GST-pull down技术筛选毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3互作蛋白 被引量：4

1

作者 赵杰 王兵 +4 位作者 骆梅 莫黎杰 李慧 刘迪 陆海 《北京林业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期64-74,共11页

【目的】天冬氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶家族,为了解析毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3在植物生长发育中的分子调节机制,利用GST-pull down联合质谱技术,对PtoAED3的互作蛋白进行鉴定和分析。【方法】通过同源克隆获得了毛白杨PtoAED3的CDS... 【目的】天冬氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶家族,为了解析毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3在植物生长发育中的分子调节机制,利用GST-pull down联合质谱技术,对PtoAED3的互作蛋白进行鉴定和分析。【方法】通过同源克隆获得了毛白杨PtoAED3的CDS序列,构建含GST标签的原核表达载体pGEX-4T-PtoAED3。使用IPTG诱导GST-PtoAED3融合蛋白表达后,利用GST标签对PtoAED3蛋白进行纯化,纯化后的PtoAED3蛋白与毛白杨植株总蛋白共孵育,应用GST-pull down技术获得毛白杨总蛋白中与PtoAED3蛋白相互作用的候选蛋白,随后通过质谱技术对筛选到的候选蛋白进行鉴定与分析。【结果】通过质谱技术鉴定这些蛋白的氨基酸序列,共筛选出128个与PtoAED3特异性结合的候选互作蛋白,这些互作蛋白涉及到细胞进程、代谢过程、应激反应、生物调节、发育过程等多个生物学过程。【结论】通过GSTpull down实验联合质谱技术,筛选出毛白杨中与PtoAED3互作的候选蛋白,为研究毛白杨PtoAED3与底物或复合物的互作及其影响毛白杨生长发育的分子调节机制提供了初步方向。 展开更多

关键词 PtoAED3 gst-pull down 质谱 互作蛋白

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长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2互作蛋白的筛选与验证 被引量：1

2

作者 杨桦 李祥乾 +2 位作者 王帆 方睿 杨伟 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2024年第1期87-97,共11页

【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进... 【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析,并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白,包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系,构建了pGADT7-PBP1重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2重组诱饵质粒,通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测,表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示,诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和CbuqPBP1之间有相互作用,不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。 展开更多

关键词 长足大竹象 信息素结合蛋白 蛋白互作 酵母双杂交 GST pull-down

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两种水稻GDP解离抑制蛋白基因的分离及特征分析 被引量：25

3

作者 梁卫红 唐朝荣 吴乃虎 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期785-791,共7页

以Rho家族成员OsRacD为诱饵 ,采用酵母双杂交体系 ,分离到两种与OsRacD互作的水稻RhoGDP解离抑制蛋白的基因 ,分别命名为OsRhoGDI1和OsRhoGDI2 .酵母体内结合和GSTpulldown分析结果显示 ,OsRhoGDI1和OsRhoGDI2与野生型和组成型激活的OsR... 以Rho家族成员OsRacD为诱饵 ,采用酵母双杂交体系 ,分离到两种与OsRacD互作的水稻RhoGDP解离抑制蛋白的基因 ,分别命名为OsRhoGDI1和OsRhoGDI2 .酵母体内结合和GSTpulldown分析结果显示 ,OsRhoGDI1和OsRhoGDI2与野生型和组成型激活的OsRacD都能结合 ,且不依赖GDI的N端部分序列 ;GDI和Rho的结合具有一定的特异性 .两种GDI在水稻根、地上组织和幼穗等多种组织和器官都有表达 ,但在表达特征上存在明显差异 .研究证实 ,在水稻中存在着调控RhoGTPases的GDP解离抑制蛋白基因家族 。 展开更多

关键词 RHO蛋白 酵母双杂交 GDP解离抑制蛋白 原核表达 GST PULL DOWN

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NIRF对P53蛋白泛素化作用的研究 被引量：12

4

作者 段昌柱 蒲淑萍 +2 位作者 TSUTOMU MORI HIDEO KOCHI 邱宗荫 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第2期163-168,共6页

