目的建立贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法。方法对比分析6株主要流行的GⅠ、GⅡ诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选保守区域引物,优化建立SYBR Green Ⅰ荧光定量检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证。结果引...目的建立贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法。方法对比分析6株主要流行的GⅠ、GⅡ诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选保守区域引物,优化建立SYBR Green Ⅰ荧光定量检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证。结果引物P289/290可同时检测GⅠ、GⅡ诺如病毒,SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法在病毒浓度10^3~10^9 copies 之间呈现良好的线性关系( R^2=0.993, P <0.01),熔解曲线Tm值可区分GⅠ和GⅡ不同基因群的诺如病毒( F = 7 507.60 , P <0.05 )。120份贝类样品阳性检出率5.83%,其中阳性结果测序鉴定与快速分群方法结论一致。结论该方法成本低、检测快速、分群准确,具有良好重复性,适用于贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒的快速检测与分群。展开更多
Ⅰ类内含子(group I intron)是研究RNAs结构与功能关系的理想元件,在解释RNA折叠理论、催化机制等方面起着重要作用;对其结构与功能关系的研究也因此成为一个非常重要的课题.本研究建立了一个基于卡那霉素抗性进行Ⅰ类内含子结构与功能...Ⅰ类内含子(group I intron)是研究RNAs结构与功能关系的理想元件,在解释RNA折叠理论、催化机制等方面起着重要作用;对其结构与功能关系的研究也因此成为一个非常重要的课题.本研究建立了一个基于卡那霉素抗性进行Ⅰ类内含子结构与功能关系研究系统,将源于海洋蓝细菌Nostoc punctiforme(Npu)核糖核酸还原酶基因(ribonucleotide reductase,Rir)中的1个Ⅰ类内含子插入到pDrive质粒的卡那霉素抗性基因(kanamycin resistance gene,KanR)内构建得pKR12质粒并转化大肠杆菌(E.coli).只有内含子剪接的阳性克隆才能生成KanR蛋白并在Kan抗性平板上生长.结果显示,pKR12转入E.coli后不能在Kan抗性平板上生长,RT-PCR检测仅可见前体带,表明插入到KanR中的Npu Rir内含子没有发生剪接.随后通过易错PCR建立内含子的随机突变库并用Kan抗性筛选进行定向演化,产生有剪接活性的内含子突变体,RT-PCR检测显示剪接发生.由于内含子剪接活性的改变可通过Kan抗性变化在LB平板上得以反映,因此该系统有望成为简单快速地研究Ⅰ类内含子结构与功能关系的有利工具.展开更多
文摘为了建立一种快速、特异、灵敏的检测I群禽腺病毒的液相基因芯片方法。根据Hexon基因序列设计特异引物,上游引物5'端加TAG序列,下游引物5'端加生物素,进行PCR扩增,将扩增产物与链霉素亲和蛋白、磁珠37℃孵育30 min,通过Luminex200仪器分析。用所建立的液相基因芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及病料样品的检测。结果该方法的特异性强;检测的敏感性可达1×102copies/μL;批内批间的变异系数都在5%以下;检测结果与SYBR Green I荧光PCR方法 100%相符。表明建立的液相基因芯片方法特异性好、灵敏高、重复性好,可用于I群禽腺病毒的检测。
文摘目的建立贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法。方法对比分析6株主要流行的GⅠ、GⅡ诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选保守区域引物,优化建立SYBR Green Ⅰ荧光定量检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证。结果引物P289/290可同时检测GⅠ、GⅡ诺如病毒,SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法在病毒浓度10^3~10^9 copies 之间呈现良好的线性关系( R^2=0.993, P <0.01),熔解曲线Tm值可区分GⅠ和GⅡ不同基因群的诺如病毒( F = 7 507.60 , P <0.05 )。120份贝类样品阳性检出率5.83%,其中阳性结果测序鉴定与快速分群方法结论一致。结论该方法成本低、检测快速、分群准确,具有良好重复性,适用于贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒的快速检测与分群。
