蓉 曹际娟 陈彬 吴谦 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第10期500-504,共5页

采用试剂盒法提取5种致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组DNA。分别合成5对特异性引物,对PCR反应体系进行优化后,建立了5种致病性弧菌间的MPCR-DHPLC检测方法。二重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100... 采用试剂盒法提取5种致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组DNA。分别合成5对特异性引物,对PCR反应体系进行优化后,建立了5种致病性弧菌间的MPCR-DHPLC检测方法。二重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100CFU/ml。建立的MPCR-DHPLC方法在食品中弧菌的检测上具有很好的应用价值。 展开更多

关键词 弧菌 基因组DNA 多重PCR 变性高效液相色谱

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变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌 被引量：11

3

作者 徐君怡 曹际娟 +2 位作者 郑秋月 刘淑艳 徐杨 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期127-131,共5页

应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquidchromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法。以编码沙门氏菌的fimY基因、编码... 应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquidchromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法。以编码沙门氏菌的fimY基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌O157:H7的rfbE基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为284、159和499 bp,并验证了该多重PCR具有特异性。沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:沙门氏菌1.5 CFU/ml、空肠弯曲菌15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌O157:H7 15 CFU/ml。在随机采集的226份冷冻鸡肉类样品中,检出了7份样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性。研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测。 展开更多

关键词 沙门氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠杆菌O157:H7 变性高效液相色谱

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绍兴黄酒发酵过程中有机酸及产酸细菌的初步研究 被引量：22

4

作者 吴宗文 孙军勇 +3 位作者 吴殿辉 李晓敏 谢广发 陆健 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期12-18,共7页

采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）分析了绍兴黄酒发酵过程中有机酸组成及动态变化情况,运用变性梯度凝胶电泳技术（denatured gradient gel electrophoresis,DGGE）分析了细菌群落结构变化,以纯培养... 采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）分析了绍兴黄酒发酵过程中有机酸组成及动态变化情况,运用变性梯度凝胶电泳技术（denatured gradient gel electrophoresis,DGGE）分析了细菌群落结构变化,以纯培养结合分子生物学的方法分离、鉴定了产酸细菌,并对其发酵特性进行了研究。结果表明,乳酸、乙酸和柠檬酸是黄酒发酵过程中产生的主要有机酸,其含量占总有机酸的55%以上。有机酸的含量随发酵的进行呈递增趋势,柠檬酸、草酸、酒石酸、乳酸、苹果酸、丙酮酸和乙酸含量增幅较大（90%~385%）,琥珀酸、富马酸、α-酮戊二酸增幅较小（28%~34%）。DGGE分离及测序结果表明,黄酒发酵过程中主要的细菌有乳酸杆菌（Lactobacillus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、葡萄球菌（Staphylococcus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、链霉菌（Streptomyces sp.）以及不可培养细菌（Uncultured bacterium）等。经16S r DNA序列分析鉴定及发酵特性研究,产酸细菌主要为乳酸杆菌,其中植物乳杆菌占70%,属于异型发酵乳酸菌。 展开更多

关键词 高效液相色谱(HPLC) 有机酸 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 乳酸杆菌 绍兴黄酒

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广东省家族性和早发性乳腺癌BRCA1基因突变的相关研究 被引量：6

5

作者 周婕 饶南燕 +7 位作者 李顺荣 金亮 贾卫娟 龚畅 于风燕 苏逢锡 宋尔卫 邵志敏 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期213-216,共4页