HEK293和HeLa细胞分别被Np95/ICBP90-likeRINGfingerprotein(NIRF)和P53转染后,细胞上清和免疫沉淀产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法分析;细菌合成GST-P53后,用GSTpull-down技术检测NIRF与P53相互作用;在GST-P53、E1、E2和NIRF... HEK293和HeLa细胞分别被Np95/ICBP90-likeRINGfingerprotein(NIRF)和P53转染后,细胞上清和免疫沉淀产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法分析;细菌合成GST-P53后,用GSTpull-down技术检测NIRF与P53相互作用;在GST-P53、E1、E2和NIRF体外泛素化反应系统中,检测NIRF对P53的体外泛素化.结果表明:NIRF能与P53相互作用,NIRF不仅能与P53特异性结合,而且还会将P53泛素化,这种相互作用在细胞内和细胞外均能发生.推测NIRF可能是P53的一个新的负调节蛋白. 展开更多

关键词 NIRF P53 GST pull-down 泛素化

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弓形虫MIC6羧基端相互作用蛋白的筛选 被引量：9

5

作者 郑斌 尹志奎 +1 位作者 何蔼 詹希美 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期970-974,共5页

目的筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端(MIC6C)相互作用的蛋白。方法以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物;将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在... 目的筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端(MIC6C)相互作用的蛋白。方法以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物;将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白。制备目标蛋白的抗体,Western blot分析GST pull-down实验产物。结果 GST pull-down实验筛选到的目标蛋白的序列与弓形虫醛缩酶的序列一致;制备了醛缩酶的多克隆抗体,目标蛋白条带能被该抗体特异地识别。结论采用GST pull-down技术,初步筛选出与弓形虫MIC6C相互作用的蛋白为醛缩酶。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6羧基端 GSTpull-down 醛缩酶

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蛋白质相互作用实验技术的最新进展 被引量：7

6

作者 王明强 武金霞 +3 位作者 张玉红 韩凝 边红武 朱睦元 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1274-1282,共9页

蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。文章综述了近年来发展起来的研究蛋白质相互作用的常用实验性方法,如酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫共沉淀、G... 蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。文章综述了近年来发展起来的研究蛋白质相互作用的常用实验性方法,如酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫共沉淀、GST Pull-down、双分子荧光互补、荧光共振能量转移、表面等离子共振分析,介绍了其原理、发展进程,并分析了其优缺点。 展开更多

关键词 蛋白质相互作用 酵母双杂交系统 串联亲和纯化 免疫共沉淀 GST Pull—down 双分子荧光互补 荧光共振能量转移 表面等离子共振分析

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体外重组CaV1.2不同蛋白片段纯化及其与CaM相互作用的研究 被引量：4

7

作者 何桂林 邵冬雪 +4 位作者 印丹丹 胡慧媛 郭凤 王红梅 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期773-776,共4页

目的纯化CaV1.2不同蛋白片段并研究其与CaM的相互作用。方法质粒转化、筛选得到转化成功BL21菌株,利用IPTG诱导GST钙通道融合蛋白表达,Glutathione-Sepharose 4B beads纯化钙通道不同蛋白片段;采用GST pull-down assay实验研究钙通道蛋... 目的纯化CaV1.2不同蛋白片段并研究其与CaM的相互作用。方法质粒转化、筛选得到转化成功BL21菌株,利用IPTG诱导GST钙通道融合蛋白表达,Glutathione-Sepharose 4B beads纯化钙通道不同蛋白片段;采用GST pull-down assay实验研究钙通道蛋白不同片段与CaM以及突变体的相互作用。结果 SDS-PAGE结果显示成功纯化获得钙通道不同蛋白片段;GST pull-down assay结果显示CT1可与CaM及突变体结合,且GST-CT1与野生型CaM结合量显著多于与突变体CaM结合量。结论成功纯化CaV1.2钙通道蛋白片段并顺利完成GST pull-down assay实验,为深入研究蛋白相互作用或发现新的蛋白相互作用奠定了基础。 展开更多

关键词 GSTpull-downassay CaV1.2 CAM 融合蛋白

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GST pull-down技术验证CIPK7蛋白激酶与CBL1蛋白的相互作用 被引量：3

8

作者 黄聪琳 丁硕 +1 位作者 姜华 安黎哲 《兰州大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期828-832,共5页

采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组... 采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组质粒,经诱导表达及纯化获得了可溶性GSTCIPK7和CBL1-His融合蛋白,GST pull-down试验证实了CBL1能够与CIPK7结合.CIPK7蛋白与CBL1蛋白之间存在直接的相互作用,为进一步研究蛋白激酶CIPK7的功能奠定了基础. 展开更多

