CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达 被引量：5

1

作者 郭小荑 邓宇斌 +1 位作者 陆才生 李树浓 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期585-589,T002,共6页

目的 :构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体 ,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法 :自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物 ,以质粒PCDNA3 0 /CTLA4Ig为模板 ,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基... 目的 :构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体 ,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法 :自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物 ,以质粒PCDNA3 0 /CTLA4Ig为模板 ,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基因全部序列。片段回收以后经BglⅡ及HindⅢ双酶切 ,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV的启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间 ,获得重组质粒pAdTrack -CTLA4Ig。通过BglⅡ /HindⅢ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后 ,将正确重组体pAdTrack -CTLA4Ig与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1共转化BJ5 183细菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆 ,提取质粒用脂质体介导转染 2 93细胞 ,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果 :成功构建了含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒 ,病毒滴度为 1 6 5× 10 12 PFU/L。结论 :该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达、研究CTLA4Ig的生物学活性及移植排斥、自身免疫病的基因治疗提供了一定的基础。 展开更多

关键词 ctla4ig重组腺病毒载体 构建 体外表达 T淋巴细胞 细胞塞件 免疫球蛋白 基因治疗 移植排斥

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CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达

2

作者 马会慧 陆才生 +4 位作者 陈雪娟 高志良 李刚 杨绍基 姚集鲁 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第B03期157-159,共3页

【目的】构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达。【方法】分离人外周血单个核细胞，提取细胞总RIgA，经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区（含绞链区-CH2-CH3）基因片段。将PCR... 【目的】构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达。【方法】分离人外周血单个核细胞，提取细胞总RIgA，经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区（含绞链区-CH2-CH3）基因片段。将PCR产物克隆入pCDNA3，阳性重组子以双酶切和测序鉴定。将目的基因CTLA4-Ig亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183，经细菌内同源重组构建重组腺病毒载体。采用脂质体法转染293细胞包装产生重组腺病毒，进一步感染HepG2细胞，采用RT-PCR及ELISA测定CTLA4Ig表达情况。【结果】构建了表达人CTLA4Ig基因的重组腺病毒，病毒滴度可达6×10^9pfu／mL，并能在HepG2和骨髓间充质干细胞中表达CTLA4Ig。【结论】成功构建表达CTLA4Ig的重组腺病毒载体，为进一步研究肝细胞移植排异及自身免疫性疾病的免疫调节治疗提供有力的手段与工具。 展开更多

关键词 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白 腺病毒 载体 基因表达

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人CTLA4Ig腺病毒载体的构建及其生物学功能研究 被引量：3

3

作者 张庆殷 金永柱 +1 位作者 谢蜀生 张海滨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期45-48,共4页

目的:通过同源重组构建CTLA4Ig腺病毒载体,研究其生物学活性,并用于基因治疗诱导心脏移植耐受。方法:通过基因重组技术,将CTLA4Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13中。然后将该质粒与腺病毒辅助质粒同源重组,经过293细胞包装,构建CTLA4Ig... 目的:通过同源重组构建CTLA4Ig腺病毒载体,研究其生物学活性,并用于基因治疗诱导心脏移植耐受。方法:通过基因重组技术,将CTLA4Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13中。然后将该质粒与腺病毒辅助质粒同源重组,经过293细胞包装,构建CTLA4Ig腺病毒载体。用RT-PcR、SDS-PAGE及Western blot等技术,检测包装的病毒感染293细胞后CTLA4Ig蛋白的表达及分泌,通过体外实验,观察病毒感染的293细胞上清对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。通过大鼠体内实验,检测用CTLA4Ig腺病毒载体基因治疗后,CTLA4Ig在体内的表达。结果:CTLA4Ig腺病毒载体构建成功。体外实验证实,CTLA4Ig腺病毒感染的293细胞上清液,能够抑制异基因脾细胞的单向MLR。体内实验表明,经过静脉途径给予受体大鼠CTLA4Ig腺病毒载体,能够诱导移植耐受,延长心脏移植物的存活。结论:构建的CTLA4Ig腺病毒载体,体外感染293细胞能够分泌CTLA4Ig蛋白。该蛋白可抑制T细胞的活化,CTLA4Ig腺病毒载体可用于体内基因治疗诱导移植耐受。 展开更多

