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非洲猪瘟基因Ⅰ/Ⅱ型重组病毒疫苗研究进展
1
作者 戈胜强 吕艳 +10 位作者 左媛媛 于家荣 殷磊 韩秀琚 王筱真 刘珊 郑辉 王晓华 李金明 魏荣 王志亮 《中国动物检疫》 2025年第3期72-76,共5页
非洲猪瘟病毒(ASFV)重组事件在临床中并不是偶然现象,它是造成ASFV遗传多样性的原因之一,但是以基因Ⅰ型和基因Ⅱ型为母本病毒,发生“嵌合式重组”尚属首次发现。目前,对于中国、越南和俄罗斯报道的重组毒均已开展过攻毒试验,证实重组... 非洲猪瘟病毒(ASFV)重组事件在临床中并不是偶然现象,它是造成ASFV遗传多样性的原因之一,但是以基因Ⅰ型和基因Ⅱ型为母本病毒,发生“嵌合式重组”尚属首次发现。目前,对于中国、越南和俄罗斯报道的重组毒均已开展过攻毒试验,证实重组毒致病力较强且同居感染能力较强。同时中国和越南实验室均对重组毒进行了在研/在售疫苗的攻毒保护评价,证实基因Ⅱ型弱毒疫苗不能抵御重组毒攻击,这对ASFV重组病毒疫苗研究提出了新的挑战。本文通过总结已发表的ASFV重组毒动物实验数据,进一步分析该病毒感染特点,总结该病毒疫苗研究进展,以期为国内相关研究和防控措施制定提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 重组病毒 疫苗研发
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非洲猪瘟病毒H108R蛋白的制备及其免疫原性评价
2
作者 张越 茹毅 +7 位作者 郝荣增 杨锐 赵陇和 李亚军 杨洋 张荣 蒋成辉 郑海学 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1344-1354,共11页
本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化... 本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化后经IPTG诱导表达,用镍亲和层析纯化目标蛋白质。免疫小鼠利用流式细胞术检测脾脏活化的CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞,分离小鼠血清测定特异性抗体滴度,利用Western blot和IFA鉴定多克隆抗体的特异性。并用试剂盒检测血清中细胞因子含量,将血清与ASFV-GFP病毒孵育评估抗体是否能抑制病毒的复制。生物信息学分析表明H108R蛋白为亲水性蛋白质,有跨膜区,无信号肽,蛋白二三级结构中存在较多α-螺旋。SDS-PAGE、Western blot显示IPTG诱导后,成功表达纯化H108R蛋白。蛋白免疫小鼠后能够诱导小鼠脾脏T细胞的活化,刺激机体产生更高水平的细胞因子。免疫制备的多克隆抗体效价为1∶128000,能与ASFV-GFP病毒特异性结合,与病毒孵育后能明显抑制病毒的复制。本研究成功表达制备了ASFV H108R蛋白,免疫能够诱导脾脏T淋巴细胞活化,引起细胞因子水平升高,制备的多克隆抗体能够明显抑制病毒的复制,具有较好的免疫原性,为深入研究H108R蛋白的生物学功能及疫苗研究奠定基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(asfv) H108R蛋白 多克隆抗体 免疫原性
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非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定
3
作者 王小格 司煊瑛 +8 位作者 闫志伟 王飞 尤龙琪 刘梗 蔡茂 梁珺珹 梁玉秀 杜永坤 张改平 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第2期781-791,共11页
[目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重... [目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重组蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合制备单克隆抗体。通过Western blotting鉴定单克隆抗体特异性,通过ELISA方法测定腹水效价;利用在线软件预测p22蛋白抗原表位分布情况并合成重叠多肽,通过Dot blotting鉴定抗体识别的抗原表位。[结果]本研究成功构建了p22重组蛋白的原核表达质粒,获得原核系统表达的p22重组蛋白,分子质量约为22 ku。用纯化后p22蛋白作为免疫原免疫小鼠,成功筛选到4株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别为1G3D7G11、2G5H6H8、6D10G7D6和8F6F8B9,其腹水效价均达到1∶500 000。Western blotting结果显示,4株单克隆抗体均能与p22蛋白发生特异性反应。单克隆亚型鉴定结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8和6D10G7D6株单克隆抗体的重链均为IgG1类,8F6F8B9株单克隆抗体的重链为IgG2a类,4株单克隆抗体轻链均为Kappa型。Dot blotting检测结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8株单克隆抗体识别抗原表位位于第58—89位氨基酸处;8F6F8B9株单克隆抗体识别抗原表位位于第126—150位氨基酸处。[结论]本研究成功制备了4株ASFV p22蛋白的单克隆抗体,并初步鉴定了单克隆抗体所识别的B细胞表位区间。研究结果为p22蛋白的生物学功能研究和ASFV血清学检测提供了参考依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p22蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒p72蛋白抗体全自动化学发光酶免疫检测方法的建立
