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BVDV非结构蛋白NS4B的结构分析及其蛋白表达与鉴定
1
作者 柳凯月 董亚尊 +6 位作者 吴双双 马一瑄 刘鸿雁 王北艳 于立权 宋佰芬 马金柱 《黑龙江八一农垦大学学报》 2024年第1期69-76,共8页
NS4B是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的非结构蛋白,为研究BVDV在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,对ns4b进行了结构分析、表达载体构建及蛋白表达。采用Prot-Param、TExpasy和SignalP-4.1等软件分析NS4B蛋白的氨基... NS4B是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的非结构蛋白,为研究BVDV在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,对ns4b进行了结构分析、表达载体构建及蛋白表达。采用Prot-Param、TExpasy和SignalP-4.1等软件分析NS4B蛋白的氨基酸组成、疏水性和空间结构。根据Genebank上公布的BVDVns4b基因序列设计引物,利用PCR方法获得ns4b基因片段,连接到p3×Flag-CMV10表达载体上,构建重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,经双酶切与测序鉴定正确后,将p3×FlagCMV10-ns4b转染到HEK-293T细胞中,利用Western blot检测NS4B蛋白的表达。结果表明BVDV NS4B蛋白分子量为38.4 kDa,不存在信号肽,有49个磷酸化位点和6个糖基化位点,是一种主要由α-螺旋和无规则卷曲结构组成的疏水性稳定蛋白。成功构建了重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,并且p3×Flag-CMV10-ns4b在HEK-293T细胞中成功表达,为今后研究NS4B蛋白在BVDV感染宿主细胞及其免疫逃逸机制奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 ns4b基因 载体构建 蛋白表达
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BPIV-3和BVDV双重RT-PCR快速检测方法的建立 被引量：6
2
作者 刘晓乐 张敏敏 +3 位作者 陈颖钰 胡长敏 陈焕春 郭爱珍 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第11期1-5,共5页
参照GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因序列,分别针对BPIV3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物,经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法。最佳扩增条件... 参照GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因序列,分别针对BPIV3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物,经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法。最佳扩增条件为94℃30s,56.2℃30s,72℃1min,循环30次;72℃延伸5min,16℃10min;BVDV引物浓度为1.0μmol/L,BPIV-3引物浓度为0.5μmol/L。采用该方法检测BPIV-3和BVDV参考病毒株,能同时扩增出预期为425bp和294bp大小的特异性片段,而扩增牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、致病性大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和鼠伤寒沙门菌等均呈阴性反应。对参考病毒株进行梯度稀释检测,结果证明该方法检测BPIV-3的灵敏度可达10-3 TCID50/0.1mL,而BVDV的灵敏度达102 TCID50/0.1mL。 展开更多
关键词 双重PCR 检测方法 牛副流感病毒3型 牛病毒性腹泻病毒
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青海海北地区牦牛病毒性腹泻病毒流行病学调查及5′-UTR遗传进化分析
3
作者 林伟山 马豆豆 +6 位作者 雷萌桐 魏斌 李国才 王光华 王戈平 简莹娜 李秀萍 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1241-1249,共9页