关键词 人ctla4ig 腺病毒载体 构建 生物学功能 基因治疗 移植耐受

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人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定 被引量：3

4

作者 贺伟峰 吴军 +5 位作者 易绍萱 罗高兴 陈希炜 郑峻松 马兵 雷晓 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第7期782-785,共4页

目的　构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8... 目的　构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果　成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。 展开更多

关键词 逆转录病毒载体 ctla4ig基因 EGFP基因 IRES2 逆转录病毒 双基因共表达 基因重组 脂质体法 增强型绿色荧光蛋白

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腺病毒载体介导CTLA4Ig基因治疗小鼠变应性鼻炎 被引量：1

5

作者 朱瑾 吴军 +5 位作者 易绍萱 罗高兴 陈希炜 郑峻松 贺伟峰 张宁 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期413-415,共3页

目的　检测CTLA4Ig 重组腺病毒载体 (Ad CTLA4Ig)在变应性鼻炎治疗中的作用。方法　采用卵清蛋白 (OVA)致敏和激发诱导小鼠变应性鼻炎。实验组在OVA激发前 3 0min予以Ad CTLA4Ig腹腔注射。未转CTLA4IgcDNA的腺病毒载体 (Adv)作对照。比... 目的　检测CTLA4Ig 重组腺病毒载体 (Ad CTLA4Ig)在变应性鼻炎治疗中的作用。方法　采用卵清蛋白 (OVA)致敏和激发诱导小鼠变应性鼻炎。实验组在OVA激发前 3 0min予以Ad CTLA4Ig腹腔注射。未转CTLA4IgcDNA的腺病毒载体 (Adv)作对照。比较各组动物鼻部症状和鼻粘膜形态学改变 ,并采用ELISA法测定血清中OVA 特异性IgE水平。结果　CTLA4Ig 重组腺病毒实验组小鼠鼻部症状和鼻粘膜病理改变不明显 ,并且血清中OVA 特异性IgE水平明显低于对照组 (P <0 0 5 )。结论　Ad CTLA4Ig可防治小鼠变应性鼻炎的发生 ,提示CTLA4Ig 重组腺病毒载体有可能运用于临床变应性鼻炎的治疗。 展开更多

关键词 ctla4ig-重组腺病毒载体 变应性鼻炎 igE 基因治疗 小鼠

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腺病毒介导CTLA4Ig和Iκ-Bα双基因在ECV304细胞中的表达 被引量：1

6

作者 李宁 袁育康 吴军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期90-93,共4页

　目的: 通过制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4融合蛋白(CTLA4Ig)和核因子的抑制蛋白 (Iκ- Bα)双基因共表达腺病毒载体, 检测重组腺病毒在ECV304细胞中的表达。方法: 将Iκ- Bα和CTLA4Ig通过内部核糖体进入部位(IRES2 )连接, 并以基... 　目的: 通过制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4融合蛋白(CTLA4Ig)和核因子的抑制蛋白 (Iκ- Bα)双基因共表达腺病毒载体, 检测重组腺病毒在ECV304细胞中的表达。方法: 将Iκ- Bα和CTLA4Ig通过内部核糖体进入部位(IRES2 )连接, 并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体, 构建重组腺病毒, 检测Iκ- Bα和CTLA4Ig在ECV304细胞中的蛋白表达情况及其对炎症介质TNF的调控效应。结果: ( 1 )构建pAdTrack -CMV- CTLA4Ig IRES2- Iκ-Bα, 与pAdEasy在BJ5183重组后转染 293, 获得重组腺病毒。(2)PCR鉴定重组腺病毒正确。(3)用重组腺病毒感染体外培养的ECV304后,该腺病毒可表达Iκ- Bα蛋白及CTLA4Ig蛋白, 且可以下调LPS攻击后TNF α的产生。结论: 构建人CTLA4Ig, Iκ- Bα双基因共表达腺病毒载体, 可以有效的抑制炎症因子的表达,为进一步的CTLA4Ig免疫耐受基因治疗中的抑制, 因NF- κB的过度激活而产生的炎性反应提供研究基础。 展开更多