4
作者 马晓莉 李段 +6 位作者 曾道平 刘燕玲 王晓敏 彭国良 宋长绪 王磊 徐铮 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1355-1365,共11页
抗体检测对于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染诊断和疫苗研究至关重要,因此建立一种基于ASFV p72蛋白抗体的全自动化学发光酶免疫分析方法(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)具有重要意义。本研究以重组p7... 抗体检测对于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染诊断和疫苗研究至关重要,因此建立一种基于ASFV p72蛋白抗体的全自动化学发光酶免疫分析方法(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)具有重要意义。本研究以重组p72蛋白偶联的磁微粒(magnetic particles,MPs)捕获p72蛋白抗体,再结合碱性磷酸酶(alkaline phosphates,AP)标记的p72蛋白,借助全自动化学发光分析仪,分析猪血清中p72蛋白特异性抗体水平。经反应条件优化,建立了一种ASFV p72蛋白抗体全自动化学发光酶免疫检测方法。结果显示,建立的CLEIA阴性、阳性临界值为9.505 U·mL^(-1),诊断特异性和灵敏性分别为98.33%和100%,与其他猪病原阳性血清无交叉反应,批内和批间变异系数分别小于5%和10%,各种试剂组分可以保存6个月以上,对ASFV阳性标准血清,分析敏感性为1∶12800,与国产商品化试剂盒的总符合率达95.90%。综上,本研究建立的化学发光方法具有高灵敏性和可重复性,有自动化检测、操作步骤简单的优势,可为ASFV的检测提供新的技术支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p72 化学发光酶免疫 抗体检测
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非洲猪瘟病毒结构蛋白与宿主蛋白相互作用研究进展
5
作者 张素 孙丽芳 +3 位作者 李兰兰 吴琳娇 陈磊清 吴允昆 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第1期95-106,共12页
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染所引起的一种家猪和各种野猪急性出血的传染性疾病,由于高发病率和高致死性的特性对全球家猪养殖产业造成严重的经济损失。ASFV编码蛋白高达... 非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染所引起的一种家猪和各种野猪急性出血的传染性疾病,由于高发病率和高致死性的特性对全球家猪养殖产业造成严重的经济损失。ASFV编码蛋白高达150多种,而ASFV结构蛋白作为病毒粒子的主要组成部分,在协助病毒吸附入侵宿主细胞、促进子代病毒颗粒复制、组装以及释放等过程发挥着重要作用。研究表明,病毒结构蛋白可通过与宿主蛋白的相互作用,促进病毒入侵、增殖、影响病毒毒力以及拮抗宿主免疫反应等。因此,本文通过概述ASFV结构蛋白与宿主蛋白的相互作用及其机制,为研究ASFV的致病机制以及ASF的防治提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 结构蛋白 宿主蛋白 蛋白相互作用
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非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型多基因靶标核酸质谱鉴别检测方法的建立
6
作者 高志强 赖平安 +7 位作者 白子龙 汪琳 郭悠然 蒲静 任彤 史喜菊 赵相鹏 郭惠民 《中国动物检疫》 2025年第3期84-90,共7页
为研制一种快速多位点鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)基因Ⅰ型和Ⅱ型的核酸检测方法,对ASFV基因Ⅰ型和Ⅱ型B646L(VP72)、EP402R(CD2v)以及MGF110-9L基因序列进行多重比对,针对其中7个位点分别设计扩增引物延伸引物,组合使用微量多重PCR、单碱... 为研制一种快速多位点鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)基因Ⅰ型和Ⅱ型的核酸检测方法,对ASFV基因Ⅰ型和Ⅱ型B646L(VP72)、EP402R(CD2v)以及MGF110-9L基因序列进行多重比对,针对其中7个位点分别设计扩增引物延伸引物,组合使用微量多重PCR、单碱基延伸以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF),建立了一种可同步检测ASFV 7个位点的核酸飞行质谱检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评价,并与荧光PCR进行了临床样品检测比对。结果显示:建立的方法可基于多个靶位同步鉴别检测ASFV基因Ⅰ型、Ⅱ型,最低检测限分别为14.77 copies/μL和15.66 copies/μL,与其他常见猪病病原核酸无交叉反应,且重复性良好;对52份临床样品检测,检出率与荧光PCR检测结果完全一致,其中检出7份基因Ⅱ型阳性,1份基因Ⅰ型和Ⅱ型重组病毒阳性。本研究为ASFV的快速检测及同步基因分型鉴定提供了一种新的高通量替代方法。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 多基因靶标 核酸质谱