目的研究广东省家族性和早发性乳腺癌患者的BRCA1基因突变情况及其与ER、PR、HER2和ALN等表达的关系。方法抽取广东省58例家族性和早发性乳腺癌患者的外周静脉血,提取基因组DNA,应用PCR技术对BRCA1基因的全部编码序列进行扩增,突变分析... 目的研究广东省家族性和早发性乳腺癌患者的BRCA1基因突变情况及其与ER、PR、HER2和ALN等表达的关系。方法抽取广东省58例家族性和早发性乳腺癌患者的外周静脉血,提取基因组DNA,应用PCR技术对BRCA1基因的全部编码序列进行扩增,突变分析由变性高效液相色谱分析(DHPLC)进行预筛后,进行DNA测序方法证实。免疫组化法检测患者中ER、PR、HER2和ALN的表达情况,并分析其表达与BRCA1基因突变的关系。结果58例乳腺癌患者中,2例年龄<35岁的患者发生BRCA1致病突变,而且其中1个为新发现的拼接点突变(331G→A)。BRCA1基因突变位点与ER、PR、HER2和ALN的表达无关。结论广东省早发性乳腺癌患者和家族性乳腺癌患者的BRCA1基因突变的发生率明显低于西方国家;331G→A致病突变位点可能是广东省早发性乳腺癌的特有突变位点;基因突变位点可能与ER、PR、HER2和ALN等组织学表达无关。 展开更多

关键词 乳腺癌 BRCA1基因 基因突变 变性高效液相色谱

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多重连接依赖式探针扩增和变性高效液相色谱法检测Duchenne型肌营养不良症患者DMD基因的缺失/重复突变 被引量：13

6

作者 申本昌 张成 +1 位作者 孙筱放 李少英 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期83-86,共4页

目的比较多重连接依赖式探针扩增法（MLPA）和变性高效液相色谱法（DHPLC）检测Duchenne型肌营养不良症（DMD）患者DMD基因缺失／重复突变的效果。方法选择2004年10月-2005年10月在我院确诊的22位无关DMD男性患者，采用MLPA法对经DHPLC... 目的比较多重连接依赖式探针扩增法（MLPA）和变性高效液相色谱法（DHPLC）检测Duchenne型肌营养不良症（DMD）患者DMD基因缺失／重复突变的效果。方法选择2004年10月-2005年10月在我院确诊的22位无关DMD男性患者，采用MLPA法对经DHPLC技术检测过的患者的DMD基因的缺失／重复突变进行突变筛查，同时对先证者的23位女性亲属进行基因的缺失／重复突变检测。结果DHPLC技术和MLPA法均检测出11位先证者具有DMD基因缺失突变，3位先证者具有DMD重复突变；MLPA法除能更精确地检测出上述突变外，还检测出DHPLC法未检测出的两位患者的DMD基因存在缺失突变。16个家系中18位可能的女性携带者中，12位经检测为缺失／重复突变携带者。两种方法均未检测到6位先证者及其女性亲属DMD基因具有缺失／重复突变。结论与DHPLC法和传统的多重PCR方法相比，MLPA法检测DMD基因的缺失／重复突变位置更为准确。MLPA法可用于检测先证者及家系中女性携带者DMD基因的缺失／重复突变。 展开更多

关键词 DUCHENNE肌营养不良症 多重连接依赖式探针扩增法 变性高效液相色谱法 DMD基因缺失/重复突变

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应用DHPLC筛查人类mtDNA高变区I的异质性 被引量：5

7

作者 蒋琼橙 伍新尧 +1 位作者 区雪玲 孙宏钰 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期93-96,共4页

[目的]检测人类mtDNA HVI区的异质性,建立有效的筛查低水平异质性DNA的技术。[方法]扩增人mtDNA 的 HVI区内269 bp的片段,以不同比例混合相差一个碱基的2种DNA片段的PCR扩增产物,配制异质性DNA模型,用变性高效液相色谱技术(DHPLC)检测,... [目的]检测人类mtDNA HVI区的异质性,建立有效的筛查低水平异质性DNA的技术。[方法]扩增人mtDNA 的 HVI区内269 bp的片段,以不同比例混合相差一个碱基的2种DNA片段的PCR扩增产物,配制异质性DNA模型,用变性高效液相色谱技术(DHPLC)检测,确定最佳检测条件。[结果]应用DHPLC检测HVI区的片段(269 bp),最低可检测出含量为5％的异质性样本。在80例无关个体的mtDNA样本中,共检测到15例具有异质性。[结论]所建立的PCR-DHPLC方法可用于检测mtDNA的异质性。 展开更多