关键词 ctla4ig Iκ-Bα 腺病毒 重组

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腺病毒介导CTLA4Ig转染正常人肝细胞株的研究 被引量：3

7

作者 刘潇聪 陈耀凯 +5 位作者 李俊刚 刘国栋 谭朝霞 郭艳 程玲 王宇明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期810-813,共4页

目的研究腺病毒介导CTLA4Ig基因转染正常人肝细胞株L02后,CTLA4Ig在L02细胞内的表达、生物学活性以及对L02细胞生物学特性的影响。方法重组腺病毒载体Ad-CTLA4Ig-EGFP转染体外培养的正常人肝细胞株L02,观察绿色荧光在细胞内的表达情况... 目的研究腺病毒介导CTLA4Ig基因转染正常人肝细胞株L02后,CTLA4Ig在L02细胞内的表达、生物学活性以及对L02细胞生物学特性的影响。方法重组腺病毒载体Ad-CTLA4Ig-EGFP转染体外培养的正常人肝细胞株L02,观察绿色荧光在细胞内的表达情况。以免疫细胞化学、Western blot、ELISA等方法检测CTLA4Ig在L02细胞内、外的表达情况;通过绘制细胞生长曲线、检测尿素合成能力观察转染前后L02细胞的生物学特性;转染后的L02细胞与大鼠脾脏细胞共培养,通过检测脾脏细胞增殖情况评价表达CTLA4Ig的L02细胞在体外的免疫耐受活性;收集共培养体系中的大鼠脾脏细胞,再分别与正常L02细胞、HeLa细胞共培养,检测脾细胞增殖情况以评价转染后L02细胞免疫耐受的特异性。结果转染后的L02细胞可在细胞质内大量表达CTLA4Ig蛋白,并分泌至培养上清中;转染后L02细胞生长速度无明显改变(P>0.05),单个细胞尿素合成能明显升高[(0.56±0.01)pmol/d,P<0.01];转染后的L02细胞在体外可显著抑制大鼠脾脏细胞的增殖(抑制率约为36.8%,P<0.05),被抑制后的大鼠脾脏细胞在正常L02细胞刺激下增殖较低,但在HeLa细胞刺激下则可显著增殖(P<0.01)。结论Ad-CTLA4Ig-EGFP转染后的L02细胞可表达具有生物学活性的CTLA4Ig,并在体外表现出显著的具有抗原特异性的免疫抑制活性。 展开更多

关键词 ctla4ig 腺病毒载体 L02细胞

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腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰骨髓间质干细胞体外抑制免疫应答的研究 被引量：4

8

作者 邓宇斌 郭小荑 +1 位作者 梁海翔 原清涛 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期300-305,共6页

目的:通过腺病毒载体介导CTLA4Ig在大鼠骨髓间质干细胞(MSC)中的表达,探讨MSC作为基因转移靶细胞的可行性和转染效率,研究其在体外对免疫应答的抑制作用。方法:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体pad-CTLA4Ig,按照不同的感染倍率(MOI... 目的:通过腺病毒载体介导CTLA4Ig在大鼠骨髓间质干细胞(MSC)中的表达,探讨MSC作为基因转移靶细胞的可行性和转染效率,研究其在体外对免疫应答的抑制作用。方法:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体pad-CTLA4Ig,按照不同的感染倍率(MOI)转染大鼠MSC,用荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,流式细胞术、Western blotting等方法检测目的蛋白CTLA4Ig在MSC中的表达。将转基因MSC加入混合淋巴细胞反应(MLR)体系,观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应。结果:重组腺病毒载体pAd-CTLA4Ig对MSC的最大转染率为80.7％±4.7％,转基因MSC可检测到目的蛋白的表达。基因修饰的MSC能有效抑制MLR体系中淋巴细胞的增殖,4d达到最大抑制效率51.46％;再次MLR证实这种抑制作用是供者特异性的。结论:MSC是一种较理想的基因转移靶细胞,其表达的转基因产物CTLA4Ig可在体外特异性地抑制免疫应答。 展开更多