关键词 CBL1蛋白 GST pull-down CIPK7蛋白 蛋白质相互作用

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果蔗SoSGT1与Gibberella fujikuroi侵染下果蔗叶片蛋白的互作研究 被引量：2

9

作者 林生 陈婷 +2 位作者 周明明 陈观水 林文雄 《热带亚热带植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期252-261,共10页

为了解果蔗(Saccharum officenarum L.)在防御Gibberella fujikuroi过程中与So SGT1互作的蛋白,利用GST蛋白标签载体p GEX-6p-1与果蔗So Sgt1基因构建p GEX-6p-1-sgt1表达载体,诱导表达GST-So SGT1融合蛋白,并通过GST pull down技术捕捉... 为了解果蔗(Saccharum officenarum L.)在防御Gibberella fujikuroi过程中与So SGT1互作的蛋白,利用GST蛋白标签载体p GEX-6p-1与果蔗So Sgt1基因构建p GEX-6p-1-sgt1表达载体,诱导表达GST-So SGT1融合蛋白,并通过GST pull down技术捕捉到7个与So SGT1互作蛋白。这些蛋白的功能主要归类为信号转导、抗逆与能量代谢相关蛋白,其中一些蛋白可能与果蔗So SGT1直接互作,如HSP90与RAR1蛋白,另外一些蛋白与果蔗So SGT1可能产生次级互作。在G.fujikuroi侵染果蔗‘福农’叶片时,HSP70、14-3-3蛋白、2-半胱氨酸-过氧化物酶与吡哆醇生物合成蛋白的编码基因呈上调表达,初步说明这些蛋白可能与So SGT1蛋白互作共同参与了果蔗防御梢腐病病原G.fujikuroi的病理过程。 展开更多

关键词 果蔗 GIBBERELLA fujikuroi SoSGT1蛋白 GST PULL DOWN 蛋白互作

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柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1潜在子孢子互作蛋白的筛选 被引量：3

10

作者 崔晓霞 黄兵 +7 位作者 赵其平 韩红玉 朱顺海 徐帅兵 谢雨翔 唐敏 杨志远 董辉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2017年第3期61-67,共7页

为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1... 为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1-EtAMA1,表达、纯化重组蛋白EtAMA1-GST。纯化的重组蛋白经Western blot验证,结果显示在75 k Da处有单一的目的条带,证实了所获得的蛋白为EtAMA1-GST融合蛋白。将EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分别与谷胱甘肽琼脂糖珠孵育后,再分别与子孢子裂解物共孵育,洗脱液经SDS-PAGE分析后,结果显示三者之间的条带明显不同。将差异条带切下进行质谱分析,对获得的蛋白质肽段与Uniprot中鸡球虫蛋白质数据库进行Blast比对,初步获得了10个与EtAMA1存在潜在互作的柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白,包括微线体蛋白、糖酵解酶类、肌动蛋白相关因子以及一些保守蛋白等,他们广泛参与了虫体的入侵、发育、能量代谢等生物学过程。研究结果为进一步阐明EtAMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 柔嫩艾美耳球虫 顶膜抗原-1 GST pull-down 相互作用蛋白

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酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白--泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定 被引量：3

11

作者 陈碧 骆艳婷 +1 位作者 刘新光 梁念慈 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期826-832,共7页

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α... 蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因(UBA52)的cDNA序列有高度同源性(100%).GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用.本实验证明,人泛素-52氨基酸(UBA52)融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白,它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中. 展开更多

关键词 人蛋白激酶CK2α′ 酵母双杂交系统 睾丸 人泛素-52氨基酸融合蛋白(UBA52) GST pull-down

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GST pull-down验证流感病毒PB1-F2蛋白与热休克蛋白40的相互作用 被引量：2

12

作者 侯佩莉 关振宏 +2 位作者 张茂林 李影 段铭 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期202-207,共6页

为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建... 为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建真核表达载体pLEGFP-Hsp40及pCAGGS-PB1-F2,并分别转染293T细胞使其表达Hsp40及PB1-F2融合蛋白,然后进行GST pull-down试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体,经表达、纯化获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白,GST pull-down试验正反两方向都证实了PB1-F2与Hsp40的相互作用,初步证实了流感病毒PB1-F2在体外能与Hsp40发生相互作用。 展开更多

关键词 GST pull-down 流感病毒PB1-F2蛋白 热休克蛋白40 蛋白质相互作用

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微丝相关蛋白HSPC300／hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用的鉴定 被引量：2

