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饲养层对维持新建ES细胞系的影响 被引量：40
1
作者 尚克刚 胡新立 +4 位作者 李子玉 王学庆 刘爱民 孟国良 童英 《北京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1994年第4期500-508,共9页
以ＳＴＯ细胞和鼠胚原代成纤维细胞（ＰＭＥＦ）为饲养层建立了１１个小鼠胚胎于细胞系（ＥＳ细胞系）。两种饲养层细胞都可以维持ＥＳ细胞的正常形态和体外分化能力，但ＳＴＯ细胞不能维持ＥＳ细胞的正常二倍体核型，ＰＭＥＦ的效果比... 以ＳＴＯ细胞和鼠胚原代成纤维细胞（ＰＭＥＦ）为饲养层建立了１１个小鼠胚胎于细胞系（ＥＳ细胞系）。两种饲养层细胞都可以维持ＥＳ细胞的正常形态和体外分化能力，但ＳＴＯ细胞不能维持ＥＳ细胞的正常二倍体核型，ＰＭＥＦ的效果比ＳＴＯ为佳，但也仅能短期内维持二倍体状态，１０代后染色体数目逐渐发生偏离。分离出１０个ＥＳ细胞克隆。讨论了两种饲养层的不同和影响核型发生偏离的若干可能的原因。 展开更多
关键词 小鼠 es细胞 饱养层
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小鼠胚胎干细胞(ES细胞)建系和维持过程中的问题及对策 被引量：18
2
作者 孟国良 汤富酬 +1 位作者 滕路 尚克刚 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期292-294,共3页
总结了十多年来我们从事ES细胞建系和培养工作的经验和教训 ,提出了研究工作中存在的问题以及解决这些问题的方法和对策 ,并对一些常规性的操作步骤进行了改进。同时 ,对某些尚不明确的问题进行了讨论 ,提出了我们的看法和建议。研究工... 总结了十多年来我们从事ES细胞建系和培养工作的经验和教训 ,提出了研究工作中存在的问题以及解决这些问题的方法和对策 ,并对一些常规性的操作步骤进行了改进。同时 ,对某些尚不明确的问题进行了讨论 ,提出了我们的看法和建议。研究工作表明 ,我们采取的对策和方法是可行。 展开更多
关键词 es细胞 内细胞团 多方向分化潜能 正常二倍体核型 建系 培养
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大鼠心肌条件培养基对形成小鼠ES细胞集落的影响 被引量：16
3
作者 韩嵘 柴桂萱 尚克刚 《北京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1997年第2期185-188,共4页
报道一种新的从小鼠囊胚中培养和分离出ＥＳ细胞集落的方法。取出生２～３周龄大鼠的心肌组织制备单层培养物，收集６代以内的条件培养基（ＲＨＣＭ）。以ＲＨＣＭ培养Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠的囊胚（无饲养层），对照组以小鼠胚胎原代成... 报道一种新的从小鼠囊胚中培养和分离出ＥＳ细胞集落的方法。取出生２～３周龄大鼠的心肌组织制备单层培养物，收集６代以内的条件培养基（ＲＨＣＭ）。以ＲＨＣＭ培养Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠的囊胚（无饲养层），对照组以小鼠胚胎原代成纤维细胞（ＭＥ）为饲养层，并补加ＬＩＦ因子。经过１９０个胚的实验证明，以ＲＨＣＭ为培养基培养小鼠囊胚时，胚胎贴壁率、ＩＣＭ增殖率和ＥＳ细胞集落的出现率与对照组没有显著性差异，分别为６７％、９３％和１３％。这种新的方法为简便而有效地建立与培养小鼠ＥＳ细胞系提供了有益的资料。 展开更多
关键词 大鼠 心肌 条件培养基 小鼠 胚胎 es细胞
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ES细胞体外定向分化为成熟肝细胞的实验研究 被引量：7
4
作者 胡安斌 蔡继业 +6 位作者 郑启昌 洪岸 何晓青 戴云 单于 潘运龙 李凌松 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第6期518-522,共5页