【目的】了解青海省海北地区牦牛群中牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况及遗传学分子特征。【方法】对采集自青海海北地区的148份腹泻牦牛粪便样品提取病毒RNA并反转录合成cDNA,以其为模板扩增BVDV 5′-UT... 【目的】了解青海省海北地区牦牛群中牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况及遗传学分子特征。【方法】对采集自青海海北地区的148份腹泻牦牛粪便样品提取病毒RNA并反转录合成cDNA,以其为模板扩增BVDV 5′-UTR保守区域,建立特异性检测牦牛BVDV的实时荧光定量PCR方法,并以该方法对青海海北地区牦牛养殖场BVDV感染情况进行检测。选取4份BVDV阳性样品,对BVDV 5′-UTR区域序列进行PCR扩增和测序,与NCBI中不同亚型BVDV以及同属病毒毒株进行相似性比对,并基于BVDV 5′-UTR区域进行遗传进化分析。【结果】本研究基于BVDV 5′-UTR成功建立实时荧光定量PCR检测方法,标准曲线相关系数(R^(2))为0.997,标准品浓度为2.69×10^(2)~2.69×10^(9)拷贝/μL时具有良好的线性关系,最小检出限为2.69×10^(2)拷贝/μL。重复性试验结果显示,变异系数均<1.7%,具有良好的重复性和稳定性。采用建立的实时荧光定量PCR方法对青海省海北地区门源县、祁连县、海晏县和湟源县的腹泻牦牛粪便样品进行检测,结果显示,BVDV阳性率分别为45.00%、36.00%、30.77%和29.00%。BVDV 5′-UTR序列比对结果显示,分离获得的4株牦牛源BVDV与伊朗、美国的BVDV-1a亚型毒株聚集在同一个独立分支,核苷酸序列相似性为76.6%~99.7%。【结论】本研究明确了BVDV-1a型是导致青海省海北地区牦牛腹泻的重要病原之一,为该地区牦牛养殖场及时、有效地采取防控措施提供了科学依据,同时丰富了当地BVDV的分子流行病学调查数据,为该地区牛病毒性腹泻病的防控及疫苗研发提供了理论基础。 展开更多
关键词 牦牛 牛病毒性腹泻病毒(bvdv) 流行病学 实时荧光定量PCR 遗传进化分析
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牛病毒腹泻病毒(BVDV)E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立 被引量：4
4
作者 钟发刚 黄新 +1 位作者 王新华 李娜 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期761-764,共4页
【目的】为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法。【方法】重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达;Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集... 【目的】为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法。【方法】重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达;Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集的纯培养物进行超声波裂解后以His bind kit蛋白质纯化试剂盒纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度。【结果】重组蛋白表达可达菌体蛋白总量的19.7%,且具有较好的反应原性和特异性,以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约43头份血清样品进行检测,检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93.55%。【结论】以BVDV E2重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA检测方法是可行的,为其进一步的标准化莫定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2重组蛋白 ELISA
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牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL分离株全基因序列测定与分析 被引量：9
5
作者 张淑琴 谭斌 +1 位作者 王凤雪 程世鹏 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第10期23-27,共5页
为了解中国农业科学院特产研究所分子生物学重点实验室前期分离的牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL毒株完整的基因序列信息,本试验对BVDV-JL F6代毒株进行了完整基因序列测定。利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分段扩增了BVDV-JL分离毒株... 为了解中国农业科学院特产研究所分子生物学重点实验室前期分离的牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL毒株完整的基因序列信息,本试验对BVDV-JL F6代毒株进行了完整基因序列测定。利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分段扩增了BVDV-JL分离毒株的7段cDNA片段,分别克隆于pMD18-T载体并进行测序。BVDV-JL株基因组序列全长为12276bp,编码3901个氨基酸。基因组两端为非编码区5′UTR和3′UTR。基因比对及进化树分析结果表明BVDV-JL与BVDV CP7同源性最高,核苷酸同源性为93.2%,归类于BVDV-1b2基因亚型。BVDV-JL是第1个在中国报道的BVDV-1b2亚型毒株。了解BVDV-JL完整基因序列有利于中国BVDV流行病学调查。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 全基因组 进化树