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非洲猪瘟基因Ⅰ型/Ⅱ型重组病毒研究现状及思考 被引量：1
7
作者 戈胜强 沙洲 +7 位作者 郑辉 刘春菊 左媛媛 胡永新 王晓华 刘爽 魏荣 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2024年第3期68-72,共5页
基因重组在非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组间广泛存在,它是造成ASFV遗传多样性的原因之一。ASFV基因Ⅱ型毒株2018年传入我国,2021年国内又报道发现基因Ⅰ型毒株和基因Ⅰ型/Ⅱ型重组病毒。我国分离的ASFV基因Ⅰ型/Ⅱ型重组毒嵌合了两个基因型... 基因重组在非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组间广泛存在,它是造成ASFV遗传多样性的原因之一。ASFV基因Ⅱ型毒株2018年传入我国,2021年国内又报道发现基因Ⅰ型毒株和基因Ⅰ型/Ⅱ型重组病毒。我国分离的ASFV基因Ⅰ型/Ⅱ型重组毒嵌合了两个基因型序列并部分整合了二者的生物学特性,毒力与基因Ⅱ型强毒株相当,某些致病指标甚至更高;基因Ⅱ型减毒活疫苗株不能对该重组毒株产生有效保护。该重组毒株在国内的流行演变可能会显著影响ASFV的进化方向,并对ASFV疫苗研究带来新的挑战。本文通过对国内ASFV基因Ⅰ型/Ⅱ型重组病毒进行综述,就相关研究进展进行总结归纳,以期为我国ASF防控提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 重组病毒 疫苗研发
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非洲猪瘟病毒弱毒株感染流行病学调查分析
8
作者 李秀英 张立成 +7 位作者 逯玉 傅义娟 炊文婷 张燕 应兰 黄龙 宋长芳 杨峻鹏 《青海畜牧兽医杂志》 2024年第5期60-61,共2页
调查青海省非洲猪瘟病毒弱毒株感染情况并分析疫情风险,可提升青海省对非洲猪瘟的防控预警水平,为有效防控非洲猪瘟提供技术依据。通过现场问卷调查和监测的方式,在生猪养殖量较集中的西宁市、海东市及环湖沿线部分农区县(市、区)开展... 调查青海省非洲猪瘟病毒弱毒株感染情况并分析疫情风险,可提升青海省对非洲猪瘟的防控预警水平,为有效防控非洲猪瘟提供技术依据。通过现场问卷调查和监测的方式,在生猪养殖量较集中的西宁市、海东市及环湖沿线部分农区县(市、区)开展非洲猪瘟病毒弱病毒感染情况流行病学调查工作。结果显示,2023年生猪非瘟阳性率为0.10%,环境监测阳性率为1.85%。病毒环境污染面较广,生猪及其产品的生产、调运、屠宰及市场交易等环节防控工作仍然存在薄弱之处,亟待改善。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 病毒弱毒株 流行病学调查 分析
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非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析 被引量：1
9
作者 李艳蕊 任静 +6 位作者 崔锦蔷 袁晨 王云霄 马亚娟 刘志昌 李永社 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1660-1670,共11页
【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组... 【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P<0.05)。【结论】本研究表达了ASFV CD2v蛋白胞内域和胞外域,前者的抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(asfv) CD2v蛋白 胞外域 胞内域 蛋白表达 抗原性
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非洲猪瘟病毒致病机制及防治策略研究进展 被引量：2
10
作者 王美乐 于扬帆 +6 位作者 徐朋 陈青 安珂兰·安维尔 李姝璇 杨松华 尹素改 冯书营 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期3041-3055,共15页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种急性、出血性、高度接触性的烈性传染病,对世界养猪业和食品安全产生了巨大的负面影响,目前仍无商品化疫苗和特效药物。其病原体非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是一种大型、结... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种急性、出血性、高度接触性的烈性传染病,对世界养猪业和食品安全产生了巨大的负面影响,目前仍无商品化疫苗和特效药物。其病原体非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是一种大型、结构复杂的双链DNA病毒,但80%的编码蛋白功能未知,因此其致病机制及药物研究现状对防控具有重要意义。作者概述了ASFV的病原体特征、传播途径及其引起的临床表现;从病毒入侵过程、免疫细胞功能改变及其相关通路变化等方面梳理了病毒致病机制的最新进展;介绍了ASFV的最新检测技术及疫苗新进展;系统总结了最新的中西药治疗研究现状,并对中药防治ASFV的未来前景进行展望,提出了未来重点研究方向和相关问题解决策略,以期为ASF的治疗提供借鉴和指导。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(asfv) 致病机制 预防措施 中药