探讨了肝细胞在胚胎干细胞 (EScell)体外诱导分化系统中成熟分化的条件、机制及其鉴定方法 .利用TGF ,bFGF、HGF等细胞生长因子进行BALB/c小鼠ES细胞向肝细胞方向的定向诱导 .利用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)、免疫细胞化学 (ICC)和放... 探讨了肝细胞在胚胎干细胞 (EScell)体外诱导分化系统中成熟分化的条件、机制及其鉴定方法 .利用TGF ,bFGF、HGF等细胞生长因子进行BALB/c小鼠ES细胞向肝细胞方向的定向诱导 .利用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)、免疫细胞化学 (ICC)和放射免疫法 (RIA)动态检测肝细胞特异性基因和蛋白AFP ,ALB ,G6P ,TAT ,CK8,CK18等在培养体系中的表达 ,并测定肝细胞的尿素合成功能 ,最后测定肝细胞分化率 .结果 ,肝细胞特异基因AFP ,ALB ,G6P和TAT最早分别于第 3、 9、 11、 13天表达 ,肝细胞特异蛋白AFP ,CK8,CK18和ALB最早分别于第 7、 9、 9和 11天开始表达 .第 12天开始检测到尿素出现 ,浓度为 8 3μmol/L ,并随培养时间延长而浓度逐渐增加 .最后 ,测得生长因子诱导组肝细胞的分化率为 32 % ,对照组肝细胞分化率为 8% .说明肝细胞可以在ES细胞体外诱导分化系统中出现并成熟分化 ,bFGF、HGF、OSM等可以明显提高细胞分化率和成熟度 ,有望成为解决肝功能替代疗法中细胞来源问题的新希望 . 展开更多
关键词 胚胎干细胞 肝细胞 定向分化
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6个小鼠ES细胞系的建立和鉴定 被引量：41
5
作者 胡新立 尚克刚 《北京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1996年第2期248-253,共6页
报道从小鼠129/ter品系中建成6个胚胎干细胞系。经过核型检查,体内、体外分化等鉴定后发现,6个细胞系中有2个细胞系是正常二倍体,其中ES细胞系MESPU 13为XY型,其核骨架蛋白质成分相当于3～4d(天)的鼠胚细胞的核骨架成分。可长期维持二... 报道从小鼠129/ter品系中建成6个胚胎干细胞系。经过核型检查,体内、体外分化等鉴定后发现,6个细胞系中有2个细胞系是正常二倍体,其中ES细胞系MESPU 13为XY型,其核骨架蛋白质成分相当于3～4d(天)的鼠胚细胞的核骨架成分。可长期维持二倍体未分化状态,并具有高效的嵌合能力。核型不正常的细胞系所形成的畸胎瘤生长较快。但细胞的分化程度与核型正常的ES细胞有所不同。对影响建系结果的各种因素进行了讨论。 展开更多
关键词 细胞分化 胚胎干细胞系 细胞发育 体外分化
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兔ES样细胞系的建立及其特性分析 被引量：5
6
作者 童英 刘爱民 +1 位作者 尚克刚 刘林 《北京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1997年第4期500-507,共8页
报道从２３７枚家兔胚胎中建成７个可连续传代的ＥＳ样细胞系。建系条件为，使用小鼠原始胚胎成纤维细胞（ＭＥ）作饲养层，以含１０％胎牛血清和１０％兔血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２为培养基，添加白血病抑制因子（ＬＩＦ）或上皮生长因子... 报道从２３７枚家兔胚胎中建成７个可连续传代的ＥＳ样细胞系。建系条件为，使用小鼠原始胚胎成纤维细胞（ＭＥ）作饲养层，以含１０％胎牛血清和１０％兔血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２为培养基，添加白血病抑制因子（ＬＩＦ）或上皮生长因子（ＥＧＦ），胚龄为９０，９６ｈ。该细胞系的细胞，在许多方面类似于小鼠ＥＳ细胞：具干细胞的形态特征，呈集落型生长，可连续传代并保持其形态特征，具一定的自发分化和诱导分化的能力，悬浮培养可形成简单类胚，但皮下接种同种乳兔未获肿瘤。用所建的兔ＥＳ样细胞进行卵母细胞核移植时。 展开更多
关键词 家兔 es细胞 细胞分化 核移植 建系条件
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自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报 被引量：7
7
作者 华进联 窦忠英 +2 位作者 李松 雷安民 杨春荣 《西北农业大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第1期22-24,29,共4页
