甘蓝BobHLH121基因克隆、亚细胞定位及表达分析 被引量：3

1

作者 秦文斌 山溪 +3 位作者 张振超 姚悦梅 戴忠良 秦岭 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期3320-3329,共10页

【目的】克隆甘蓝b HLH转录因子(BobHLH121)基因,分析其在不同组织及低温胁迫下的表达模式,为深入研究bHLH转录因子在甘蓝低温响应中的作用机理提供理论参考。【方法】克隆BobHLH121基因编码区(CDS)序列,利用生物信息学软件进行预测分析... 【目的】克隆甘蓝b HLH转录因子(BobHLH121)基因,分析其在不同组织及低温胁迫下的表达模式,为深入研究bHLH转录因子在甘蓝低温响应中的作用机理提供理论参考。【方法】克隆BobHLH121基因编码区(CDS)序列,利用生物信息学软件进行预测分析,并构建p CAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BobHLH121基因在低温胁迫下的相对表达量。【结果】BobHLH121基因CDS长度为1367 bp,定位于C06染色体上,其编码311个氨基酸,蛋白分子量为34.89 kD,理论等电点(p I)为5.42,不稳定系数为52.29,疏水性平均系数为-0.733,说明该蛋白为不稳定的亲水性蛋白,且呈酸性,定位于细胞核。BobHLH121蛋白的二级结构主要由α-螺旋(占30.87%)、延伸链(占9.32%)、β-转角(占2.89%)和无规则卷曲(占56.91%)组成,具有保守的HLH结构域。BobHLH121蛋白与拟南芥(NP_191768.2)、琴叶拟南芥(EFH52923.1)、亚麻荠(XP_01909381.1)、荠菜(XP_023638997.1)、油菜(CDY65446.1)、白菜(XP_009104362.1)和萝卜(XP_018442860.1)等多种植物bHLH蛋白的氨基酸相似性分别为55.6%、54.8%、52.0%、50.3%、76.4%、73.9%和61.1%。系统发育进化树分析结果显示,BobHLH121与拟南芥(NP_191768.2)和琴叶拟南芥(EFH52923.1)bHLH蛋白在同一小分支上。BobHLH121基因启动子区域存在植物生长发育、非生物胁迫、激素应答和光响应大量的顺式作用元件。BobHLH121基因在叶片的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),在其他组织中的相对表达量均较低。低温胁迫6~12 h时BobHLH121基因的相对表达量较低温处理0 h(对照)显著降低,在低温处理24 h时急剧升高,显著高于其他处理时间,低温处理48 h时又显著降低,表明该基因可能在低温胁迫下延迟表达。【结论】BobHLH121基因含有bHLH家族典型的HLH保守结构域序列,具有明显的组织表达特异性,可能参与甘蓝叶片的生长发育调控,且响应低温胁迫,可能在甘蓝耐寒性中发挥调控作用。 展开更多

关键词 甘蓝 bobhlh121基因 亚细胞定位 低温胁迫 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

柽柳再生和转化体系的建立及瞬时转化TcSYP121基因功能分析 被引量：1

2

作者 韩帅 靳芊芊 +2 位作者 殷楠 张国君 徐兴兴 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期823-833,共11页