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人参皂苷抗梅花鹿源BVDV研究 被引量：4
6
作者 李玉赜 张连学 +2 位作者 姚允怡 齐宪辉 郜玉钢 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第23期14036-14036,14044,共2页
[目的]研究人参皂苷抗BVDV作用,为人参的开发与利用提供参考。[方法]采用中性红染料法,研究了人参皂苷的抗BVDV作用。[结果]人参皂苷对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是12.80μg/m l,在1.60～12.80μg/m l范围内人参皂苷抗BVDV效果显著。... [目的]研究人参皂苷抗BVDV作用,为人参的开发与利用提供参考。[方法]采用中性红染料法,研究了人参皂苷的抗BVDV作用。[结果]人参皂苷对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是12.80μg/m l,在1.60～12.80μg/m l范围内人参皂苷抗BVDV效果显著。[结论]人参皂苷具有显著的抗BVDV病毒作用,在安全浓度范围内,人参皂苷抗病毒的作用随浓度的提高而增强。 展开更多
关键词 人参皂苷 梅花鹿 抗病毒 bvdv
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不同生物型BVDV感染对MDBK细胞类泛素基因转录水平的影响 被引量：5
7
作者 韩玉霞 孟露萍 +3 位作者 孙志华 刘娟 张辉 陈创夫 《动物医学进展》 北大核心 2015年第12期11-17,共7页
探讨牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对牛胚肾细胞(MDBK)类泛素基因转录水平的影响。对致细胞病变型(cp型)BVDV标准株NADL毒株及非致细胞病变型(ncp型)BVDV分离株shz 132毒株进行增殖,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应测定2种病毒拷贝数,按... 探讨牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对牛胚肾细胞(MDBK)类泛素基因转录水平的影响。对致细胞病变型(cp型)BVDV标准株NADL毒株及非致细胞病变型(ncp型)BVDV分离株shz 132毒株进行增殖,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应测定2种病毒拷贝数,按照Reed-Muench法测定BVDV NADL病毒TCID50值。以100TCID50BVDV NADL病毒和同等拷贝数的BVDV shz 132病毒分别感染MDBK细胞不同时间(4、12、24、48h)后收集细胞,提取细胞总RNA,反转录得到cDNA。以cDNA为模板,采用特异性引物,通过RT-qPCR反应检测细胞类泛素基因SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9的转录水平。结果显示,致细胞病变型BVDV NADL感染MDBK细胞48h,引起细胞显著的病变,而非致细胞病变型BVDV shz 132感染不引起细胞病变。BVDV NADL和shz 132的病毒拷贝数分别是1.13×1011 copies/mL和1.77×1011 copies/mL,BVDV NADL的TCID50是10-4.9 TCID50/0.1mL。RT-qPCR分析显示,与对照组相比,2种BVDV病毒感染都能引起MDBK细胞SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9基因的相对表达量变化。在BVDV shz 132感染的细胞中,SUMO1、SUMO2、SUMO3的相对表达量在各个感染时间都高于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,以上3个基因的相对表达量下调,差异极显著(P<0.01);而Ubc9基因的相对表达量则低于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24h,其相对表达量上调,差异极显著(P<0.01)。结果表明,BVDV感染调控了MDBK细胞SUMO系统,提示细胞SUMO系统参与了BVDV在胞内的活动,且这种调控作用与病毒的生物型存在密切联系。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 牛胚肾细胞 类泛素基因
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BVDV-E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果评价 被引量：4
8
作者 时坤 李男 +7 位作者 刁乃超 李健明 冯海峰 姚泽慧 田甜 宗颖 曾范利 杜锐 《动物医学进展》 北大核心 2020年第1期34-38,共5页