关键词 基因 ctla4ig 腺病毒载体 间质干细胞 免疫应答

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CXCR4腺病毒表达载体的构建及其在真皮多能干细胞中的表达 被引量：4

9

作者 宗兆文 程天民 +6 位作者 粟永萍 李楠 董世武 艾国平 冉新泽 王军平 徐辉 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期481-484,共4页

目的构建大鼠CXCR4的腺病毒表达载体,并观察其转染真皮多能干细胞(dermalmultipotentstemcells,dMSCs)后的表达情况。方法扩增含有CXCR4的全长cDNA,然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,再与pAdEasy1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组... 目的构建大鼠CXCR4的腺病毒表达载体,并观察其转染真皮多能干细胞(dermalmultipotentstemcells,dMSCs)后的表达情况。方法扩增含有CXCR4的全长cDNA,然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,再与pAdEasy1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生含有CXCR4的骨架质粒(pAdEasy/CXCR4)。将验证正确的pAdEasy/CXCR4用PacⅠ酶切后转染293细胞,从而包装出CXCR4的腺病毒表达载体(AdvCXCR4)。用AdvCXCR4转染dMSCs,并采用RTPCR、免疫荧光细胞化学和荧光激活细胞分类计数的方法检测其表达情况。结果PCR、酶切和测序结果证明,成功地将CXCR4全长cDNA克隆到骨架质粒中,并包装出腺病毒表达载体。同时,AdvCXCR4转染dMSCs后可有效地增加dMSCs中CXCR4的表达。结论CXCR4的腺病毒表达载体的成功构建和其在dMSCs中的表达,为研究CXCR4在干细胞移植中的应用奠定基础。 展开更多

关键词 CXCR4 腺病毒表达载体 真皮多能干细胞 转染

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人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达 被引量：2

10

作者 周春丽 郝进 +4 位作者 唐书谦 钟白玉 吴军 贺伟峰 郝飞 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期243-246,共4页

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1(+)-CTLA... 目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。 展开更多

关键词 ctla-4ig 减毒鼠伤寒沙门菌 真核表达载体 基因表达

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腺病毒介导CTLA4Ig对舍格伦综合征小鼠涎腺分泌功能的影响 被引量：1

11

作者 马龙 杨军 +1 位作者 史文进 杨彦春 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期964-966,共3页

目的检测CTLA4 Ig-重组腺病毒载体(Ad-CTLA4 Ig)在小鼠舍格伦综合征中的治疗作用。方法采用完全弗氏佐剂+同种鼠颌下腺抗原激发诱导小鼠舍格伦综合征。实验组在激发后2 h予以Ad-CTLA4 Ig腹腔注射,对照组激发后注射胸腺肽。比较各组动物... 目的检测CTLA4 Ig-重组腺病毒载体(Ad-CTLA4 Ig)在小鼠舍格伦综合征中的治疗作用。方法采用完全弗氏佐剂+同种鼠颌下腺抗原激发诱导小鼠舍格伦综合征。实验组在激发后2 h予以Ad-CTLA4 Ig腹腔注射,对照组激发后注射胸腺肽。比较各组动物颌下腺形态学改变,每周饮水量、静态唾液总流率的变化。结果CTLA4 Ig-重组腺病毒实验组颌下腺病理学改变不明显,并且静态唾液总流率高于对照组(P<0.05),而每周饮水量明显低于对照组(P<0.05)。结论Ad-CTLA4 Ig可防治小鼠舍格伦综合征的发生,并对临床治疗舍格伦综合征提供了实验基础。 展开更多