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非洲猪瘟病毒D1133 L蛋白单克隆抗体抑制其复制 被引量：1
11
作者 闫文倩 侯景 +12 位作者 杨金柯 郝雨 杨行 史喜绢 张大俊 别鑫恬 陈国辉 陈玲玲 何路 赵美玉 赵思越 郑海学 张克山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期854-859,共6页
旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT... 旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D1133 L蛋白 单克隆抗体
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非洲猪瘟病毒B602L蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备
12
作者 郭晨云 宋金星 +5 位作者 王梦翔 孙俊如 闫若潜 谢彩华 吴亚楠 张改平 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期3980-3989,共10页
【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是对生猪养殖业危害极大的一种病原体,B602L蛋白作为其重要的非结构蛋白,是衣壳蛋白p72折叠为正确的三级结构的伴侣分子之一,在病毒组装成二十面体结构的过程中发挥着关键作用。... 【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是对生猪养殖业危害极大的一种病原体,B602L蛋白作为其重要的非结构蛋白,是衣壳蛋白p72折叠为正确的三级结构的伴侣分子之一,在病毒组装成二十面体结构的过程中发挥着关键作用。特异性抗体对于抗非洲猪瘟免疫应答机制及血清学检测方法研究具有重要意义,本研究旨在获取ASFV B602L蛋白,并制备抗ASFV B602L蛋白的多克隆抗体,为ASFV B602L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】以ASFV China/2018/AnhuiXCGQ株的B 602 L基因为研究对象,应用生物信息学软件对B602L蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、抗原性和蛋白结构进行分析后,利用同源重组的方法将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得B602L重组蛋白,利用镍柱亲和层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting对B602L蛋白纯化效果进行验证。将纯化后的B602L蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,通过Western blotting和Dot blotting检测多克隆抗体特异性。【结果】生物信息学分析表明,B602L蛋白属于稳定性亲水蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(54.91%)、延伸链(9.81%)和无规则卷曲(32.08%)。成功构建了ASFV B602L重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组菌pET-28a-B602L-BL21在16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导下高效表达,获得的重组蛋白主要表达在BL21菌株上清中,大小约为70 ku,且能与ASFV阳性血清特异性结合。间接ELISA检测结果显示,制备的抗B602L鼠源多克隆抗体效价达1∶409600,Western blotting和Dot blotting试验结果表明,抗B602L鼠源多克隆抗体能够特异性识别B602L蛋白。【结论】原核表达的B602L重组蛋白具有良好的免疫原性,能够与ASFV阳性血清特异性结合,制备的鼠抗ASFV B602L蛋白多克隆抗体具备较好的生物学活性。本试验结果可为进一步研究ASFV B602L蛋白的生物学功能和非洲猪瘟诊断方法的建立提供生物材料和理论支撑。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(asfv) B602L蛋白 原核表达 多克隆抗体
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非洲猪瘟病毒P54蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立
13
作者 王程 夏应菊 +1 位作者 王海东 刘业兵 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4440-4449,共10页