为评价牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果,将BVDV抗原抗体阴性牛随机分为rBCG-pMV361-E2-1(1 aa-297aa)、rBCG-pMV361-E2-2(1 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-3(1 aa-374 aa)、rBCG-pMV361-E2-4(45 aa-297 aa)、rB... 为评价牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果,将BVDV抗原抗体阴性牛随机分为rBCG-pMV361-E2-1(1 aa-297aa)、rBCG-pMV361-E2-2(1 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-3(1 aa-374 aa)、rBCG-pMV361-E2-4(45 aa-297 aa)、rBCG-pMV361-E2-5(45 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-6(45 aa-374 aa)、BVDV对照组、BCG对照组和PBS对照组,各组牛免疫相应疫苗后通过特异性抗体检测、淋巴细胞增殖试验、淋巴细胞亚群检测和细胞因子检测分析疫苗的免疫效果。结果显示,BVDV E2截短基因重组卡介苗均可诱导BVDV特异性抗体的产生,rBCG-pMV361-E2-1组抗体水平高于其他重组卡介苗试验组和BVDV对照组。淋巴细胞增殖试验结果显示,rBCG-pMV361-E2-2组SI为2.038±0.21,显著高于其他重组卡介苗试验组(P<0.01)。牛外周血CD4^+、CD8^+T淋巴细胞亚群检测结果显示,rBCG-pMV361-E2-5组牛外周血中CD4^+和CD8^+ T淋巴细胞亚群含量与PBS组比较,差异极显著(P<0.01)。IFN-γ检测结果显示,rBCG-pMV361-E2-1的IFN-γ水平显著高于其他试验组和对照组(P<0.01)。研究表明,rBCG-pMV361-E2-1可诱导接种牛产生较好的体液免疫应答,rBCG-pMV361-E2-1、rBCG-pMV361-E2-2和rBCG-pMV361-E2-5在诱导细胞免疫应答上效果较好。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2截短基因 重组卡介苗 免疫评价
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牛呼吸道疾病综合征主要病毒的流行病学调查
9
作者 赵婉玥 徐肖文 +6 位作者 常舒舒 项志杰 郭爱珍 陈颖钰 (华中农业大学动物科技学院动物医学院 华中农业大学农业微生物学资源发掘与利用全国重点实验室 武汉 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1324-1335,共12页
牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex,BRDC)是危害全球养牛业健康发展的疫病之一。引起该病的病毒主要包括牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral di... 牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex,BRDC)是危害全球养牛业健康发展的疫病之一。引起该病的病毒主要包括牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus 3,BPIV3)和牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)等。掌握引发BRDC的主要病毒的分布情况是对该病进行精准防控、疫苗研发的重要基础。本研究以我国不同地区肉牛、奶牛、牦牛及屠宰场牛为研究对象,利用PCR和RT-PCR技术对来自全国30个牧场的750份临床样品进行了BRDC主要病毒的检测。结果表明,我国牛群中BRDC主要病毒的个体检出率为9.47%(95%CI:7.5,11.8),群体检出率为33.33%(95%CI:17.9,54.3);优势病毒为BVDV,阳性检出率为5.07%(95%CI:3.6,6.9);IBRV的群阳性检出率最高,达到20.00%(95%CI:7.7,38.6),其余三种病毒的群阳性率也都大于10%。肉牛中主要病毒为BVDV,阳性检出率为5.62%(95%CI:3.9,7.8);奶牛中仅检出BVDV,阳性检出率为13.33%(95%CI:3.8,30.7);牦牛仅检出IBRV,阳性检出率为6.09%(95%CI:2.5,12.1)。相关性分析结果显示,不同品种、区域间,患有BRDC的风险无统计学差异。夏季和秋季相较春季更为易感。>14周龄牛相较≤14周龄牛感染的风险显著高,尤其是感染BVDV的风险。在有呼吸道症状牛中,BRDC主要病毒为BVDV,且有BVDV分别与BPIV3、BRSV混合感染的情况。在无呼吸道症状牛群中,IBRV的阳性检出率最高。综上,本研究确定了我国牛群中BRDC主要病毒的携带分布情况,确定了不同地区、季节、品种感染BRDC病毒的风险,为BRDC的精准防控提供了重要基础。 展开更多
关键词 牛呼吸道疾病综合征 牛传染性鼻气管炎病毒 牛病毒性腹泻病毒 牛副流感病毒3型 牛呼吸道合胞体病毒 流行病学调查 时空分析
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BVDV P7蛋白的原核表达及其生物信息学分析 被引量：3
10
作者 李田田 翟军军 倪宏波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2016年第6期69-73,共5页