关键词 ctla4ig-重组腺病毒载体 舍格伦综合征

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CTLA4Ig腺病毒基因治疗诱导异基因大鼠心脏移植耐受

12

作者 张庆殷 金永柱 +1 位作者 张海滨 谢蜀生 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期664-668,共5页

目的 :通过CTLA4Ig腺病毒基因治疗诱导异基因大鼠之间的心脏移植耐受 ,并探讨相关机制。 方法 :将异基因DA大鼠的心脏移植给受体LEW大鼠 ,同时经门静脉输注CTLA4Ig腺病毒 (1× 10 9～ 5× 10 9pfu·ml-1)。通过RT PCR检测CT... 目的 :通过CTLA4Ig腺病毒基因治疗诱导异基因大鼠之间的心脏移植耐受 ,并探讨相关机制。 方法 :将异基因DA大鼠的心脏移植给受体LEW大鼠 ,同时经门静脉输注CTLA4Ig腺病毒 (1× 10 9～ 5× 10 9pfu·ml-1)。通过RT PCR检测CTLA4Ig的体内表达 ,观察记录心脏移植物的存活时间 ,通过MLR、IL 2逆转实验 ,Th1/Th2型细胞因子表达的检测 ,研究耐受的机制。结果 :用LacZ腺病毒载体 (AdLacZ)治疗组 ,不能延长移植物的存活 ,用CTLA4Ig腺病毒基因治疗组 ,DA大鼠的心脏移植物明显延长。RT PCR实验证明 ,CTLA4Ig基因在受体内不同的组织表达量有所不同 ,并且随着时间的推移表达下降。Th1和Th2型细胞因子的检测显示 ,耐受大鼠体内未发现这两类细胞因子的偏移现象。MLR证明耐受大鼠的免疫应答表现为供体特异性 ,IL 2逆转实验表明 ,该耐受与克隆失活有关。结论 :在手术中给予CTLA4Ig腺病毒进行基因治疗 ,可诱导异基因大鼠间的心脏移植耐受 ,延长心脏移植物存活 ,该移植耐受表现为供体特异性 ,其形成与克隆失活有关 。 展开更多

关键词 移植耐受 ctla4ig 腺病毒载体 心脏移植 基因 病毒

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CTLA4Ig-IRES-OX40Ig重组腺病毒的构建及其生物学特性

13

作者 王光明 杨阳 +3 位作者 李爱玲 郝洁 高翔 谢蜀生 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期597-602,共6页

利用基因重组技术,拼接目的基因CTLA4Ig-IRES-OX40Ig,并亚克隆入腺病毒载体pTrack-CMV中,构建pT/CTLA4Ig-IRES-OX40Ig载体,与pAdeasy-1共同转染BJ5183以进行同源重组,所获得的重组子用LipofectAMINE2000转染293A细胞包装病毒,获得了可... 利用基因重组技术,拼接目的基因CTLA4Ig-IRES-OX40Ig,并亚克隆入腺病毒载体pTrack-CMV中,构建pT/CTLA4Ig-IRES-OX40Ig载体,与pAdeasy-1共同转染BJ5183以进行同源重组,所获得的重组子用LipofectAMINE2000转染293A细胞包装病毒,获得了可同时分别表达CTLA4Ig和OX40Ig的重组腺病毒AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig,并进行扩增和滴度测定,用Western印迹鉴定293A细胞培养上清中目的基因的表达,用混合淋巴细胞反应研究其免疫抑制活性.利用上述方法成功构建了穿梭质粒pT/CTLA4Ig-IRES-OX40Ig;并且获得了重组腺病毒AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig,在感染的293A细胞的培养上清中可以同时检测到CTLA4Ig和OX40Ig分子;AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig、AdCTLA4Ig和AdOX40Ig感染的Lewis大鼠脾细胞(刺激细胞)对Balb/c小鼠的脾细胞(反应细胞)的增殖均具有抑制作用,但AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig感染组的抑制效率明显强于AdCTLA4Ig和AdOX40Ig感染组,体外实验证实该两种分子可协同作用,强烈抑制混合淋巴细胞反应. 展开更多