关键词 DHPLC 筛查 线粒体DNA 异质性 变性高效液相色谱

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应用变性高效液相色谱筛查颅内静脉系统血栓形成AT-Ⅲ基因突变及多态性 被引量：5

8

作者 汪丽萍 裘毓雯 +6 位作者 尹爱兰 马云燕 刘柯玲 熊丽 余艳红 钟梅 王辰 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1982-1986,共5页

目的应用变性高效液相色谱(DHPLC)方法筛查生育期女性颅内静脉系统血栓形成(CVT)AT-Ⅲ基因的突变及多态性。方法标本来自于2006年6月～2007年12月南方医院生育期女性CVT患者,及52例严格配伍的健康女性外周静脉血。提取所有受试者全血DNA... 目的应用变性高效液相色谱(DHPLC)方法筛查生育期女性颅内静脉系统血栓形成(CVT)AT-Ⅲ基因的突变及多态性。方法标本来自于2006年6月～2007年12月南方医院生育期女性CVT患者,及52例严格配伍的健康女性外周静脉血。提取所有受试者全血DNA,PCR扩增后应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术分析抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)基因的启动子区,第1～6外显子及其侧翼序列的基因变异情况。结果DHPLC技术分析发现病例组出现6种异常峰形,经测序证实1例致病突变为Exon6 G13328A的杂合突变,1例新发现的同义突变Exon4+243G>A;SNP位点6个,其中4个SNP库已报道的SNP位点,2个新发现的SNP位点。对照组发现一种异常峰型(三峰)。结论DHPLC是一种自动、快速、高通量的基因突变及SNP位点的筛查方法,AT-Ⅲ基因突变可能是导致生育期非妊娠女性CVT的遗传因素之一,功能性SNP位点也可能参与了该人群VTE的发生。 展开更多

关键词 变性高效液相色谱 静脉血栓栓塞 单核苷酸多态性 基因突变 AT-Ⅲ基因

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不同年龄Ⅱ型糖尿病患者中黑白头发mtDNA异质性研究 被引量：4

9

作者 谭凤明 程喜平 +3 位作者 陈盛强 陈智超 王延平 沈岩松 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期85-88,共4页

研究T2DM患者头发中mtDNA异质性的规律。 方法 选择T2DM高突变位点的mtDNA编码区和控制区2片段进行PCR扩增，以 DHPLC技术分析黑、白头发mtDNA目标片段在T2DM组和对照组异质性差异。结果 在20~45岁对照组、20~ 45岁T2DM组、45~70岁对照... 研究T2DM患者头发中mtDNA异质性的规律。 方法 选择T2DM高突变位点的mtDNA编码区和控制区2片段进行PCR扩增，以 DHPLC技术分析黑、白头发mtDNA目标片段在T2DM组和对照组异质性差异。结果 在20~45岁对照组、20~ 45岁T2DM组、45~70岁对照组和45~70岁T2DM组4个研究对象群，黑头发的mtDNA异质性分别为：3%，10%，9%，17%，白头发的mtDNA异质性分别为：9%，20%，21%，40%。其中同年龄T2DM组和对照组比较：20~45岁、45~70岁2个年龄组T2DM患者黑头发mtDNA异质性均高于同年龄对照组，45~70岁T2DM组白头发mtDNA异质性也高于同年龄对照组患者；不同年龄的 T2DM组以及不同年龄对照组之间比较：45~70岁对照组白头发mtDNA异质性高于20~45岁对照组、45~70岁T2DM组黑头发 mtDNA 异质性明显高于 20~45 岁 T2DM 患者（P〈0.05） ；组内比较：白头发 mtDNA 异质性在 45~70 岁对照者和 2 个年龄组的 T2DM患者组内内明显高于黑头发（P〈0.05）。 结论 T2DM患者mtDNA异质性增高，年龄越大程度越高。 展开更多