【目的】建立柽柳再生及遗传转化体系并分析瞬时转化柳树突触融合蛋白(TcSYP121)基因功能,为筛选柽柳分子抗性育种候选基因及盐碱土的改良和生态修复提供理论参考。【方法】通过单因素筛选最佳外植体、消毒处理、各阶段(初代、分化、增... 【目的】建立柽柳再生及遗传转化体系并分析瞬时转化柳树突触融合蛋白(TcSYP121)基因功能,为筛选柽柳分子抗性育种候选基因及盐碱土的改良和生态修复提供理论参考。【方法】通过单因素筛选最佳外植体、消毒处理、各阶段(初代、分化、增殖和生根)的培养基类型及激素浓度建立柽柳再生体系;通过正交试验分析影响转化体系的4个因素(预培养时间、侵染时间、共培养时间和农杆菌浓度);通过PCR扩增及电泳结果验证柽柳转化体系;瞬时转化TcSYP121基因获得过表达植株(OE)和病毒诱导的基因沉默植株(VI),进行表型观测、植物超氧阴离子染色液(NBT)和二氨基联苯胺法(DAB)染色并测定盐腺直径和盐腺密度、叶绿素含量、超氧化物酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及TcSYP121基因相对表达量,分析TcSYP121基因的功能。【结果】最优外植体为柽柳嫩茎段,最适宜次氯酸钠(NaClO)消毒浓度为5%,最佳消毒时间为5 min,最适合的初代培养基为MS培养基,最佳分化培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,最佳增殖培养基为MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA,最佳生根培养基是1/2MS+0.5mg/L IBA。转化体系中正交试验结果为最佳预培养时间是2 d,最佳侵染时间是5 min,最佳共培养时间是2 d,最佳农杆菌浓度OD600为0.8,抗生素头孢霉素(Cef)浓度为300 mg/L,卡那霉素(Kan)筛选压为30 mg/L。PCR扩增及电泳结果显示,利用该遗传转化体系可获得阳性转基因植株。瞬时转化TcSYP121基因柽柳的耐盐功能分析结果显示,在盐胁迫下,VI和对照(CK)柽柳中叶绿素含量显著下降(P<0.05),而OE下降不显著(P>0.05);OE柽柳SOD和POD活性均高于VI与CK,且OE中Tc SYP121基因的相对表达量高于CK和VI。【结论】建立了柽柳的再生体系和遗传转化体系,通过对柽柳进行瞬时转化获得过表达和沉默表达柽柳,证实TcSYP121基因能够提高柽柳耐盐性。 展开更多

关键词 柽柳 转化体系 再生体系 TcSYP121基因 瞬时转化 耐盐

在线阅读 下载PDF 职称材料

中国汉族人群ENPP1基因K121Q多态与2型糖尿病的关联及Meta分析 被引量：5

3

作者 王敏 彭婵 +1 位作者 屈亚莉 黄青阳 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期808-816,共9页

多个欧洲白人的Meta分析表明核苷酸焦磷酸酶1（Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1,ENPP1）基因K121Q多态与2型糖尿病相关联,但在日本人、韩国人和中国台湾人的研究中没有发现相关性,而在中国大陆人群中二者的关联研... 多个欧洲白人的Meta分析表明核苷酸焦磷酸酶1（Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1,ENPP1）基因K121Q多态与2型糖尿病相关联,但在日本人、韩国人和中国台湾人的研究中没有发现相关性,而在中国大陆人群中二者的关联研究结果不尽一致。文章调查了湖北地区539例2型糖尿病患者和404名正常人ENPP1基因K121Q多态性。基因型及等位基因频率在病例组和对照组间没有显著差异（P〉0.05）,但经性别、年龄和体重指数调整后的Logistic回归分析揭示XQ基因型与2型糖尿病显著相关（OR=1.5,95%CI：1.39~1.62,P〈0.001）。对性别进行的亚组分析显示,女性病例组Q等位基因和XQ基因型的频率显著高于对照组（Q：12.4%vs.6.1%,P=0.001;XQ：23.7%vs.11.7%,P=0.001）。结果表明ENPP1基因K121Q多态与湖北汉族人2型糖尿病的关联存在性别差异,在女性中更明显。文章是对中国大陆人群进行的第一个Meta分析,结果显示Q等位基因增加2型糖尿病的发病风险（OR=1.42,P=0.042）。 展开更多

关键词 ENPP1基因 K121Q 2型糖尿病 多态性 META分析

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组人血管内皮细胞生长因子121cDNA的基因克隆、表达和鉴定

4

作者 王跃祥 官孝群 +2 位作者 杨健 莫炜 宋后燕 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第3期444-448,共5页

应用RT PCR方法 ,扩增人VEGF12 1cDNA基因片段 ,与酵母表达载体pPIC9K重组 ,获得表达质粒p9KVEGF12 1.该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,PCR鉴定VEGF12 1cDNA与酵母染色体整合状态 ,高拷贝转化子用甲醇诱... 应用RT PCR方法 ,扩增人VEGF12 1cDNA基因片段 ,与酵母表达载体pPIC9K重组 ,获得表达质粒p9KVEGF12 1.该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,PCR鉴定VEGF12 1cDNA与酵母染色体整合状态 ,高拷贝转化子用甲醇诱导表达 .工程菌用 5L发酵罐发酵 ,表达产物r hVEGF12 1占培养液中总蛋白量 70 %以上 .纯化产物促进牛毛细血管内皮 (BCE)细胞增殖 。 展开更多