13

作者 祝敏 虞红珍 +3 位作者 王豫 汪思应 徐勤枝 周平坤 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期146-151,共6页

为鉴定微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1在肝脏组织的功能,采用GSTpull-down结合质谱技术,检测该蛋白在肝脏中的结合蛋白,结果提示,肌球蛋白Ⅵ与HSPC300/hHBRK1共沉降,Western印迹杂交证实了质谱的结果.构建HSPC300/hHBRK1原核表达载体,诱导... 为鉴定微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1在肝脏组织的功能,采用GSTpull-down结合质谱技术,检测该蛋白在肝脏中的结合蛋白,结果提示,肌球蛋白Ⅵ与HSPC300/hHBRK1共沉降,Western印迹杂交证实了质谱的结果.构建HSPC300/hHBRK1原核表达载体,诱导并获得了His-hHBRK1融合蛋白.利用免疫共沉淀证实hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ存在相互作用,激光共聚焦检测显示hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ在肺癌95D细胞的胞浆共定位,提示其相互作用可能是直接结合.肌球蛋白Ⅵ参与细胞迁移、高尔基分泌泡的运输和维持高尔基体稳定性等作用.hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用,为微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1参与细胞迁移和胞内物质运输提供了进一步佐证. 展开更多

关键词 BrK1/HSPC300 微丝 肌球蛋白Ⅵ 蛋白质相互作用

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猪hnRNPK蛋白与酪氨酸蛋白激酶c-Src的互作分析 被引量：1

14

作者 梁小娟 徐海霞 +2 位作者 李瑞 张朋朋 徐永杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期243-252,共10页

旨在探讨猪不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)与含SH3结构域的非受体型酪氨酸激酶(c-Src)之间的互作关系。采用PCR和酶切连接的方法,构建pGBKT7-hnRNPK、pGADT7-c-Src、pGADT7-ΔSH3、pGADT7-ΔSH2、pGADT7-ΔPTKc和pGADT7-SH3酵母双杂交载体,... 旨在探讨猪不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)与含SH3结构域的非受体型酪氨酸激酶(c-Src)之间的互作关系。采用PCR和酶切连接的方法,构建pGBKT7-hnRNPK、pGADT7-c-Src、pGADT7-ΔSH3、pGADT7-ΔSH2、pGADT7-ΔPTKc和pGADT7-SH3酵母双杂交载体,用PEG-LiAc法转化到酵母菌株AH109中,鉴定其自激活活性,并通过酵母双杂交方法从体内验证猪hnRNPK蛋白与c-Src不同缺失体之间的相互作用;采用DNA重组技术构建pET28a-hnRNPK与pGEX-6p1-c-Src、pGEX-6p1-ΔSH3、pGEX-6p1-ΔSH2、pGEX-6p1-ΔPTKc和pGEX-6p1-SH3蛋白表达载体,转化E.coli BL21经IPTG诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化融合蛋白,通过GST pull-down试验从体外验证猪hnRNPK蛋白与c-Src不同缺失体之间的相互作用。结果表明,成功构建了猪hnRNPK与c-Src不同缺失体的酵母双杂交重组质粒,转化酵母细胞发现各质粒均无自激活活性;在酵母中,与阴性对照相比,共转化pGBKT7-hnRNPK与pGADT7-c-Src或pGADT7-ΔPTKc或pGADT7-SH3的酵母菌落在SDTrp-Leu-His-Ade四缺培养基上生长良好,表明在酵母中hnRNPK与c-Src激酶N端的SH3结构域之间存在直接的相互作用;成功构建了猪hnRNPK与c-Src不同缺失体的融合表达质粒,经IPTG诱导表达及纯化获得了可溶性His-hnRNPK、GST-c-Src、GST-ΔSH3、GST-ΔSH2、GST-ΔPTKc和GST-SH3融合蛋白,GST pull-down试验表明,hnRNPK与c-Src N端存在较强的相互作用,与SH2和PTKc结构域相互作用则较弱。本研究揭示了猪hnRNPK蛋白可与c-Src蛋白的N-端的SH3结构域互作,有助于进一步研究它们的调节位点,为深入探讨hnRNPK与c-Src相互调控关系,进而阐明其生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 猪 hnRNPK C-SRC SH3结构域 酵母双杂交 gst-pull DOWN

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刚地弓形虫MIC2与醛缩酶作用位点的鉴定 被引量：1

15

作者 郑斌 尹志奎 +3 位作者 姚志军 张海珠 任红斌 詹希美 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期698-700,708,共4页

