目的:观察激活G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大的影响,并探讨其可能的机制。方法:2~3日龄乳鼠心肌细胞体外原代培养。利用串联质谱标签(TMT)蛋白质谱技术检测蛋白表达差异,并作相关生物信息学分析,...目的:观察激活G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大的影响,并探讨其可能的机制。方法:2~3日龄乳鼠心肌细胞体外原代培养。利用串联质谱标签(TMT)蛋白质谱技术检测蛋白表达差异,并作相关生物信息学分析,筛查其可能的调节机制。机制研究分6组,空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+GPER1激活剂(G1)组、AngⅡ+G1+GPER1抑制剂(G15)组、AngⅡ+G1+细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂(U0126)组和AngⅡ+G1+丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)抑制剂(MK2206)组,各组n=3。检测各组心肌细胞GPER1的表达,心房钠尿肽(ANP)和B型利钠肽(BNP)的m RNA水平,ERK、AKT蛋白的表达及其相互作用,以及对自噬相关蛋白胞浆型自噬标记轻链3(LC3II)和膜型自噬标记轻链3(LC3I)的调控。流式细胞技术检测GPER1对细胞凋亡的影响。结果:AngⅡ诱导心肌细胞肥大呈浓度依赖性,ANP和BNP m RNA水平梯度升高(P<0.05)。细胞免疫荧光染色显示,心肌细胞上存在GPER1蛋白表达。荧光定量逆转录聚合酶链式反应(q RT-PCR)结果显示,激活剂G1激活GPER1,并以浓度依赖方式抑制心肌细胞ANP和BNP m RNA水平(P<0.05);在AngⅡ+G1+G15组,心肌细胞ANP和BNP m RNA水平重新升高(P<0.05)。蛋白免疫印迹法(Western-blot)结果显示,与空白对照组或AngⅡ组相比,AngⅡ+G1组p-ERK、p-AKT蛋白表达增强(P<0.05);与AngⅡ+G1组相比,AngⅡ+G1+G15组p-ERK和p-AKT蛋白表达降低(P<0.05),AngⅡ+G1+MK2206组p-ERK、p-AKT蛋白表达水平和ANP、BNP m RNA水平降低(P<0.05);AngⅡ+G1+U0126组对G1诱导的p-AKT蛋白的表达无影响。流式细胞技术显示,AngⅡ+G1组与AngⅡ组心肌细胞凋亡水平无差异(P>0.05)。AngⅡ组较空白对照组LC3II/LC3I比值增大,其自噬水平显著升高(P<0.01)。而AngⅡ+G1组较AngⅡ组LC3II/LC3I比值降低,其心肌细胞自噬水平降低(P<0.01)。结论:GPER1的激活抑制心肌细胞肥大,其作用机制可能与AKT和ERK信号通路以及细胞自噬相关。展开更多
目的:设计构建G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1,GIT1)野生型(WT)及点突变型(Y293F)慢病毒载体,探讨293位点对GIT1功能的影响。方法:用PCR从小鼠cDNA文库中扩增GIT1-WT,将其连接到...目的:设计构建G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1,GIT1)野生型(WT)及点突变型(Y293F)慢病毒载体,探讨293位点对GIT1功能的影响。方法:用PCR从小鼠cDNA文库中扩增GIT1-WT,将其连接到慢病毒载体PLJM-GFP中,构建质粒PLJM-GFP-GIT1-WT,测序鉴定。利用TaKaRa MutanBEST Kit试剂盒,对PLJM-GFP-GIT1-WT进行定点突变,构建质粒PLJM-GFP-GIT1-Y293F,测序鉴定。重组慢病毒载体转染包装细胞293T,获取病毒上清感染培养至第4代的小鼠成骨细胞。划痕愈合试验检测成骨细胞迁移能力的变化。结果:通过PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定,成功构建了PLJM-GFP-GIT1-WT与PLJM-GFP-GIT1-Y293F。划痕愈合试验观察,与PLJM-GFP-GIT1-WT相比,PLJM-GFP-GIT1-Y293F明显抑制成骨细胞迁移。结论:GIT1功能的正常发挥有赖于293位点适时的磷酸化。展开更多