自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传... 自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传至 10代 ) ,部分细胞集落呈典型鸟巢状结构 ,AP染色呈阳性 ,体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后 7.5～ 8.5 d和14.5～ 15 .5 d的小鼠胎儿 ,原代观察到类 ES细胞集落 ,继代培养未观察到类 ES细胞集落 ,16 .5～ 18.5 d小鼠胎儿原代培养未观察到 展开更多
关键词 原始生殖细胞 胚胎生殖细胞 es细胞 小鼠 哺乳动物
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不同ES细胞系体外定量神经分化的比较 被引量：3
8
作者 汤富酬 韩嵘 +1 位作者 薛友纺 尚克刚 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期439-441,共3页
利用视黄酸 (RA)诱导小鼠胚胎干细胞通过悬浮类胚培养法体外定量分化为神经样细胞。结果显示能够进行种系嵌合的MESPU2 2细胞系与不能进行种系嵌合的MESPU13细胞系的体外神经分化比例在统计学上没有明显差异。此结果对于人的胚胎干细胞... 利用视黄酸 (RA)诱导小鼠胚胎干细胞通过悬浮类胚培养法体外定量分化为神经样细胞。结果显示能够进行种系嵌合的MESPU2 2细胞系与不能进行种系嵌合的MESPU13细胞系的体外神经分化比例在统计学上没有明显差异。此结果对于人的胚胎干细胞全能性的鉴定与检测有重要启示。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 体外神经分化 RA诱导 定量分化
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由体外受精囊胚获得ICR小鼠ES细胞 被引量：3
9
作者 时伟红 安志兴 +3 位作者 董婉维 秦英 王碌增 王太一 《动物医学进展》 CSCD 2002年第4期97-99,共3页
收集鼠卵母细胞和精子 ,采用体外受精技术 ,获得早期胚胎。体外培养胚胎至囊胚 ,分离内细胞团 ,获得 ICR小鼠的 ES细胞。结果不但获得了来自体外受精囊胚的 ICR小鼠 ES细胞 ,而且表明用体外受精方法获得的小鼠早期胚胎的数量明显大于常... 收集鼠卵母细胞和精子 ,采用体外受精技术 ,获得早期胚胎。体外培养胚胎至囊胚 ,分离内细胞团 ,获得 ICR小鼠的 ES细胞。结果不但获得了来自体外受精囊胚的 ICR小鼠 ES细胞 ,而且表明用体外受精方法获得的小鼠早期胚胎的数量明显大于常规方法 ,且比较稳定。ICR小鼠 ES细胞的获得 ,为研究小鼠的 ES细胞分化提供了条件。 展开更多
关键词 体外受精囊胚 es细胞 小鼠 胚胎干细胞
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用大鼠心肌条件培养基建立来源于C57BL/6J小鼠的ES细胞系 被引量：8
10
作者 童英 邹冀中 尚克刚 《北京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2000年第4期472-476,共5页
报道一种新的建立C57BL/ 6J小鼠ES细胞系的方法。采用大鼠心肌条件培养基 ,在不使用饲养层细胞和白血病抑制因子 (LIF)的情况下 ,从C57BL/ 6J品系小鼠中建成 1个ES细胞系即MESPU 4 1,成系率为 1 0 %。MESPU 4 1细胞为XX型 ,核型正常率高... 报道一种新的建立C57BL/ 6J小鼠ES细胞系的方法。采用大鼠心肌条件培养基 ,在不使用饲养层细胞和白血病抑制因子 (LIF)的情况下 ,从C57BL/ 6J品系小鼠中建成 1个ES细胞系即MESPU 4 1,成系率为 1 0 %。MESPU 4 1细胞为XX型 ,核型正常率高达 89% ,表现出XX型ES细胞系少有的稳定性。进行体内分化实验时MESPU 4 1细胞能发生广泛分化形成畸胎瘤。嵌合体制作实验证实MESPU 4 1细胞具有嵌合能力 ,能参与胚胎的发育。采用RT PCR方法 ,检测出大鼠心肌细胞有LIFmRNA的表达 ,这可能与其条件培养基保持ES细胞未分化状态并使X染色体稳定有关。同时 ,还对大鼠心肌细胞进行了永生化的尝试 ,共得到了 4个永生化克隆 ,这将进一步简化ES细胞建系和培养工作 ,为进一步研究ES细胞在体外培养过程中的稳定性开创了新的起点。 展开更多
关键词 es细胞系 小鼠品系 大鼠心肌条件培养基
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ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化 被引量：4
11