【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P... 【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P54,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的P54蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种间接ELISA方法,对包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育等反应条件进行优化后,对其临界值、特异性、灵敏性和重复性进行验证。【结果】SDS-PAGE结果显示,P54蛋白分子质量为42 ku,纯度在95%以上;Western blotting结果显示,P54蛋白与ASFV阳性血清能产生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为:0.3125μg/mL抗原37℃包被1 h,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,1∶800稀释的血清37℃孵育2 h,1∶15000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h。该ELISA检测方法仅与ASFV阳性血清产生特异性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和乙型脑炎病毒的阳性血清均无明显交叉反应;该方法灵敏性较高,ASFV阳性血清稀释度为1∶3200时仍有明显反应。批间重复和批内重复变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其阳性符合率为95.45%,阴性符合率为96.05%,总符合率为95.83%。【结论】本研究建立了一种以ASFV P54蛋白为检测抗原的ASFV间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于ASFV的血清学检测,为非洲猪瘟的快速诊断提供更多选择。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(asfv) 间接ELISA方法 P54蛋白 原核表达
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非洲猪瘟病毒对宿主自噬作用研究进展 被引量：1
14
作者 岳怀宁 任静 刘业兵 《中国兽药杂志》 2024年第8期80-86,共7页
自噬是真核细胞一种非常保守的溶酶体对蛋白质和细胞器降解过程。自噬的主要作用机制是饥饿时降解蛋白质等提供能量保持机体能量守恒、清除损伤衰老的细胞器和错误折叠的蛋白质以及吞噬入侵机体的病原体等,在维持细胞稳态、宿主代谢等... 自噬是真核细胞一种非常保守的溶酶体对蛋白质和细胞器降解过程。自噬的主要作用机制是饥饿时降解蛋白质等提供能量保持机体能量守恒、清除损伤衰老的细胞器和错误折叠的蛋白质以及吞噬入侵机体的病原体等,在维持细胞稳态、宿主代谢等方面发挥着重要的作用。非洲猪瘟是一种急性、高致死性的疾病,目前尚无有效的商品化疫苗或者药物可用于防治非洲猪瘟。研究发现非洲猪瘟部分基因会抑制自噬反应的发生,从而抑制先天免疫反应。缺失这些基因的毒株不仅毒力降低,而且感染宿主后会促进自噬反应引起强烈的免疫反应。因此研究非洲猪瘟病毒与自噬的作用机制,对非洲猪瘟病毒疫苗的研发具有重要作用。从细胞自噬以及非洲猪瘟病毒部分基因对自噬的影响两个方面进行概述,以期为非洲猪瘟自噬作用机制研究和非洲猪瘟疫苗研发提供理论支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 巨自噬 自噬作用
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非洲猪瘟病毒pE120R蛋白单克隆抗体的制备
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作者 刘传霞 王晓 +5 位作者 李雪雯 鲍苗菲 李婷婷 陈欣 翁长江 郑君 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期388-394,共7页
本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)衣壳蛋白pE120R,并制备单克隆抗体,为其功能研究提供材料。以pCAGGS-Flag-pE120R为模板扩增pE120R基因片段,构建原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达为可溶性pE... 本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)衣壳蛋白pE120R,并制备单克隆抗体,为其功能研究提供材料。以pCAGGS-Flag-pE120R为模板扩增pE120R基因片段,构建原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达为可溶性pE120R蛋白,采用GST Beads纯化pE120R蛋白,免疫BALB/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA方法筛选获得了1株能够稳定分泌pE120R单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建了原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R,并获得较高纯度的pE120R蛋白。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果显示,pE120R单抗能特异性识别HEK293T细胞转染质粒表达的Flag-pE120R蛋白和肺泡巨噬细胞(PAMs)感染ASFV后表达的pE120R蛋白。该单抗的结合位点在30~60aa区域,并且该单抗亚类鉴定重链为IgG2a。本研究成功表达并纯化了可溶性的pE120R蛋白;制备了抗pE120R的单抗隆抗体,该抗体具有良好的特异性,为深入探讨ASFV pE120R蛋白的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 pE120R蛋白 原核表达 单抗隆抗体