关键词 头发 2型糖尿病 MTDNA 异质性 变性高效液相色谱

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多重PCR-变性高效液相色谱法快速检测结核致病菌群并同步鉴别致病菌种 被引量：3

10

作者 陈茹 高小博 +3 位作者 郭爱珍 刘志玲 吴晓薇 朱道中 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期1504-1510,共7页

本研究旨在运用多重PCR联合变性高效液相色谱(DHPLC)技术原理,建立快速检测人兽结核致病菌群并鉴别主要致病菌种的新方法。建立了四重PCR-DHPLC方法,可同时检测结核分枝杆菌复合群(MTC)特异的IS6110和IS1081插入序列、结核分枝杆菌特异... 本研究旨在运用多重PCR联合变性高效液相色谱(DHPLC)技术原理,建立快速检测人兽结核致病菌群并鉴别主要致病菌种的新方法。建立了四重PCR-DHPLC方法,可同时检测结核分枝杆菌复合群(MTC)特异的IS6110和IS1081插入序列、结核分枝杆菌特异结构基因和牛分枝杆菌特异结构基因共4个目标基因。采用13种分枝杆菌标准菌株和分离株以及23种常见微生物样品进行特异性试验,采用纯化标准菌株DNA以及克隆了扩增序列的重组质粒DNA进行检测灵敏度试验,采用从临床疑似发病牛群采集的牛组织样品进行临床检测试验,并与细菌分离培养方法进行比对。结果表明:所建立的多重PCR-DHPLC方法能特异检测MTC并准确鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,而对其它11种分枝杆菌以及23种常见微生物样品均呈典型阴性检测结果;检测灵敏度达到每个反应102～103基因拷贝或3.6～6.8fg DNA模板浓度。采用该法从39份临床疑似样品中检出33份MTC阳性并检出其中28份为牛分枝杆菌阳性,而培养法检出21份阳性样品。采用该法临床检测全程可缩短至1d之内,其中对纯化DNA样品的检测分析可在2h内完成。本研究为人兽结核致病菌(群)的快速检测鉴别提供了新型分子生物学方法。 展开更多

关键词 变性高效液相色谱 结核分枝杆菌复合群 结核分枝杆菌 牛分枝杆菌

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变性高效液相色谱法检测多种途径获取的非小细胞肺癌组织表皮生长因子受体基因突变 被引量：4

11

作者 陈思远 陈志红 +7 位作者 郭爱林 苏健 黄迎 陈世良 张绪超 杨学宁 杨衿记 吴一龙 《中国肺癌杂志》 CAS 2010年第9期850-855,共6页

背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是最重要的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗靶点,EGFR突变可预测酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的疗效。DNA直接测序是检测E... 背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是最重要的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗靶点,EGFR突变可预测酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的疗效。DNA直接测序是检测EGFR突变最常用的方法,同时也作为突变检测的"金标准",但该方法耗时较长、所需组织量较多且敏感性较低。变性高效液相色谱法是一种快速、自动化、高敏感性的突变检测方法,本研究旨在探讨变性高效液相色谱法(denaturing high-performance liquidc hromatography,DHPLC)快速检测NSCLC肿瘤组织EGFR基因突变的诊断价值。方法通过检测已知按不同比例混合的野生型及突变型EGFR质粒DNA,评价DHPLC法的准确性和敏感性。选取经多种途径获取的83例NSCLC患者的冻存肿瘤组织,提取DNA并PCR扩增EGFR外显子19、21,用DHPLC法检测并与直接测序法进行比较。结果当突变型质粒与野生型质粒按1:100混合时,仍可被DHPLC法显著检出,而直接测序法仅可检出1:10水平。83例NSCLC组织标本中,DHPLC法检出22例EGFR突变(突变率26.51%),3例直接测序法结果为野生型,余19例EGFR突变及61例野生型均与直接测序法结果相符。DHPLC法的敏感度为100%,特异度为95.31%,对经皮细针肺穿刺活检、淋巴结活检以及外科切除等途径获取的肿瘤样本均具有较高的敏感度、特异度。EGFR突变与性别、病理类型显著相关,与吸烟状态、年龄等无相关性。结论 DHPLC法可作为NSCLC患者EGFR基因型的初筛方法。 展开更多