为了对BVDV-1 P7蛋白进行原核表达及生物信息学分析,采用RT-PCR的方法扩增BVDV NADL株BVDV-1 P7的ORF,扩增产物经Bam H I、Sal I双酶切后插入原核表达载体p EGX4T-1(+),构建P7基因原核表达载体并将其转化至工程菌E.coli BL21(DE3)中进... 为了对BVDV-1 P7蛋白进行原核表达及生物信息学分析,采用RT-PCR的方法扩增BVDV NADL株BVDV-1 P7的ORF,扩增产物经Bam H I、Sal I双酶切后插入原核表达载体p EGX4T-1(+),构建P7基因原核表达载体并将其转化至工程菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,并对其进行生物信息学预测。结果表明,成功扩增并构建了BVDV NADL株的BVDV-1 P7原核表达载体,命名p EGX4T-1-P7。SDS-PAGE和Western blot表明,在分子质量34 k Da的位置出现与预期大小一致的蛋白条带;生物信息学结果表明在P7蛋白有信号肽,存在疏水区。该研究成功的表达了P7蛋白,该蛋白是一个疏水性蛋白,为其进一步的功能研究奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 bvdv P7基因 原核表达 生物信息学
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奶牛黏膜病的BVDV HJ-1株全基因组序列分析 被引量：2
11
作者 邵红 张林雁 +4 位作者 夏立勇 佟海山 李旭阳 周玉龙 张旭 《黑龙江八一农垦大学学报》 2021年第4期21-28,共8页
BVDV HJ-1分离株属于1b基因亚型是引起奶牛发生黏膜病和出血综合症病原,导致高病死率。为了解BVDV HJ-1株的遗传学特征,研究应用PCR方法分13段扩增其全基因组序列,通过克隆测序最终组装出全序列。应用生物信息学软件对BVDV HJ-1基因序... BVDV HJ-1分离株属于1b基因亚型是引起奶牛发生黏膜病和出血综合症病原,导致高病死率。为了解BVDV HJ-1株的遗传学特征,研究应用PCR方法分13段扩增其全基因组序列,通过克隆测序最终组装出全序列。应用生物信息学软件对BVDV HJ-1基因序列同源性、跨膜结构域、糖基化位点、5’UTR一级结构与二级结构的差异等进行分析。结果测得该毒株全序列为12282 nt,与参考毒株相比存在高度变异,序列同源性在70.1%~93.5%,尤其是非结构蛋白NS4A、NS4B和NS5A同源性在49.0%~93.0%。E1-E2存在5个潜在的跨膜信号区,结构蛋白上富含14个潜在的糖基化位点,5’UTR Ⅰ区和Ⅲb-Ⅲe区相对保守,不同毒株之间II区的二级结构变异大。总之,BVDV HJ-1株全基因组序列信息丰富了我国BVDV的遗传学数据资源,为下一步疫苗的研制和致病机理的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 黏膜病 牛病毒性腹泻病毒 全序列 生物信息
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BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：5
12
作者 麻宝艺 盛陈艳 +6 位作者 刘宏莹 马青霞 汪婷婷 李健明 时坤 杜锐 冷雪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2326-2335,共10页
【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件... 【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件,构建标准曲线,进行双重实时荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性检测,并利用建立的实时荧光定量PCR检测方法对采自吉林省的临床样品进行检测。【结果】建立的双重实时荧光定量PCR方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.3μmol/L,BVDV1和BVDV2型的标准曲线分别为:Y=-3.54X+37.36(R^(2)=0.990)和Y=-3.18X+35.95(R^(2)=0.997)。对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)均无特异性扩增,批内和批间变异系数均<3%,检测下限为10拷贝/μL。临床样品检测结果显示,总体阳性率为23.1%(36/156),其中BVDV1阳性率为17.9%(28/156),BVDV2阳性率为5.1%(8/156)。【结论】本研究建立了可同时快速、准确鉴别BVDV1和BVDV2的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,为BVDV的防控与净化提供技术支撑。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(bvdv) TaqMan实时荧光定量PCR方法 探针
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青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病学调查 被引量：15
13