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改良育阴方对非洲猪瘟病毒感染PAMs的cGAS-STING通路影响
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作者 陈晓丽 周佳浩 +7 位作者 周静 屈倩 王志华 熊鹰 朱咏琪 贾伟新 吕伟杰 郭世宁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5839-5853,共15页
旨在为评价中药体外对非洲猪瘟病毒的抑制作用,本研究将5种试验用药:连翘、马勃、改良育阴方(modified Yuyin decoction,MYY)、复方鱼腥草(复方2)和银翘马勃散(复方3),通过qPCR检测不同中药在被非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,... 旨在为评价中药体外对非洲猪瘟病毒的抑制作用,本研究将5种试验用药:连翘、马勃、改良育阴方(modified Yuyin decoction,MYY)、复方鱼腥草(复方2)和银翘马勃散(复方3),通过qPCR检测不同中药在被非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染的猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)中,对ASFV编码的衣壳蛋白p72的影响,筛选出可以显著降低ASFV-p 72基因表达的中药为改良育阴方(MYY)。采用LC-MS分析检测出改良育阴方的主要化学成分;采用CCK8法观察改良育阴方对猪肺泡巨噬细胞(PAMs)活力的影响;荧光定量PCR检测ASFV-p 72基因的表达;Western blot和ELISA检测CGAS-STING信号通路蛋白表达水平;RU.521作为cGAS抑制剂用于验证MYY在cGAS-STING通路中对ASFV的作用。结果表明,在PAMs中,MYY可以显著降低ASFV-p 72基因表达,在ASFV感染2 h给药效果最佳,对ASFV感染PAMs后的细胞活力具有浓度依赖性改善作用。攻毒后2 h,使用MYY发现PAMs细胞上清液中干扰素基因刺激蛋白(STING)、TANK结合激酶1(TBK1)、干扰素调节因子3(IRF3)、干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)表达量的下降,PAMs细胞内环状GMP-AMP合成酶(cGAS)、干扰素β(IFNβ)蛋白量表达增加,MYY可激活cGAS-STING-TBK1-IRF3-IFNβ信号通路,促进IFITM3的表达。经RU.521处理后,MYY仍能提高细胞活力,降低ASFV-p 72基因的表达。综上所述,MYY具有抑制ASFV的潜在作用,可能与cGAS-STING信号通路的激活促进IFITM3的表达有关。 展开更多
关键词 改良育阴方 非洲猪瘟病毒 asfv-p 72基因 CGAS-STING信号通路 LC-MS分析
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非洲猪瘟病毒抗体化学发光检测方法的建立与应用
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作者 向国庆 孙菁晗 +6 位作者 宋帅 温肖会 吕殿红 贾春玲 牛瑞辉 顾有方 罗胜军 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1362-1371,共10页
【目的】建立一种特异性强、敏感度高、操作简捷、高通量的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体化学发光检测方法,用于早期监测ASFV的流行情况。【方法】本研究以羧基磁珠作为固相载体偶联ASFV重组p72蛋白,用适量的牛血清白蛋白... 【目的】建立一种特异性强、敏感度高、操作简捷、高通量的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体化学发光检测方法,用于早期监测ASFV的流行情况。【方法】本研究以羧基磁珠作为固相载体偶联ASFV重组p72蛋白,用适量的牛血清白蛋白(BSA)进行封闭,加入检测样品进行反应,以兔抗猪IgG-AP抗体作为酶标抗体,加入相应底物进行显色,优化各项反应条件,建立ASFV抗体化学发光检测方法,并对该方法的特异性、敏感度、重复性和检出率进行验证。【结果】建立的ASFV抗体化学发光检测方法蛋白与羧基磁珠偶联最适pH为7.0,最佳蛋白偶联浓度为5μg/mL,使用10%BSA溶液封闭效果最佳,反应磁珠终浓度为1.00 mg/mL,酶标二抗最佳工作稀释度为1∶40000。同时该方法反应时间为30 min,血清稀释度为1∶512,敏感度高于商品化ASFV抗体ELISA检测试剂盒,与猪瘟病毒、A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒gE、猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性标准血清均无交叉反应。重复性试验中,批内变异系数为4.41%~8.70%,批间变异系数为2.43%~8.07%,均<10%。通过检测120份血清样品并与商业化ASFV抗体ELISA检测试剂盒进行对比分析,商业化ELISA试剂盒检出率为96.7%,本研究建立的化学发光检测方法检出率为100%。【结论】本研究建立的ASFV抗体化学发光检测方法可用于ASFV感染后抗体水平检测,为后续试剂盒的开发提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(asfv) 重组p72蛋白 化学发光 抗体