关键词 重组人血管内皮细胞生长因子121 CDNA 基因克隆 表达 鉴定 血管生成 血管通透 毕赤酵母

在线阅读 下载PDF 职称材料

羊口疮病毒凤翔株ORFV121和vIL-10基因的生物信息学分析 被引量：4

5

作者 刘方 赵玄多 +5 位作者 安贝 刘慧 高洋 张立强 贾芸晓 陈德坤 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第7期52-58,共7页

为分析羊口疮病毒ORFV121和vIL-10基因在凤翔(FX0910)强毒株(vORFV)和弱毒株(lvORFV)之间的差异,应用PCR方法扩增羊口疮病毒ORFV121和vIL-10基因的全长序列并测序,应用生物信息学软件分析基因的核酸、氨基酸相似性,蛋白的亲水性、二级... 为分析羊口疮病毒ORFV121和vIL-10基因在凤翔(FX0910)强毒株(vORFV)和弱毒株(lvORFV)之间的差异,应用PCR方法扩增羊口疮病毒ORFV121和vIL-10基因的全长序列并测序,应用生物信息学软件分析基因的核酸、氨基酸相似性,蛋白的亲水性、二级结构以及抗原性。结果显示,lvORFV的ORFV121基因118位的谷氨酸缺失,说明该处发生的碱基突变为有意突变,该突变导致弱毒株相应蛋白的亲水性、二级结构发生变化,蛋白的抗原性在很多区域发生本质改变;vIL-10在蛋白质水平出现了5个氨基酸位点突变(14:V→W,49:A→P,57:T→M,72:R→C,102:I→V)和79位插入1个色氨酸。这些位点差异导致蛋白的亲水性、二级结构和抗原性发生了变化。ORFV121基因和vIL-10基因在vORFV和lvORFV之间存在差异,这些基因差异导致蛋白的亲水性、二级结构和抗原性发生改变。 展开更多

关键词 羊口疮病毒凤翔株 ORFV121 vIL-10 基因差异

在线阅读 下载PDF 职称材料

烟草NtSYP121基因克隆、表达载体构建及表达分析 被引量：1

6

作者 熊雪 殷双琴 +3 位作者 陈欣 王丽红 宋文强 李立芹 《浙江农业科学》 2018年第2期231-237,共7页

采用同源克隆的方法对烟草品种K326中的一个SYP121基因进行了研究,该基因全长903 bp,蛋白编码300个氨基酸。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与渐窄叶烟草SYP121-like、绒毛状烟草SYP121-like等的亲缘关系最近,故命名为Nt SYP121... 采用同源克隆的方法对烟草品种K326中的一个SYP121基因进行了研究,该基因全长903 bp,蛋白编码300个氨基酸。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与渐窄叶烟草SYP121-like、绒毛状烟草SYP121-like等的亲缘关系最近,故命名为Nt SYP121。组织表达分析发现,该基因在成熟期的根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。非生物逆境胁迫实验表明,该基因对低钾、高盐、干旱、ABA均有响应表达,并成功构建了Nt SYP121-p BI121过表达载体。研究结果为解析Nt SYP121在响应逆境胁迫的功能奠定一定理论基础。 展开更多

关键词 烟草 NtSYP 121 克隆 生物信息学 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

羊口疮病毒安徽株121基因的原核表达与生物信息学分析

7

作者 刘自敏 王小朋 +5 位作者 白彩霞 杨侃侃 张学琪 胡子慧 孙裴 王勇 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2019年第S01期358-365,共8页

为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E.... 为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8.86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62.25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27.81%,2.98%,6.95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 121基因 原核表达 生物信息学

在线阅读 下载PDF 职称材料

甘蓝抗枯萎病基因FOC1植物表达载体构建及遗传转化 被引量：1

8

作者 刘洁 马建 +3 位作者 雷蕾 孙超 康俊根 颉建明 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期429-436,共8页

为研究甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的抗性功能,利用前期克隆的FOC1基因,以pBI121质粒为植物表达载体,采用同源重组法构建FOC1基因的过表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并通过农杆菌介导的甘蓝外植体转化... 为研究甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的抗性功能,利用前期克隆的FOC1基因,以pBI121质粒为植物表达载体,采用同源重组法构建FOC1基因的过表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并通过农杆菌介导的甘蓝外植体转化法对感病甘蓝进行遗传转化,利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。结果表明,最终成功构建FOC1基因的过表达载体pBI121-35S-FOC1,并已成功整合到受体甘蓝基因组中。 展开更多