作者 陈新诺 张朝辉 +6 位作者 徐林 唐川 余劲 李劲 廖昆 汤承 张斌 《动物医学进展》 北大核心 2016年第9期35-38,共4页
为了解青藏高原地区牦牛牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛肠道病毒（BEV）的感染情况,应用RT-PCR对青藏高原地区（西藏、青海、四川和云南）共计222份出现腹泻症状的牦牛粪便样品开展了分子流行病学调查。从222份样品中,检出44份BVDV阳性,B... 为了解青藏高原地区牦牛牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛肠道病毒（BEV）的感染情况,应用RT-PCR对青藏高原地区（西藏、青海、四川和云南）共计222份出现腹泻症状的牦牛粪便样品开展了分子流行病学调查。从222份样品中,检出44份BVDV阳性,BVDV阳性检出率为20%（95%CI：15.5%~25.6%）;检出65份BEV阳性,BEV阳性检出率为29.4%（95%CI：24.1%~35.0%）;BVDV/BEV混合感染阳性率为4.8%（95%CI：2.5%~8.0%）。结果表明,所有被检地区牦牛均存在BVDV和BEV感染,且部分地区感染较为严重,有混合感染的情况。研究结果旨在为青藏地区牦牛腹泻的综合防控措施提供基本数据,丰富BVDV和BEV的分子流行病学调查资料。 展开更多
关键词 青藏高原 牦牛 牛病毒性腹泻病毒 牛肠道病毒 分子流行病学调查
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基于小鼠模型研究肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响 被引量：2
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作者 黄江 李闯 +6 位作者 崔月琦 袁雪莹 赵志诚 刘宇 周玉龙 朱战波 张泽财 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3466-3473,共8页
本试验通过建立肠道菌群紊乱小鼠模型,旨在探究肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响。肠道菌群紊乱小鼠模型建立试验,共分为2组,采用两性霉素B、硫酸新霉素、氨苄西林、甲硝唑、盐酸万古霉素,以灌胃的方式构建肠道菌群紊乱小鼠模型,对照组... 本试验通过建立肠道菌群紊乱小鼠模型,旨在探究肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响。肠道菌群紊乱小鼠模型建立试验,共分为2组,采用两性霉素B、硫酸新霉素、氨苄西林、甲硝唑、盐酸万古霉素,以灌胃的方式构建肠道菌群紊乱小鼠模型,对照组给予等体积的生理盐水。连续处理13 d后,无菌收集小鼠粪便,提取细菌DNA,进行16S rRNA测序,检测小鼠肠道菌群多样性和丰度的变化。肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响试验,共分为2组,抗生素处理组和未处理组小鼠均接种10^(5) TCID_(50)的CP型BVDV,于感染第7天,采集小鼠血液和十二指肠,通过qRT-PCR、Western blot方法检测病毒载量。通过苏木精-伊红染色法(HE染色)检测十二指肠病理组织变化。粪菌移植(FMT)移植试验共分为2组,以灌胃等体积生理盐水组为对照,进一步验证恢复肠道菌群对BVDV感染的影响。结果显示,抗生素处理明显降低肠道菌群α多样性,维恩图分析也表明抗生素处理减少肠道菌群OTU数量。β多样性结合柱形图分析进一步表明,抗生素处理组与未处理组小鼠肠道菌群的组成存在明显差异,其中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度在抗生素处理组中均显著降低,然而变形菌门相对丰度明显增加。对BVDV易感性探究发现,菌群紊乱小鼠血液和十二指肠中BVDV载量均显著高于BVDV感染的菌群正常组小鼠的BVDV载量。Western blot和病理组织学检测也发现,肠道菌群紊乱增加了小鼠十二指肠中BVDV E0蛋白表达水平,加重了十二指肠病理损伤。FMT回补给菌群紊乱小鼠后,BVDV载量显著降低,十二指肠病理变化也明显改善。综上,本研究成功建立肠道菌群紊乱小鼠模型,依据该模型进一步证实了肠道菌群紊乱可以增加BVDV的易感性,而FMT回补具有抑制BVDV感染的作用。这些结果可为防控BVDV感染的微生态制剂研发以及抗病毒药物的筛选奠定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 肠道菌群 小鼠模型 粪菌移植
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牦牛源BVDV非结构蛋白NS5A的原核表达及抗原表位分析 被引量：1
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作者 王慧慧 冯茜莉 +7 位作者 蒲飞洋 李易聪 汪梦竹 周小凯 赵泽阳 马忠仁 李倬 马晓霞 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第8期3180-3189,共10页
【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(G... 【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达。经10%SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10%SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处,表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 非结构蛋白 NS5A 原核表达