关键词 肺肿瘤 表皮生长因子受体 突变 变性高效液相色谱

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应用变性高效液相色谱法检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性 被引量：3

12

作者 吴文冰 蔡鹏威 +2 位作者 方超英 沈菁 陈雯 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1050-1053,共4页

目的建立DHPLC快速检测Hp对克拉霉素耐药性的新方法。方法抽提56份经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的Hp菌株DNA及其对应的胃粘膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23SrRNA区187bp基因,运用DHPLC技术对PCR产物进行突变分析,并进行DNA测序... 目的建立DHPLC快速检测Hp对克拉霉素耐药性的新方法。方法抽提56份经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的Hp菌株DNA及其对应的胃粘膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23SrRNA区187bp基因,运用DHPLC技术对PCR产物进行突变分析,并进行DNA测序。结果 56份克拉霉素耐药的Hp菌株DNA经DHPLC分析,有51份存在异源双链峰,测序证实均存在点突变,5份无异源双链峰,测序证实无点突变,故DHPLC对基因突变耐药菌株的敏感性和特异性为100%,而且56份组织标本DNA检测结果与菌株DNA检测结果一致。结论 DHPLC可应用于Hp对克拉霉素耐药性的快速检测,具有广阔的临床应用前景。 展开更多

关键词 幽门螺杆菌 23S RRNA 克拉霉素耐药 变性高效液相色谱法 基因突变

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韧带样型纤维瘤病Wnt通路中APC/β-catenin基因异常 被引量：5

13

作者 杨吉龙 王坚 +2 位作者 周晓燕 侯英勇 朱雄增 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 2006年第10期859-863,共5页

背景与目的:APC和β-caten in基因作为W nt通路上重要的成员,其异常在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。本研究分析了韧带样型纤维瘤病中APC和-βcaten in基因突变,探讨W nt通路中APC/β-caten in基因异常在肿瘤发生中的作用。方法... 背景与目的:APC和β-caten in基因作为W nt通路上重要的成员,其异常在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。本研究分析了韧带样型纤维瘤病中APC和-βcaten in基因突变,探讨W nt通路中APC/β-caten in基因异常在肿瘤发生中的作用。方法:采用PCR-DHPLC-Sequence的方法分析韧带样型纤维瘤病中APC和-βcaten in基因的突变,免疫组织化学EnV ision+两步法检测β-caten in、cyc linD1和c-myc蛋白的表达。结果:APC基因发生碱基置换突变,均为体系突变,突变率为26.1%(18/69),突变不产生截短APC蛋白。β-caten in基因发生碱基转换,突变率为18.8%(13/69),导致第3外显子的codon41处苏氨酸磷酸化位点转变为丙氨酸。-βcaten in蛋白异常表达阳性率为47.8%(33/69),在APC、β-caten in基因突变阳性和阴性病例间,其异常表达阳性率没有显著差异。β-caten in异常表达阳性病例的c-myc蛋白阳性率(69.7%,23/33)显著高于阴性病例的c-myc阳性率(22.2%,8/36),两者之间有正相关关系(Pearson's r=0.477),而cyc linD1的表达没有显示出这种相关性和差异。结论:韧带样型纤维瘤病中APC、β-caten in基因存在体系突变,β-caten in蛋白存在异常表达,可能引起c-myc表达增加。韧带样型纤维瘤病中W nt通路存在异常,可能在肿瘤发生中起重要作用。 展开更多