关键词 甘蓝 抗枯萎病基因 pBI121质粒 载体构建 遗传转化

在线阅读 下载PDF 职称材料

新城疫病毒HN基因的克隆及在苜蓿中的表达 被引量：2

9

作者 杨红军 王豪举 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2011年第1期3-6,共4页

为了克隆新城疫病毒LaSota株HN基因,构建原核重组表达质粒pBI121-HN,使HN基因在苜蓿中表达,将新城疫病毒LaSota株接种于鸡胚,培养、纯化后收获鸡新城疫病毒,提取病毒RNA,经反转录后通过PCR扩增HN基因,克隆得到重组质粒pBI121-HN,并其通... 为了克隆新城疫病毒LaSota株HN基因,构建原核重组表达质粒pBI121-HN,使HN基因在苜蓿中表达,将新城疫病毒LaSota株接种于鸡胚,培养、纯化后收获鸡新城疫病毒,提取病毒RNA,经反转录后通过PCR扩增HN基因,克隆得到重组质粒pBI121-HN,并其通过电转化导入根癌农杆菌中,以根癌农杆菌为介导将HN基因导入苜蓿细胞。最终成功构建了重组表达质粒pBI121-HN,并通过根癌农杆菌转染苜蓿细胞将其在苜蓿中成功表达。本试验为家禽的植物性苜蓿疫苗的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 新城疫病毒 HN基因 pBI121载体 表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

禽脑脊髓炎病毒VP1基因植物表达载体的构建 被引量：3

10

作者 马强 张二芹 张同旭 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2010年第5期25-27,共3页

以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引... 以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810bp的产物。VP1基因和pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础。 展开更多

关键词 禽脑脊髓炎病毒 VP1基因 pBI121植物表达载体

在线阅读 下载PDF 职称材料

狂犬病病毒N基因植物表达载体的构建

11

作者 张二芹 张东林 马强 《江苏农业科学》 北大核心 2013年第12期32-33,共2页

以提取的狂犬病病毒总RNA为模板,以N1和N2为引物,反转录为cDNA,然后再以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至质粒pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-N,采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法及PCR确认正确后,利用pMD18-T-N重组质粒为模板,以N3和N... 以提取的狂犬病病毒总RNA为模板,以N1和N2为引物,反转录为cDNA,然后再以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至质粒pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-N,采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法及PCR确认正确后,利用pMD18-T-N重组质粒为模板,以N3和N4为引物,成功构建了重组植物表达载体pBI121-N。 展开更多

关键词 狂犬病病毒 N基因 植物表达载体pBI121-N

在线阅读 下载PDF 职称材料

肉色吸水链霉菌SH121接合转移系统的建立 被引量：2

12

作者 杨卓 李佳丽 +1 位作者 肖乐 何璟 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期49-55,共7页

利用单因素试验探索了热激处理、预萌发时间、供体宿主菌的类型、供受比及MgCl_2浓度对链霉菌SH121接合转移效率的影响,结果显示:在50℃热激10min,37℃预萌发1h,以大肠杆菌DCDA/pUZ8002为供体宿主菌,在供受比为100∶1时,使用添加40mmol/... 利用单因素试验探索了热激处理、预萌发时间、供体宿主菌的类型、供受比及MgCl_2浓度对链霉菌SH121接合转移效率的影响,结果显示:在50℃热激10min,37℃预萌发1h,以大肠杆菌DCDA/pUZ8002为供体宿主菌,在供受比为100∶1时,使用添加40mmol/L MgCl_2的培养基M-ISP4,接合转移效率最高可达到每受体1.03×10^(-3)个接合子。利用建立好的接合转移方法,将整合型质粒pSET152和基因敲除质粒pYZ09成功地导入链霉菌SH121,证实该方法可用于后期链霉菌SH121活性天然产物的挖掘及其相关生物合成基因簇的研究工作。 展开更多