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黑龙江省某规模化牧场BVDV病毒分离鉴定及生物学信息分析 被引量：4
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作者 王梦心 周玉龙 +6 位作者 贾伟强 李旭阳 翟海瑞 靳广杰 胡林杰 孟野 盛守志 《黑龙江八一农垦大学学报》 2020年第5期13-22,共10页
为了探讨黑龙江某规模化牧场发病奶牛的致病原及其生物学特征,对黑龙江省某规模化牛场采集到的育成牛肺脏组织样本进行病毒分离鉴定,确定了样本的基因型为BVDV-1d,5’UTR的同源性比对显示,与中国北京株BJ1023(Genbank:KF925509)同源性... 为了探讨黑龙江某规模化牧场发病奶牛的致病原及其生物学特征,对黑龙江省某规模化牛场采集到的育成牛肺脏组织样本进行病毒分离鉴定,确定了样本的基因型为BVDV-1d,5’UTR的同源性比对显示,与中国北京株BJ1023(Genbank:KF925509)同源性最高。E2基因的同源性比对显示,与中国北京株BJ1308(Genbank:KT951841)同源性最高。对样本进行E2基因序列分析和理化性质分析可知,E2核苷酸水平上有58.9%的可变性位点(763/1296),保守区有两段:核苷酸位置394~541以及919~1234。有两个潜在的跨膜信号区域:30~50和410~420。蛋白不稳定性为33.62,可以将该蛋白质分类为稳定的蛋白质。E2基因的抗原表位与瑞士毒株SuwaCp(Genbank:KC853441)的抗原表位优势部分走势基本一致。分离获得的毒株为我国BVDV毒株资源与分子流行病学提供了资料。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 分离鉴定 基因型 序列分析
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基于E2蛋白BVDV-1病毒样颗粒的构建及对小鼠的免疫效力评估
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作者 张家祺 贾浠宁 +4 位作者 周群 宋鑫 朱晨曦 李格格 张斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期5143-5153,共11页
本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)E2病毒样颗粒(VLPs),并测定其对小鼠的免疫效力。选用BVDV-1 SWU-Z6株的E 2基因序列为模板,针对昆虫细胞密码子偏嗜性优化合成E 2基因,利用昆虫细胞-杆状病毒表达... 本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)E2病毒样颗粒(VLPs),并测定其对小鼠的免疫效力。选用BVDV-1 SWU-Z6株的E 2基因序列为模板,针对昆虫细胞密码子偏嗜性优化合成E 2基因,利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备BVDV-1 E2 VLPs。采用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot验证E2蛋白在SF9细胞中的表达,通过电镜鉴定BVDV-1 E2 VLPs的组装。对获得的VLPs进行超离纯化,使用不同剂量的VLPs添加MF59佐剂和CpG-ODN免疫增强剂肌注免疫小鼠,同时设立BVDV商业灭活苗组和PBS空白对照组。二免4周后选用BVDV-1 SWU-Z6毒株以灌胃途径对小鼠进行攻毒,通过小鼠体重变化以及粪便中的病毒载量来评估BVDV-1 E2 VLPs的免疫保护效果。经酶切鉴定和测序验证表明,优化后的E 2基因已正确克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Dual中,并获得重组质粒pFast Dual BVDV-1 E2,将重组质粒转化到DH10.Bac感受态细胞经过蓝白斑筛选获得重组杆粒Bacmid-BVDV-1 E2,将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒Baculo-BVDV-1 E2。电镜下观察可见大量直径在80~100 nm的BVDV病毒样颗粒,IFA和Western blot结果证实重组杆状病毒能够正确表达E2蛋白,并具有良好的生物学活性。BVDV-1 E2 VLPs 50μg组小鼠首免2周时ELSIA抗体效价约为1∶10000,加强免疫2周后抗体效价达到1∶100000。攻毒保护试验结果表明,免疫组小鼠在攻毒后第7天表现出体重下降,而后开始回升;在攻毒后第10天采集粪便没有检测到病毒拷贝。与非免疫组小鼠相对比,BVDV-1 E2 VLPs 50μg剂量两次免疫后阻止了因病毒感染而导致体重下降以及消化道内病毒的复制。研究中成功制备了BVDV-1 E2 VLPs,能诱导机体产生较强的体液免疫反应,可使小鼠获得抵抗BVDV-1 SWU-Z6毒株感染的免疫保护力。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 杆状病毒 病毒样颗粒 免疫原性