作者 刘爱军 黄锦桃 李海标 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期11-14,共4页
【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物,探讨其在皮下的分化潜能。【方法】Hoechst33342标记E14-ES细胞,经羊膜诱导4d后,形成表皮干细胞克隆,并以其作为种子细胞,取129胎鼠成纤维细胞与复合凝胶-明胶海绵复合,形成皮... 【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物,探讨其在皮下的分化潜能。【方法】Hoechst33342标记E14-ES细胞,经羊膜诱导4d后,形成表皮干细胞克隆,并以其作为种子细胞,取129胎鼠成纤维细胞与复合凝胶-明胶海绵复合,形成皮肤类似物,埋植于129小鼠皮下组织。术后2周、4周、6周、8周取材,做HE染色观察,β1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫组化荧光双标和免疫组化观察。【结果】术后2周和4周,植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构,6周和8周后,可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,免疫双标结果显示,植入2周和4周,带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈β1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18阳性,6周和8周后,HE染色中汗腺样结构呈CEA、CK18阳性。【结论】ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物,在同种小鼠皮下有分为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构的潜能。 展开更多
关键词 es细胞 表皮干细胞 皮肤附属结构 定向分化 羊膜
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DNA指纹图在小鼠ES细胞嵌合体鉴定中的应用 被引量：2
12
作者 汤富酬 薛友纺 +1 位作者 李美琴 尚克刚 《北京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期789-794,共6页
尝试应用多位点DNA指纹技术 ,检测经过胚胎干细胞 (ES细胞 )途径所获得的嵌合体小鼠中ES细胞在各种脏器中的嵌合情况、检测ES细胞在嵌合体小鼠中是否实现种系传递。结果表明 :采用新型的人工合成的寡核苷酸多聚体探针 (JL 0 2探针 )的... 尝试应用多位点DNA指纹技术 ,检测经过胚胎干细胞 (ES细胞 )途径所获得的嵌合体小鼠中ES细胞在各种脏器中的嵌合情况、检测ES细胞在嵌合体小鼠中是否实现种系传递。结果表明 :采用新型的人工合成的寡核苷酸多聚体探针 (JL 0 2探针 )的多位点DNA指纹图谱 ,具有足够的多态性和很好的稳定性。适用于鉴定ES细胞在嵌合体小鼠各种组织器官中的嵌合情况 ,也适用于鉴定ES细胞是否具有种系嵌合能力 ,尤其适用于在嵌合体研究中 ,最适宜的品种组合具有相同的毛色或相同的酶型。 展开更多
关键词 小鼠 DNA指纹图 胚胎干细胞 嵌合体 RFLP分析
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小鼠ES细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞 被引量：1
13
作者 韩嵘 汤富酬 尚克刚 《北京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期192-196,共5页
通过悬浮培养和 0 5 μmol LRA诱导 ,建立了定向诱导ES细胞向神经元样细胞分化的体系。在该体系中 ,神经元样细胞于类胚贴壁后 4 8h之内出现 ,4～ 6d时达到最多 ,8～ 10d后减少。由ES细胞分化而来的神经元样细胞具有典型的形态特征 ,... 通过悬浮培养和 0 5 μmol LRA诱导 ,建立了定向诱导ES细胞向神经元样细胞分化的体系。在该体系中 ,神经元样细胞于类胚贴壁后 4 8h之内出现 ,4～ 6d时达到最多 ,8～ 10d后减少。由ES细胞分化而来的神经元样细胞具有典型的形态特征 ,并且可以与NF抗体发生特异反应。 展开更多
关键词 es细胞 体外分化 神经元样细胞 小鼠 细胞分化 悬浮培养 视黄酸诱导