目的确定刚地弓形虫微线体蛋白2(MIC2)与醛缩酶的作用位点。方法利用定点突变技术,将MIC2羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(W767)突变为丙氨酸(A)。PCR扩增MIC2CW/A突变体基因片段;构建MIC2CW/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-M... 目的确定刚地弓形虫微线体蛋白2(MIC2)与醛缩酶的作用位点。方法利用定点突变技术,将MIC2羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(W767)突变为丙氨酸(A)。PCR扩增MIC2CW/A突变体基因片段;构建MIC2CW/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC2CW/A突变体蛋白。分别以该蛋白和GST-MIC2C蛋白(对照蛋白)作为探针蛋白与弓形虫速殖子裂解液进行GST pull-down实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果获得了MIC2CW/A突变体基因片段,制备了GST-MIC2CW/A突变体蛋白;GST-MIC2C蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带,而且可以被醛缩酶抗体识别,而GST-MIC2CW/A蛋白的pull-down产物中未见蛋白条带。结论将MIC2的W767突变为A后,MIC2失去与醛缩酶的作用,即MIC2与醛缩酶的作用位点为色氨酸(W)。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白2 醛缩酶 点突变 GST pull—down

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GST pull-down验证新城疫病毒基质蛋白与鸡importinβ1蛋白的相互作用 被引量：1

16

作者 胡焱 段志强 +4 位作者 嵇辛勤 赵佳福 邓珊珊 李世静 熊建民 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期126-133,共8页

旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因... 旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因,将其分别定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)构建重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importinβ1,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,SDSPAGE检测重组蛋白的表达情况,并对包涵体重组蛋白进行变性和复性处理。然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importinβ1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用。结果表明,成功构建了重组原核表达载体pGEX-6p-M和pET-32a-importinβ1,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得了正确表达。SDS-PAGE电泳检测显示GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在,而His-importinβ1重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importinβ1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importinβ1重组蛋白。利用GST pull-down技术证实了NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 新城疫病毒 基质蛋白 importinβ1蛋白 GSTpull-down 蛋白相互作用

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转录因子AP-2α与TES蛋白相互作用分析 被引量：1

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作者 冯波 曾虹燕 +1 位作者 钟英丽 张健 《深圳大学学报（理工版）》 EI CAS 北大核心 2008年第4期432-436,共5页

为研究转录因子AP-2α与TES蛋白的相互作用机制,分别构建AP-2α与GST的融合蛋白原核表达载体及TES与His的融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌E.coli BL 21中诱导表达,表达产物经纯化后用GST Pull-down及免疫印迹技术分析其相互作用关系.... 为研究转录因子AP-2α与TES蛋白的相互作用机制,分别构建AP-2α与GST的融合蛋白原核表达载体及TES与His的融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌E.coli BL 21中诱导表达,表达产物经纯化后用GST Pull-down及免疫印迹技术分析其相互作用关系.实验结果表明,AP-2α与TES之间存在相互作用是由于AP-2αC端能与TES C端的首个LIM结构域结合,酵母双杂交实验也证实了该结果;同时根据AP-2α只能与TES C端而不能与TES全长蛋白结合的实验事实提出了TES蛋白存在自身相互作用的可能,这种自身折叠封闭了位于TES C端首个LIM结构域上的AP-2α结合位点. 展开更多

关键词 GST Pull-down 酵母双杂交 AP-2Α TES LIM结构域

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DoksPTB结构域与EGFR特异性结合 被引量：1

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作者 阎志勇 吴爱群 +2 位作者 张勇 路长林 何成 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第3期509-511,共3页

目的:探讨Doks家族的PTB结构域在识别上游分子时的特异性。方法:利用裂解大量内源性表达表皮生长因子受体(EGFR)的COS-7传代细胞株获取EGFR,利用大肠杆菌表达GST融合蛋白GST1PTB、GST4PTB和GST5PTB,采用GST共沉淀技术检测Dok1、4和5的PT... 目的:探讨Doks家族的PTB结构域在识别上游分子时的特异性。方法:利用裂解大量内源性表达表皮生长因子受体(EGFR)的COS-7传代细胞株获取EGFR,利用大肠杆菌表达GST融合蛋白GST1PTB、GST4PTB和GST5PTB,采用GST共沉淀技术检测Dok1、4和5的PTB结构域能否与EGFR结合。结果:Dok1的PTB结构域,而非Dok4和Dok5的PTB结构域,能够特异性地与被激活的EGFR结合,不能与未激活的EGFR结合。结论:Doks家族的PTB结构域功能有差别,即PTB结构域在识别上游分子时具有特异性。 展开更多