关键词 ctla4ig OX40ig 核糖体进入位点 重组腺病毒

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CTLA4Ig基因表达对鼠皮肤移植免疫抑制作用的研究 被引量：10

14

作者 杨世昕 吴军 +5 位作者 卞修武 易绍萱 罗高兴 贺伟峰 黄赤兵 周立新 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第7期759-761,共3页

目的　探讨静脉注射CTLA4Ig腺病毒后在大鼠体内的表达和对同种异体移植皮肤存活的影响 ,以及该载体应用的安全性 ,为该基因治疗方法在抑制器官移植排斥反应的临床应用奠定基础。方法　供体SD大鼠皮肤移植前 1周 ,用腺病毒作载体将CTLA4I... 目的　探讨静脉注射CTLA4Ig腺病毒后在大鼠体内的表达和对同种异体移植皮肤存活的影响 ,以及该载体应用的安全性 ,为该基因治疗方法在抑制器官移植排斥反应的临床应用奠定基础。方法　供体SD大鼠皮肤移植前 1周 ,用腺病毒作载体将CTLA4Ig导入Wistar大鼠体内 ,用蛋白质斑点印迹实验检测血清中CTLA4Ig的表达 ,用腺病毒荧光抗体检测腺病毒在脏器的分布。同时还观测了各脏器的病理改变及移植物生存时间。结果　CTLA4Ig腺病毒在肝、脾、心、肺、肾均有明显分布 ,但实质细胞均未见严重损伤性改变。CTLA4Ig基因能在血清中的表达高峰时间一般在 7d左右 ,移植皮肤的生存显著长于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　从静脉注射导入的CTLA4Ig基因能在大鼠体内表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。 展开更多

关键词 腺病毒 ctla4ig 皮肤移植 大鼠

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GPI-CTLA4Ig嵌合分子的构建和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达 被引量：3

15

作者 于继云 沈倍奋 +4 位作者 黎燕 陈兴 程绍辉 田蓉 曲梅花 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期212-214,共3页

目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质... 目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质体法转染CHO dhfr 细胞 ,用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用RT PCR、ELISA、细胞免疫荧光和Westernblot进行鉴定。最后采用ProteinA亲和层析纯化。结果 :构建了GPI CTLA4Ig嵌合分子 ,并在CHO dhfr 细胞膜上稳定表达。结论 :GPI修饰的CTLA4Ig分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中 。 展开更多

关键词 ctla4ig 蛋白质表达 糖基化磷脂酰肌醇 CHO-dhfr^-细胞

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过表达KLF4对小鼠成骨细胞成骨分化的影响

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作者 杨佳佳 刘苹 +5 位作者 徐倩 刘志华 李晓明 汪超 张波 邓蔓菁 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期628-634,共7页

目的探讨重组腺病毒介导的肠富集Krüppel样因子(Krüppel like factor 4,KLF4)基因转染后对小鼠成骨细胞成骨分化的影响。方法采用酶消化法分离培养小鼠原代成骨细胞,经成骨诱导培养21 d后行茜素红染色。利用pHBAd-EF1-MCS-GF... 目的探讨重组腺病毒介导的肠富集Krüppel样因子(Krüppel like factor 4,KLF4)基因转染后对小鼠成骨细胞成骨分化的影响。方法采用酶消化法分离培养小鼠原代成骨细胞,经成骨诱导培养21 d后行茜素红染色。利用pHBAd-EF1-MCS-GFP系统构建携有KLF4的重组腺病毒载体(Ad-KLF4)。不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)Ad-KLF4转染成骨细胞后流式细胞仪检测转染效率。将成骨细胞随机分为对照组(未转染组)、KLF4组(Ad-KLF4转染)和GFP组(Ad-GFP转染)。Western blot检测小鼠成骨细胞中KLF4蛋白的表达;MTT检测细胞增殖;Real-time PCR检测成骨相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、核心蛋白结合因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)的表达。结果倒置显微镜下可见成骨细胞呈多边形、立方形等,茜素红染色示大量红色钙化结节的形成。经酶切鉴定、基因测序成功构建携带KLF4基因的重组腺病毒载体(Ad-KLF4)。成骨细胞经最佳MOI(100 PFU/m L)处理后,与对照组及GFP组比较,KLF4组可检测到KLF4蛋白及mRNA水平显著上升(P<0.01);成骨细胞增殖明显上升(P<0.05,P<0.01);成骨分化相关基因ALP、RUNX2、BSP的表达显著下降(P<0.05,P<0.01)。结论腺病毒介导的KLF4基因转染成骨细胞后可促进成骨细胞增殖,抑制其成骨分化,从而抑制骨形成。 展开更多