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BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
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作者 周思佳 韩佃刚 +5 位作者 董俊 杨云庆 叶玲玲 李静 张冲 信吉阁 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2023年第3期423-430,共8页
【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性... 【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示:建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒基因1型(bvdv-1) 实时荧光定量RT-PCR 病毒检测
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基于RNA-Seq技术分析非致病细胞病变BVDV感染牛单核细胞对NF-κB信号通路的影响 被引量：1
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作者 何延华 马旭升 +4 位作者 钟发刚 黄新 张云峰 赵新霞 陈创夫 《动物医学进展》 北大核心 2020年第2期39-46,共8页
非致细胞病变(NCP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV)可引起持续的潜伏感染和免疫抑制,但是具体的感染机制尚不清楚。采用RNA测序(RNA-seq)技术,以NCP BVDV感染牛单核细胞2h和24h的细胞为样本分别提取总RNA,并采用HiSeqTM2500高通量测序技术进行... 非致细胞病变(NCP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV)可引起持续的潜伏感染和免疫抑制,但是具体的感染机制尚不清楚。采用RNA测序(RNA-seq)技术,以NCP BVDV感染牛单核细胞2h和24h的细胞为样本分别提取总RNA,并采用HiSeqTM2500高通量测序技术进行转录组测序,对获得的有效序列进行功能注释及相关生物信息学分析。结果显示,在感染2h后,筛选出差异表达基因9959个,其中4968基因表达上调;在感染24h后,筛选出差异表达基因7977个,其中4184的基因表达上调;进一步分析NF-κB信号通路的变化,结果显示,在感染后2h,与免疫反应或抗病毒活性相关的基因表达显著增加,到感染24h表达水平显著下降。变化显著的基因均与炎症、免疫、自噬和凋亡密切相关。研究建立的牛外周血单核细胞感染BVDV后差异表达基因数据库,丰富了BVDV与宿主之间的相互关系,为BVDV持续感染机制的研究奠定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 牛单核细胞 核糖核酸测序 核转录因子-κB信号通路
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牦牛腹泻病毒BVDV、BCV、BRV流行病学调查 被引量：11
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作者 赵霞玲 牛家强 +4 位作者 次仁央金 次仁央宗 索朗卓嘎 温东旭 索朗斯珠 《高原农业》 2020年第3期298-302,共5页
引起牛腹泻性病毒病的病原主要有牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV),牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV),牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。该病在临床上主要表现为腹泻,严重脱水,呕吐。为了解西藏林芝市波密县牦... 引起牛腹泻性病毒病的病原主要有牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV),牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV),牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。该病在临床上主要表现为腹泻,严重脱水,呕吐。为了解西藏林芝市波密县牦牛腹泻性病毒病(BCV、BRV、BVDV)的流行现状,主要采用胶体金免疫层析技术法(GICA)、酶联免疫吸附法(ELISA)分别对210份腹泻牦牛血样、粪便进行了BCV、BRV抗原检测及BVDV抗体检测。结果显示,从210份待检样品中分别检出BCV、BRV抗原阳性75份、0份,其抗原阳性率分别为35.70%、0%;BVDV抗体阳性165份,抗体阳性率为78.60%,且平均抗体含量为60.13 pg/mL,中位数值为64.79,最低含量为11.68 pg/mL,最高含量为74.45 pg/mL,68.57%的样品抗体浓度大于55 pg/mL。结果表明,波密县牦牛群体中存在BCV、BVDV感染,应引起重视,进一步加强对牦牛腹泻性病毒病的防控。 展开更多
关键词 牦牛 牛病毒性腹泻病毒 牛冠状病毒 牛轮状病毒 流行病学调查
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