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FGFR2条件性敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定 被引量：1
14
作者 王建民 宋瑞华 +6 位作者 杜晓兰 尹良军 陈波 孙晶 苟元彬 赵玲 陈林 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期480-484,共5页
目的　构建成纤维细胞生长因子2型受体(Fibroblastgrowthfactorreceptor 2,FGFR2)条件性敲除载体,并对中 靶ES细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR2条件性敲除小鼠模型,研究FGFR2在小鼠骨骼、肺脏等组织、器官发育过程 中的作用打下... 目的　构建成纤维细胞生长因子2型受体(Fibroblastgrowthfactorreceptor 2,FGFR2)条件性敲除载体,并对中 靶ES细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR2条件性敲除小鼠模型,研究FGFR2在小鼠骨骼、肺脏等组织、器官发育过程 中的作用打下基础。方法　在分析小鼠FGFR2基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了条件性敲除小鼠FGFR2外 显子7、8的基因打靶载体,采用电穿孔法在ES细胞中进行了打靶重组,G418与Ganciclovir被用于对电转的ES细胞进行正 负筛选,最后对ES细胞克隆进行了Southern与PCR鉴定。结果　将所构建的条件性打靶载体通过电穿孔转染入表达重组 酶(Cre)的AmI细菌,经PCR、酶切和测序鉴定,Cre酶能正确将条件性打靶载体的外显子7、8和选择性标记Neo基因经重 组剔除,电转了基因敲除载体的ES细胞经正负筛选后共挑取克隆83个;经5′端探针Southern杂交鉴定,发现4株阳性克 隆;该4株克隆再经3′端探针Southern杂交鉴定,发现2株阳性克隆;最后经Southern和PCR检测发现1株ES细胞克隆仍 保留外显子7、8两侧的loxP序列。结论　FGFR2条件性基因敲除ES细胞已成功构建。 展开更多
关键词 成纤维细胞生长因子2型受体 条件性敲除 同源重组 Cre蛋白 es细胞
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胸腺肽类药物对体外诱导ES细胞分化为T细胞的作用 被引量：1
15
作者 彭延文 徐霖 +3 位作者 张秀明 张嘉晴 李树浓 项鹏 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期627-630,共4页
【目的】研究目前临床常用的增强细胞免疫功能的胸腺肽,胸腺5肽和胸腺素α-1在小鼠胚胎干细胞向T淋巴细胞分化过程中的作用。【方法】借助小鼠胚胎干细胞(ESC)体外自然分化形成的类胚体(EB)中含有三胚层细胞的独特细胞环境,加入多种细... 【目的】研究目前临床常用的增强细胞免疫功能的胸腺肽,胸腺5肽和胸腺素α-1在小鼠胚胎干细胞向T淋巴细胞分化过程中的作用。【方法】借助小鼠胚胎干细胞(ESC)体外自然分化形成的类胚体(EB)中含有三胚层细胞的独特细胞环境,加入多种细胞因子和胸腺多肽,体外诱导小鼠ESC向T淋巴细胞分化。利用流式细胞仪检测在三种不同胸腺多肽的诱导下,不同时间点的小鼠ESC来源的细胞表面CD3分子的表达水平。并在相应时间点通过RT-PCR检测与T淋巴细胞发育密切相关的Notch信号分子的转录水平。【结果】在加入胸腺肽和胸腺素α1诱导的实验组,均有细胞表达CD3分子,CD3+细胞的百分比随诱导时间的增加而增多;而加入胸腺五肽的实验组无CD3+细胞出现。加入胸腺素α1和胸腺肽的实验组,有Notch1及其配体delta-like-1和delta-like-4的转录;而加入胸腺五肽的实验组的细胞无Notch1及其配体转录。【结论】胸腺素α1或胸腺肽可能通过影响Notch1信号途径支持ES细胞向T细胞分化,而胸腺五肽无此作用。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 T淋巴细胞 胸腺5肽 胸腺素Α1 胸腺肽
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饲养层密度对兔类ES细胞分离培养的影响 被引量：1
16
作者 李小佳 张君涛 +4 位作者 徐秋勤 王鸽 曹书郡 王新庄 张志平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1051-1056,共6页