关键词 KLF4 过表达 腺病毒载体 成骨细胞 小鼠

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CTLA4基因修饰骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化及其免疫抑制功能研究 被引量：1

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作者 罗海英 王韫芳 +8 位作者 翟树森 张玉君 南雪 白慈贤 施双双 尉承泽 岳文 孔维 裴雪涛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1021-1030,共10页

用携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),体外向肝细胞诱导分化,并检测其免疫抑制功能.用含有HGF等细胞因子培养液诱导重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMMSCs向肝细胞分化.... 用携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),体外向肝细胞诱导分化,并检测其免疫抑制功能.用含有HGF等细胞因子培养液诱导重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMMSCs向肝细胞分化.诱导后的细胞可表达AFP、Alb和CK18等肝细胞标志,同时还具有储存糖原和摄取、排泌靛青绿等肝细胞功能.转基因BMMSCs在未经诱导和诱导后均可表达CTLA4Ig,诱导14天时表达量有所减弱.单向混合淋巴细胞反应证实,诱导7天的转基因BMMSCs具有明显的抑制淋巴细胞反应的作用,其抑制作用明显高于未转基因BMMSCs,且CTLA4Ig基因修饰BMMSCs输注还可以明显延长肝移植大鼠的存活时间.用重组腺病毒Ad-CTLA4Ig对BMMSCs进行基因修饰,一方面不会影响BMMSCs的肝细胞分化潜能,另一方面使BMMSCs的免疫抑制特性得到进一步强化. 展开更多

关键词 间充质干细胞 ctla4ig 腺病毒 分化 免疫抑制

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间接抗原递呈途径在同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用研究

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作者 陈希炜 王锡华 +6 位作者 罗高兴 罗奇志 马兵 易绍萱 贺伟峰 王儒鹏 唐进 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第14期1269-1271,共3页

目的　探讨间接同种异型识别在体外培养的同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用。方法　体外分离培养人表皮细胞 (Epidermalcells ,EC)、异体人外周血淋巴细胞 (Peripheralbloolymphocytes ,PBL)和单个核细胞 (Peripheralbloodmononucl... 目的　探讨间接同种异型识别在体外培养的同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用。方法　体外分离培养人表皮细胞 (Epidermalcells ,EC)、异体人外周血淋巴细胞 (Peripheralbloolymphocytes ,PBL)和单个核细胞 (Peripheralbloodmononuclearcells ,PBM ,含单核细胞 )。将毒性T淋巴细胞相关抗原 4(CTLA4Ig)腺病毒载体转染EC。转染与未转染的EC中均加入异体PBL或PBM共同培养 ,应用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷 ( 3H TdR)掺入法 ,测定各培养系中PBL、PBM增殖情况。结果　CTLA4Ig腺病毒载体能成功转染EC并表达相应蛋白。未转染的EC刺激异体PBL轻度增殖 (P <0 .0 5 ) ,以及刺激含单核细胞的PBM明显增殖 (P <0 .0 1) ;经CTLA4Ig腺病毒载体转染的EC刺激PBL、PBM增殖则明显减弱 (P <0 0 5 )。结论　间接同种异型识别在EC排斥中发挥了重要作用 ,CTLA4Ig能明显减轻该作用。 展开更多

关键词 人表皮细胞 ctla4ig腺病毒表达载体 外周血淋巴细胞 外周血单核细胞

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