关键词 韧带样型纤维瘤病 APC基因 Β-CATENIN 基因 变性高效液相色谱分析

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禽肉产品中禽流感与新城疫多重PCR-DHPLC检测方法的建立 被引量：5

14

作者 孙涛 徐彪 +4 位作者 朱来华 张太翔 梁成珠 凌宗帅 岳志芹 《中国动物检疫》 CAS 2011年第3期41-45,51,共6页

应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同... 应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。 展开更多

关键词 禽流感病毒 新城疫病毒 多重rt-pcr 变性高效液相色谱

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Ⅰ型鸭肝炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立 被引量：6

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作者 孙涛 肖西志 +4 位作者 徐彪 梁成珠 凌宗帅 张太翔 岳志芹 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第7期13-18,共6页

用RT-PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),建立Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速检测方法。根据获得的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV I)RNA聚合酶基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了1对引物,RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。以正常鸭... 用RT-PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),建立Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速检测方法。根据获得的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV I)RNA聚合酶基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了1对引物,RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。以正常鸭胚尿囊液、正常鸭肝组织、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、H5N1亚型禽流感病毒、鸭源新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒作对照进行特异性检测;将强毒株核酸稀释成不同梯度,做灵敏度检测;同时将该方法与病毒分离和荧光定量RT-PCR方法做人工感染样品的平行检测。结果表明,该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到4 pg的DHV I核酸模板,与荧光定量PCR检测结果一致。PCR-DHPLC对DHVⅠ强毒株人工感染鸭组织脏器的检测结果与荧光定量PCR检测结果的阳性检出率均为100%,对脑、脾、肺病料的检出率显著(P≤0.01)高于病毒分离,PCR-DHPLC与荧光RT-PCR检测方法相比较,两种方法检测DHVⅠ的符合率为100%。研究表明该方法可用于诊断Ⅰ型鸭肝炎病毒,是一种有效的新方法。 展开更多

关键词 Ⅰ型鸭肝炎病毒 rt-pcr 变性高效液相色谱

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PAX4基因多态性与胰岛自身抗体阴性酮症倾向糖尿病的关系 被引量：3

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作者 周敏 张英 +4 位作者 张冬梅 林建 王建平 周海峰 周智广 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期215-221,共7页

目的:探讨配对盒4(paired box4,PAX4)基因多态性与胰岛自身抗体阴性酮症倾向糖尿病(KPD)的关系。方法:应用变性高效液相色谱法(DHPLC)筛查141例谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD-Ab)和蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体(IA-2Ab)阴性的KPD患者(KPD组)和... 目的:探讨配对盒4(paired box4,PAX4)基因多态性与胰岛自身抗体阴性酮症倾向糖尿病(KPD)的关系。方法:应用变性高效液相色谱法(DHPLC)筛查141例谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD-Ab)和蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体(IA-2Ab)阴性的KPD患者(KPD组)和112例非糖尿病对照者(NC组)的PAX4基因外显子3和9,对异常峰型者经测序证实其碱基改变。应用聚合酶链反应-限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)法对141例KPD患者和308例对照者的PAX4基因A1168C多态位点进行等位基因和基因型频率分析。结果:在本组人群中未发现PAX4基因外显子3有变异。外显子9中的单核苷酸多态性(SNP)位点A1168C,引起错义突变P321H(rs712701)。A1168C位点的C等位基因和CC基因型频率在KPD组与NC组间差异无统计学意义;按性别分层后,KPD组C等位基因和CC基因型频率差异均有统计学意义(P=0.009,0.028);以年龄分层后,<20岁组与≥20岁组比较C等位基因和CC基因型频率分布差异均有统计学意义(P=0.034,0.032);在CC基因型的KPD患者中,空腹C肽(FCP)水平高于AA基因型者,差异有统计学意义(P=0.005)。结论:本组中国南方汉族人群PAX4基因A1168C(P321H)多态性与胰岛自身抗体阴性KPD未见关联,但分层研究提示PAX4基因A1168C多态性对男性和<20岁的KPD患者的发病可能有影响。 展开更多