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基于酶促重组酶扩增的非洲猪瘟病毒检测方法
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作者 冯露 田宏 +7 位作者 郑海学 石正旺 罗俊聪 张晓阳 尉娟娟 周静 廖焕程 王婉莹 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期4226-4231,共6页
建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件... 建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。结果显示:建立的ERA检测ASFV方法特异性强与其它病原无交叉反应;CV均小于10%,具有良好的重复性;对阳性样品拷贝数的检测下限为85 copies·μL^(-1);与世界动物卫生组织(WOAH)非洲猪瘟qPCR诊断方法对比,Kappa值为0.961,具有高度一致性。本研究建立的基于ERA检测ASFV方法可以用于ASFV的现场快速检测。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 ERA 核酸检测 等温扩增
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野生型非洲猪瘟病毒多重数字PCR方法的建立
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作者 李松达 蒋亚君 +5 位作者 庞忠宝 黄颖 翟文竹 朱鸿飞 赵晓民 贾红 《动物医学进展》 北大核心 2024年第4期32-39,共8页
为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,d... 为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并对方法的特异性、灵敏性及重复性进行评估。结果显示,优化后的多重荧光定量PCR检测方法的标准曲线线性关系良好,对PRRSV、PEDV、PRV、VSV、PCV、RNase-free水、重组质粒标准品进行特异性检测,特异性良好;重复性试验结果显示,变异系数均小于2%;对3种重组质粒的最低检测下限均为102 copies/μL。参照上述多重荧光定量PCR方法优化后的条件,进行多重ddPCR检测方法的建立,并且对该方法进行评价。结果显示,ddPCR检测方法标准曲线的线性关系良好;特异性及重复性良好;最低检测下限B646L为11.6 copies/μL、EP402R为13.3 copies/μL、DP96R为16.9 copies/μL;ddPCR的检测灵敏度比荧光定量PCR有优势。使用建立的多重ddPCR方法对14份P3实验室中的样品进行实验室样品检测,样品检测符合率达到100%。成功建立了能够同时检测用于鉴别野毒株感染与疫苗株的荧光定量PCR和微滴式ddPCR方法。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 多重荧光定量PCR 微滴式数字PCR
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非洲猪瘟病毒的感染与排毒研究进展
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作者 吴菲 李芳韬 +2 位作者 朱元源 赵启祖 邹兴启 《中国兽药杂志》 2024年第9期76-83,共8页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的急性、热性传染病,发病快,病死率高。目前并无安全有效的商业化疫苗和抗病毒药物,只能对感染动物进行扑杀,要减少经济损失,必然要求尽早扑灭... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的急性、热性传染病,发病快,病死率高。目前并无安全有效的商业化疫苗和抗病毒药物,只能对感染动物进行扑杀,要减少经济损失,必然要求尽早扑灭疫情,掌握感染宿主的传播途径、临床症状与带毒排毒规律有助于疫情早发现。ASFV的感染途径多样,主要包括直接接触、间接接触以及通过钝缘软蜱等传播。临床中ASF表现为急性、亚急性、慢性症状,不同临床症状表现导致排毒时间、带毒持续时间及病毒载量的差异。研究病毒传播途径、临床症状与所感染毒株毒力关系,不同宿主感染性差异有助于全面认识ASF,有助于ASF防控。本文主要针对ASF的感染途径、不同毒株感染后的临床表现以及带毒排毒规律等方面进行综述,对病毒早期的诊断、监测具有参考意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 临床症状 感染 带毒 排毒
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