关键词 肉色吸水链霉菌SH-121 接合转移 遗传操作 基因敲除

在线阅读 下载PDF 职称材料

马尾松纤维素合成酶基因PmCesA2的克隆及其植物表达载体的构建 被引量：1

13

作者 阮维程 郭天玮 +1 位作者 苏江 季孔庶 《林业科技开发》 北大核心 2015年第3期11-16,共6页

为了探究马尾松木材形成的分子机制,以马尾松嫩枝的总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松CesA2基因的全长cDNA序列(命名为Pm Ces A2),序列长度为3 500 bp,包含一个长为3 174 bp的开放阅读框(open reading... 为了探究马尾松木材形成的分子机制,以马尾松嫩枝的总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松CesA2基因的全长cDNA序列(命名为Pm Ces A2),序列长度为3 500 bp,包含一个长为3 174 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码1 057个氨基酸。序列分析表明:PmCesA2序列与已报道的火炬松Ces A2基因(AY789651.1)的相似性达98%。将全长基因克隆到载体p BI121质粒的Sna BI,Sac I双酶切位点之间,构建正义表达载体p BI121-PmCesA2。 展开更多

关键词 马尾松 纤维素合成酶基因 CDNA克隆 序列分析 植物表达载体 pBI121

在线阅读 下载PDF 职称材料

白颖苔草热激转录因子(HSF1)真核表达载体的构建 被引量：2

14

作者 孙彦 郭校民 周禾 《草业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期544-548,共5页

根据表达载体PBI 121特性及酶切位点设计合适的引物,由表达引物通过PCR技术从含有白颖苔草(Carex rigescens)CrHsf全长cDNA的克隆载体的大肠杆菌上扩增出带有特定酶切位点的CrHsf完整开放阅读框。再对载体和目的片段进行酶切处理,处理... 根据表达载体PBI 121特性及酶切位点设计合适的引物,由表达引物通过PCR技术从含有白颖苔草(Carex rigescens)CrHsf全长cDNA的克隆载体的大肠杆菌上扩增出带有特定酶切位点的CrHsf完整开放阅读框。再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后将正确的目的基因片段亚克隆至PBI 121植物表达载体。通过PCR及酶切鉴定,结果证明,目的基因片段已被正确克隆到表达载体上,载体构建成功。 展开更多

关键词 HSF基因 植物表达载体PBI121 构建

在线阅读 下载PDF 职称材料

Tmem121肝细胞特异性敲除小鼠模型的建立与鉴定

15

作者 王月 何国良 +2 位作者 李兰玉 吴倩 周军媚 《安徽医科大学学报》 2025年第9期1591-1598,共8页

目的建立并鉴定跨膜蛋白121(Tmem121)肝细胞特异性基因敲除小鼠。方法利用CRISPR/Cas9与Cre-loxp系统构建Tmem121^(flox/+)/Cre^(+)与Tmem121^(flox/flox)小鼠,再将两种小鼠进行杂交繁育获得后代小鼠。提取后代小鼠的鼠尾DNA,通过PCR鉴... 目的建立并鉴定跨膜蛋白121(Tmem121)肝细胞特异性基因敲除小鼠。方法利用CRISPR/Cas9与Cre-loxp系统构建Tmem121^(flox/+)/Cre^(+)与Tmem121^(flox/flox)小鼠,再将两种小鼠进行杂交繁育获得后代小鼠。提取后代小鼠的鼠尾DNA,通过PCR鉴定小鼠基因型,获得肝细胞特异性Tmem121基因敲除小鼠(Tmem121^(flox/flox)/Cre^(+),Tmem121^(ΔHep))。观察并分析敲除小鼠与对照小鼠的生长繁殖及器官发育情况。利用PCR及Western blot法验证Tmem121在小鼠原代肝细胞中敲除效率。利用CellMask^(TM)深红质膜染色法比较对照组小鼠与敲除组小鼠原代肝细胞的形态差异并进行统计学分析。结果通过小鼠基因型鉴定,成功获得Tmem121^(flox/flox)/Cre^(+)小鼠。敲除小鼠与对照小鼠在体质量、繁殖能力及肝脏的生长发育方面均无明显差异。肝细胞特异性敲除Tmem121基因对肝组织形态结构及病理特征无明显影响。与对照组相比,敲除组小鼠原代肝细胞Tmem121在mRNA及蛋白水平均明显降低(P<0.01)。CellMask^(TM)深红质膜染色结果显示Tmem121敲除组小鼠的原代肝细胞的双核比例增多(P<0.05),细胞表面积减小(P<0.001)。结论成功建立Tmem121肝细胞特异性基因敲除小鼠模型,为进一步研究Tmem121基因在肝脏疾病中的作用及机制提供了动物模型支持。 展开更多

关键词 跨膜蛋白121 特异性敲除 Cre/LoxP系统 肝细胞 基因型鉴定 原代肝细胞分离

在线阅读 下载PDF 职称材料