关键词 酮症倾向糖尿病 PAX4基因 单核苷酸多态性 变性高效液相色谱法

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变性高效液相色谱在检测肝豆状核变性基因突变中的作用 被引量：2

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作者 杨静芳 江晓华 +4 位作者 梁秀龄 王丽娟 陈嵘 李昕 陈彪 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期124-126,U003,共4页

目的　建立变性高效液相色谱 (denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)技术检测肝豆状核变性 (WD)基因第 8外显子突变。方法　利用聚合酶链式反应 (PCR)扩增WD基因第 8外显子片段 ,扩增产物直接进行DHPLC分析 ;对峰型有... 目的　建立变性高效液相色谱 (denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)技术检测肝豆状核变性 (WD)基因第 8外显子突变。方法　利用聚合酶链式反应 (PCR)扩增WD基因第 8外显子片段 ,扩增产物直接进行DHPLC分析 ;对峰型有改变的样品经测序分析确认突变。结果　在 5 1例WD先证者中共发现两种错义突变 (Arg778Leu和Arg778Gln)、一种插入突变 (Ins2 30 2C)和一种多态性位点 (C2 310G)。其中 12例先证者带有Arg778Leu杂合错义突变 ,3例为Arg778Leu纯合错义突变 ,1例为Arg778Gln杂合错义突变 ,1例为杂合 2 30 2C插入突变。多态位点C2 310G与Arg778Leu突变完全连锁。结论　WD基因第 8外显子阳性检出率为 33 3% (17/ 5 1) ,说明DHPLC技术是一种可用于临床WD基因诊断的高效。 展开更多

关键词 变性高效液相色谱 检测 肝豆状核变性 基因突变 聚合酶链式反应

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运用变性高效液相色谱快速检测CTX-M超广谱β内酰胺酶基因型 被引量：3

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作者 刘朝晖 张盛斌 +1 位作者 王汉平 杨银梅 《中国感染与化疗杂志》 CAS 2006年第6期384-388,共5页

目的直用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对确认产 ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株 CTX-M 型质粒酶进行基因分型,探讨其灵敏度和特异度,以建立快速检测 CTX-M 型 ESBLs 的新方法。方法采用 PCR 技术从大肠埃希菌和肺炎克雷伯... 目的直用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对确认产 ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株 CTX-M 型质粒酶进行基因分型,探讨其灵敏度和特异度,以建立快速检测 CTX-M 型 ESBLs 的新方法。方法采用 PCR 技术从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出 CTX-M 型质粒的编码序列,用 DHPLC 技术对扩增产物进行分析和 DNA 测序,确定其基因突变的类型,通过比对两者结果后确定其基因型。结果从34株产 ESBLs 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出35份 CTX-M 型 ESBLs 编码序列(其中1株同时扩增到2份 CTX-M 型编码序列)。11份与标准菌株 CTX-M-3一致:4份与标准菌株 CTX-M-9一致;测序确定分别为 CTX-M-3型和 CTX-M-9型:20份表现为3种形态各异的异常洗脱峰,测序结果表明20份样本与其标准株对比均存在着基因突变,DHPLC 中异常峰一致的样本均为同一基因亚型。结论 DH-PLC 可用于 ESBLs 基因分型的检测,能快速检测 CTX-M 的基因型,具有准确性高、简便快捷、经济等特点,有很大的临床应用价值。 展开更多

关键词 变性高效液相色谱 超广谱Β内酰胺酶 CTX—M型 基因型

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运用DHPLC技术进行脊髓性肌萎缩症SMN-T基因缺失检测的初步研究 被引量：3

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作者 杨元 彭茜 +1 位作者 阿周存 林立 《临床儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期271-274,共4页