探讨饲养层细胞接种密度对兔类ES细胞分离培养影响,筛选适合兔类ES细胞分离培养最适饲养层密度。将兔囊胚分别接种到密度为10×103、20×103和40×103个·cm-2的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonicfibroblast cell,MEF... 探讨饲养层细胞接种密度对兔类ES细胞分离培养影响,筛选适合兔类ES细胞分离培养最适饲养层密度。将兔囊胚分别接种到密度为10×103、20×103和40×103个·cm-2的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonicfibroblast cell,MEF)饲养层上,观察兔类ES细胞贴壁和克隆生长情况,并对所得兔类ES细胞进行碱性磷酸酶和Oct-4检测。结果表明,接种于密度为20×103个·cm-2饲养层上的囊胚贴壁率(82.5%)、内细胞团(Inner cellmass,ICM)形成率(67.5%)高于接种于密度为40×103个·cm-2的饲养层上囊胚贴壁率(80.0%)、内细胞团(Innercell mass,ICM)形成率(65.7%),差异不显著(P>0.05);显著高于(P<0.05)接种于密度为10×103个·cm-2饲养层上的囊胚贴壁率(55.6%)、ICM形成率(44.4%)。密度为20×103个·cm-2饲养层上的兔类ES细胞F1、F2代细胞克隆率均显著高于其他两组(P<0.05),最高已传至20代;获得的兔类ES细胞经碱性磷酸酶染色及表面抗原Oct-4表达检测均呈阳性。密度为20×103个·cm-2的MEF饲养层可更好支持兔类ES细胞体外培养。 展开更多
关键词 成纤维细胞 密度 兔类es细胞
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小鼠卵母细胞的孤雌激活与ES细胞样集落分离 被引量：1
17
作者 曹鸿国 刘俊平 张涌 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2005年第3期1-4,10,共5页
　对小鼠卵母细胞进行孤雌激活用于单性生殖研究。取成年昆明白小鼠进行超数排卵,乙醇激活,同小鼠输卵管上皮细胞共培养并添加mM16培养基培养至早期囊胚阶段,移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,换成ES细胞培养液继续培养,分离消化ICM,重... 　对小鼠卵母细胞进行孤雌激活用于单性生殖研究。取成年昆明白小鼠进行超数排卵,乙醇激活,同小鼠输卵管上皮细胞共培养并添加mM16培养基培养至早期囊胚阶段,移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,换成ES细胞培养液继续培养,分离消化ICM,重新接种,对分离出的ES样细胞集落进行分离培养鉴定。结果显示,小鼠卵母细胞激活率为96.99%,2-细胞发育率为93.17%,桑椹胚发育率为80.33%,囊胚发育率为73.22%。小鼠孤雌激活囊胚中分离的ES样细胞集落具有一系列ES细胞所特有的特征,如呈现出岛屿状形态,碱性磷酸酶染色为阳性,体外能够自发分化成上皮样或单个散在分布的细胞等。试验证明,小鼠孤雌胚中可以分离出ES细胞样集落。 展开更多
关键词 小鼠 卵母细胞 孤雌激活 es细胞样集落
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分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因素 被引量：1
18
作者 周欣 王太一 +2 位作者 时伟红 张梅英 董婉维 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2002年第1期5-9,共5页
目的　研究不同培养条件分离和克隆小鼠ES细胞集落的效率。方法　以PMEF饲养层、NIH3T3细胞饲养层或培养液中加入LIF为培养条件 ,分离和克隆昆明小鼠ES细胞集落 ,比较其效率。结果　饲养层的培养条件明显优于培养液中加入LIF的培养条件 ... 目的　研究不同培养条件分离和克隆小鼠ES细胞集落的效率。方法　以PMEF饲养层、NIH3T3细胞饲养层或培养液中加入LIF为培养条件 ,分离和克隆昆明小鼠ES细胞集落 ,比较其效率。结果　饲养层的培养条件明显优于培养液中加入LIF的培养条件 ;有饲养层的培养条件下 ,桑椹胚的ES细胞集落出现率显著低于囊胚 ;两种饲养层培养囊胚 ,其ES细胞集落的出现率差异无显著性。结论　以PMEF或NIH3T3细胞作饲养层 ,培养昆明小鼠的囊胚 ,适时离散ICM ,是比较理想的分离ES细胞集落的方法。 展开更多