关键词 DOKS PTB结构域 谷胱苷肽-S转移酶共沉淀 表皮生长因子受体

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番鸭细小病毒非结构蛋白NS1与水禽真核翻译延伸因子1A1的体外互作分析 被引量：1

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作者 于天飞 谢鹏宇 +4 位作者 孙婉姝 李静 尹海畅 黎明 于志丹 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2021年第4期232-238,共7页

旨在探讨番鸭细小病毒(MDPV)非结构蛋白NS1与水禽真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)之间的互作关系。根据GenBank中已发表的北京鸭和浙东白鹅eEF1A1基因序列,经大肠杆菌偏爱密码子优化,人工合成的质粒分别命名为pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1... 旨在探讨番鸭细小病毒(MDPV)非结构蛋白NS1与水禽真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)之间的互作关系。根据GenBank中已发表的北京鸭和浙东白鹅eEF1A1基因序列,经大肠杆菌偏爱密码子优化,人工合成的质粒分别命名为pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1;对含有MDPV YL08株NS1基因的重组质粒pUC57-NS1、pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收目的片段后分别插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a中,构建了重组质粒pGEX-DeEF1A1、pET-GeEF1A1、pET-NS1和pGEX-NS1;重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1的表达;采用HRP标记的GST单克隆抗体鉴定GST-DeEF1A1、HRP标记的His单克隆抗体鉴定TRX-GeEF1A1;采用HRP标记的His单克隆抗体鉴定TRX-NS1、HRP标记的GST单克隆抗体鉴定GST-NS1,采用MDPV感染番鸭血清鉴定TRX-NS1和GST-NS1的抗原性;采用GST pull-down试验验证GST-DeEF1A1与TRX-NS1、GST-NS1与TRX-GeEF1A1的互作。结果表明,获得的重组蛋白GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1的分子量分别为76.9,67.9,89.5,98.6 ku;GST-DeEF1A1和GST-NS1可与HRP标记的GST单克隆抗体特异性结合,TRX-GeEF1A1和TRX-NS1可与HRP标记的His单克隆抗体特异性结合;GST-NS1和TRX-NS1可与MDPV感染番鸭血清特异性结合,抗原性良好;GST pull-down试验中,GST-DeEF1A1可与TRX-NS1互作,GST-NS1不与TRX-GeEF1A1互作。本研究表明,MDPV NS1蛋白可以和北京鸭eEF1A1在体外相互作用而不能和浙东白鹅eEF1A1在体外相互作用,互作结果差异性可能与二者的102-106 aa,108 aa的氨基酸残基有关。 展开更多

关键词 番鸭细小病毒 非结构蛋白 水禽真核翻译延伸因子 GST pull-down 蛋白互作

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体外鉴定汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的相互作用 被引量：1

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作者 郭进军 李青岭 +2 位作者 周倩云 曾爱忠 黄爱龙 《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第5期136-139,共4页

根据汉坦病毒76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR扩增和基因重组获得G2蛋白膜外区81～140片段的GST融合表达质粒以及β3整合素膜外区23～133片段FLAG融合表达质粒。通过SDS-PAGE检测G... 根据汉坦病毒76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR扩增和基因重组获得G2蛋白膜外区81～140片段的GST融合表达质粒以及β3整合素膜外区23～133片段FLAG融合表达质粒。通过SDS-PAGE检测G2片段在BL21表达菌中诱导表达及纯化的效果,Western blot检测β3整合素片段在真核细胞中的表达。将在BL21裂解上清中表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81～140)纯化后与经过GST蛋白预处理的含有β3整合素片段的细胞裂解上清进行孵育,同时以未做任何转染的HEK293细胞裂解上清和无关蛋白GST-TLM作为阴性对照,通过GSTPull-down验证G2蛋白与β3整合素之间的相互作用。结果显示在Pull-down所获蛋白复合物中检测到β3整合素27～133位氨基酸片段产物的存在。结果表明G2蛋白与β3整合素之间可能存在有直接的相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒细胞膜受体提供了进一步证据。 展开更多

关键词 汉坦病毒受体 包膜糖蛋白G2 Β3整合素 GST Pull—down

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