目的评价变性高效液相色谱技术(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)在脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)端粒运动神经元生存基因(survivalmotorneurontelomericcopy,SMN-T)缺失筛查中的应用价值。方法应用... 目的评价变性高效液相色谱技术(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)在脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)端粒运动神经元生存基因(survivalmotorneurontelomericcopy,SMN-T)缺失筛查中的应用价值。方法应用扩增限制性长度多态性技术(PCR-RFLP)、DHPLC及DNA测序技术对51例SMA患儿及其双亲与67例非SMA患儿SMN-T与着丝粒运动神经元生存基因(survivalmotorneuroncentromericcopy,SMN-C)碱基差异位点exon7(C/T)与exon8(G/A)进行检测。结果PCR-RFLP与DHPLC技术均同时检出45例SMA患儿SMN-T基因exon7+8或exon7纯合缺失,DNA测序证实了PCR-RFLP与DHPLC检测的可靠性。在DHPLC检测中发现,6例非SMN-T纯合缺失患儿的SMN-T与SMN-C基因拷贝数存在不平衡;在SMN-T基因纯合缺失患儿双亲中,75.5%(77/102例)的个体两基因拷贝数存在不平衡;在非SMA对照组中,22.4%的个体(15/67例)两基因拷贝数存在不平衡,两组个体基因拷贝不平衡频率差异有显著性。结论DHPLC技术不仅能快速有效地检出SMN-T基因的纯合缺失,而且通过比较SMN-T与SMN-C基因拷贝数平衡与否,可初步提示患儿SMN-T基因杂合缺失状态与双亲基因缺失的携带者状态,为进一步的基因突变筛查与产前诊断提供依据。 展开更多

关键词 脊髓性肌萎缩症 运动神经元生存基因 变性高效液相色谱技术 基因缺失

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异基因造血干细胞移植植活状态的变性高效液相色谱检测研究的首次报告 被引量：3

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作者 王昱 潘凯枫 陆道培 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2005年第1期9-15,共7页

异基因造血干细胞移植后动态检测供者嵌合状态对判断移植效果和实施临床早期干预治疗具有重要意义。在临床上已有多种方法用于植活检测 ,本研究用变性高效液相色谱 (DHPLC)技术结合聚合酶链反应扩增短串联重复序列 (STR PCR)检测造血干... 异基因造血干细胞移植后动态检测供者嵌合状态对判断移植效果和实施临床早期干预治疗具有重要意义。在临床上已有多种方法用于植活检测 ,本研究用变性高效液相色谱 (DHPLC)技术结合聚合酶链反应扩增短串联重复序列 (STR PCR)检测造血干细胞移植植活状态的特点及可靠性。用非亲缘个体的系列DNA混合体在体外检测此测定方法的可行性和半定量结果的准确性。结果表明 ,体外模拟混合嵌合体检测实验 ,显示扩增前供者DNA嵌合百分率与扩增后供受者DHPLC色谱峰峰面积比值呈直线相关 ,最小检出DNA百分比为 5 %。用该方法分析 5 1例移植对的结果显示 :4 5例均至少有 2个可以区分彼此的有信息位点 (另外 5例无移植前受者标本 ,1例为同卵双生双胞胎 ) ;39例与荧光标记多重PCR扩增STR结合毛细管电泳方法进行对照 ,准确性为 10 0 % ;2 9例与性染色体FISH分析 ,2 7例与特殊基因标记的分析结果一致 ;所有病例均检测到完全供者细胞嵌合状态 (FDC) ;对 3例患者观察到临床复发的同时 ,检测到供者嵌合体的比例明显下降 ,其中 2例为混合嵌合体 ,1例转变为受者自身型。在此基础上 ,我们将该方法首次用于对 8例人类白细胞抗原 (HLA)配型不同 单倍型亲缘供者干细胞及无血缘关系脐带血混合移植患者植活情况的动态检测。结果显示 ,8? 展开更多

关键词 异基因造血干细胞移植 短串联重复序列 变性高效液相色谱 嵌合体

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