关键词 昆明小鼠 es细胞 集落形成 培养条件 分离 克隆
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敲除β珠蛋白β^(maj)及β^(min)基因的C129小鼠ES-D3细胞系建立 被引量：1
19
作者 韦相才 马芸 +3 位作者 邓新燕 卢丽 黄冰 陈系古 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期2257-2263,共7页
目的通过构建C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因打靶载体,建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因ES-D3细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠提供稳定的胚胎干细胞系。方法根据C129系小鼠β珠蛋白基... 目的通过构建C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因打靶载体,建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因ES-D3细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠提供稳定的胚胎干细胞系。方法根据C129系小鼠β珠蛋白基因分子结构基础,用基因克隆方法在βmaj和及βmin两个同源序列两侧分别将1.7kb和7.0kb的片段插入pNTK质粒中,构建置换型打靶载体β-pNTK,用新霉素抗性基因(Neo)和单疱病毒腺苷激酶(TK)抗性基因作为正负筛选标记。用SalⅠ酶切将打靶载体β-pNTK线性化,采用电穿孔法在ES-D3细胞水平进行打靶,通过G418和GAN进行正负筛选,获得生长良好的胚胎干细胞克隆;用PCR和Southern印迹杂交方法鉴定阳性克隆基因组DNA整合结果,用碱性磷酸酶实验、体外胚体形成实验以及畸胎瘤成瘤实验鉴定细胞生物学特性。结果构建了C129系小鼠置换型打靶载体,经Neo-Major鉴定引物PCR扩增、BamHⅠ及EcoRⅠ酶切及部分测序分析,所插入方向正确,结构合理,达到所预期的目的;获得了8个阳性克隆珠,阳性克隆细胞株经PCR和South-ern印迹杂交方法鉴定外源基因整合到ES细胞基因组DNA中;经胚胎干细胞特性鉴定所获细胞具有良好的未分化特性和多能性。结论构建了C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因置换型打靶载体;该载体在胚胎干细胞水平进行基因打靶后,获得了稳定的敲除β珠蛋白内源性珠蛋白βmaj及βmin基因的胚胎干细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠奠定了基础。 展开更多
关键词 基因敲除 基因 β^maj及β^min 珠蛋白 es—D3细胞系 干细胞
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新生牛雄性生殖细胞源类ES的培养及检测
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作者 董武子 沈文正 +1 位作者 华进联 窦忠英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期144-148,共5页
采用贴壁速率差法分离纯化的新生牛雄性生殖干细胞（Male germ stem cell，mGSCs）和支持细胞（Calf sertoli cell，CSCs）；CSCs饲养层细胞一般维持时间不超过8d；新生牛雄性生殖干细胞在CSCs饲养层上1代培养至5～6d可形成类ES细胞集... 采用贴壁速率差法分离纯化的新生牛雄性生殖干细胞（Male germ stem cell，mGSCs）和支持细胞（Calf sertoli cell，CSCs）；CSCs饲养层细胞一般维持时间不超过8d；新生牛雄性生殖干细胞在CSCs饲养层上1代培养至5～6d可形成类ES细胞集落，采用机械离散集落传代法有利于集落形成或存在，传代培养至少在前2代细胞集落存在；部分典型细胞集落的中心细胞AKP强阳性，周边细胞AKP弱阳性或阴性；免疫组化检测显示，细胞集落SSEA1强阳性、SSEA3弱阳性和Oct-4呈现阳性染色。表明mGSCs具有ES细胞的某些细胞特性。 展开更多
关键词 新生牛雄性生殖干细胞 新生牛支持细胞 类es细胞
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