文摘目的:观察激活G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大的影响,并探讨其可能的机制。方法:2~3日龄乳鼠心肌细胞体外原代培养。利用串联质谱标签(TMT)蛋白质谱技术检测蛋白表达差异,并作相关生物信息学分析,筛查其可能的调节机制。机制研究分6组,空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+GPER1激活剂(G1)组、AngⅡ+G1+GPER1抑制剂(G15)组、AngⅡ+G1+细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂(U0126)组和AngⅡ+G1+丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)抑制剂(MK2206)组,各组n=3。检测各组心肌细胞GPER1的表达,心房钠尿肽(ANP)和B型利钠肽(BNP)的m RNA水平,ERK、AKT蛋白的表达及其相互作用,以及对自噬相关蛋白胞浆型自噬标记轻链3(LC3II)和膜型自噬标记轻链3(LC3I)的调控。流式细胞技术检测GPER1对细胞凋亡的影响。结果:AngⅡ诱导心肌细胞肥大呈浓度依赖性,ANP和BNP m RNA水平梯度升高(P<0.05)。细胞免疫荧光染色显示,心肌细胞上存在GPER1蛋白表达。荧光定量逆转录聚合酶链式反应(q RT-PCR)结果显示,激活剂G1激活GPER1,并以浓度依赖方式抑制心肌细胞ANP和BNP m RNA水平(P<0.05);在AngⅡ+G1+G15组,心肌细胞ANP和BNP m RNA水平重新升高(P<0.05)。蛋白免疫印迹法(Western-blot)结果显示,与空白对照组或AngⅡ组相比,AngⅡ+G1组p-ERK、p-AKT蛋白表达增强(P<0.05);与AngⅡ+G1组相比,AngⅡ+G1+G15组p-ERK和p-AKT蛋白表达降低(P<0.05),AngⅡ+G1+MK2206组p-ERK、p-AKT蛋白表达水平和ANP、BNP m RNA水平降低(P<0.05);AngⅡ+G1+U0126组对G1诱导的p-AKT蛋白的表达无影响。流式细胞技术显示,AngⅡ+G1组与AngⅡ组心肌细胞凋亡水平无差异(P>0.05)。AngⅡ组较空白对照组LC3II/LC3I比值增大,其自噬水平显著升高(P<0.01)。而AngⅡ+G1组较AngⅡ组LC3II/LC3I比值降低,其心肌细胞自噬水平降低(P<0.01)。结论:GPER1的激活抑制心肌细胞肥大,其作用机制可能与AKT和ERK信号通路以及细胞自噬相关。
文摘目的:设计构建G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1,GIT1)野生型(WT)及点突变型(Y293F)慢病毒载体,探讨293位点对GIT1功能的影响。方法:用PCR从小鼠cDNA文库中扩增GIT1-WT,将其连接到慢病毒载体PLJM-GFP中,构建质粒PLJM-GFP-GIT1-WT,测序鉴定。利用TaKaRa MutanBEST Kit试剂盒,对PLJM-GFP-GIT1-WT进行定点突变,构建质粒PLJM-GFP-GIT1-Y293F,测序鉴定。重组慢病毒载体转染包装细胞293T,获取病毒上清感染培养至第4代的小鼠成骨细胞。划痕愈合试验检测成骨细胞迁移能力的变化。结果:通过PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定,成功构建了PLJM-GFP-GIT1-WT与PLJM-GFP-GIT1-Y293F。划痕愈合试验观察,与PLJM-GFP-GIT1-WT相比,PLJM-GFP-GIT1-Y293F明显抑制成骨细胞迁移。结论:GIT1功能的正常发挥有赖于293位点适时的磷酸化。
