空肠弯曲菌中规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)的检测与结构分析 被引量：2

1

作者 吴瑜凡 申进玲 +4 位作者 崔思宇 郭旸 吴福平 王翔 邵景东 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第24期139-144,共6页

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传... 规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传信息的可追溯性,成为分子分型方法的理想位点。本研究对江苏地区分离的86株空肠弯曲菌基因组进行CRISPR结构的检测和分析。结果表明:36%的菌株基因组含有CRISPR结构,32株含有确定CRISPR结构的菌株均只含有1个CRISPR结构,CRISPR序列长度范围为92～366 bp;重复序列与数据库中出现频率最高的重复序列一致;识别到的间隔序列共111条,共分为17种类型,有10种类型的间隔序列与CRISPR DB数据库中公布的一致,有7种间隔序列为新报道的间隔序列,共55条,占总间隔序列的49.5%。通过同源性比对发现,间隔序列除与来自同属同种的质粒或噬菌体具有同源性外,有些还与其他致病菌的质粒或噬菌体具有同源性,这种现象说明空肠弯曲菌与其他致病菌可能存在基因的水平转移等信息交流方式。另外,通过CRISPR结构间隔序列的多样性,可以将38株空肠弯曲菌野生菌株分为5种不同的谱型。研究结果为空肠弯曲菌利用CRISPR结构进行分型和溯源提供数据基础。 展开更多

关键词 空肠弯曲菌 成簇的规律间隔短回文重复序列(crispr) 重复序列 间隔序列 同源性

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陕西省鼠疫耶尔森菌间区规律短回文重复序列基因分型研究及流行病学分析 被引量：3

2

作者 聂守民 罗波艳 +4 位作者 孙养信 范锁平 常文辉 孙杰 安翠红 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期182-186,共5页

目的通过CRISPR(间区规律短回文重复序列)对陕西省鼠疫菌进行基因分型,分析流行病学特征,为陕西省鼠疫防治工作提供科学依据。方法提取分离自陕西省鼠疫疫源地的66株鼠疫菌核酸,利用针对鼠疫菌的3对CRISPR引物进行PCR扩增,对扩增产物进... 目的通过CRISPR(间区规律短回文重复序列)对陕西省鼠疫菌进行基因分型,分析流行病学特征,为陕西省鼠疫防治工作提供科学依据。方法提取分离自陕西省鼠疫疫源地的66株鼠疫菌核酸,利用针对鼠疫菌的3对CRISPR引物进行PCR扩增,对扩增产物进行测序及分析,确定CRISPR基因分型。结果 66株鼠疫菌在3个位点上共有12种spacer,其中YPa 3种、YPb 5种、YPc 4种,具体为al′、a2′、a3′、b1′、b2′、b29′、b1″、b2″、c1、c2、c3、c3′,基因簇为Cb2′,基因型分为1′和4′两种。结论疫情发生年份不同,鼠疫菌CRISPR基因型不同,鼠疫疫情处置进行溯源应将生态分型与基因分型结合。 展开更多

关键词 陕西 鼠疫菌 间区规律短回文重复序列(crispr) 流行病学

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成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术研究进展 被引量：3

3

作者 单琳琳 夏海滨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期856-862,共7页

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾... 成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾病模型的建立、疾病快速诊断、肿瘤及免疫相关性疾病的治疗等方面取得了重大进展和突破。我们重点对CRISPR/CRISPR相关蛋白(Cas)技术的发展现状及其在生物医学领域的应用进展进行综述,并对其未来应用前景和发展方向进行讨论和展望。 展开更多

关键词 成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr) crispr相关蛋白(Cas) 基因编辑 基因诊断 基因治疗 综述

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基于CRISPR对大肠埃希菌O157∶H7的检测 被引量：5

4

作者 梁文娟 张荣光 +6 位作者 段广才 王颖芳 洪丽娟 张冰 王鹏飞 郗园林 杨海燕 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期748-753,共6页

目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）,建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌（310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌）的CRISPR1和CRI... 目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）,建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌（310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌）的CRISPR1和CRISPR2,并将PCR产物测序;提取CRISPR database数据库中（标准法）100株肠道细菌（47株非O157∶H7大肠埃希菌、5株大肠埃希菌O157∶H7、9株志贺菌和39株沙门菌）的CRISPR1和CRISPR2序列。使用CRISPR Finder在线软件分析PCR产物测序序列和CRISPR database数据库的CRISPR序列。Clustal X软件进行间隔序列比对。比较标准法和PCR扩增CRISPR两种方法检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性。结果共分析543株肠道细菌,其中75.6%的非O157∶H7大肠埃希菌、75.5%志贺菌、91.7%沙门菌和95%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR1,其间隔序列数目为3～26、2～9、2～32、3。57.1%的非O157∶H7大肠埃希菌、77.6%志贺菌、85.4%沙门菌和100%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR2,其间隔序列数目为1～20、1～6、2～27、1或4个。95%的O157∶H7大肠埃希菌的CRISPR1和90%CRISPR2分别含有3条独特间隔序列（S1-1,S1-2,S1-3）和1条独特间隔序列（S2-1）。间隔序列比对结果显示,S1-1＋S1-2＋S1-3和S2-1检测O157∶H7大肠埃希菌的特异性分别是100%和99.6%。标准法检测和PCR扩增CRISPR1和CRISPR2检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性分别达99.6%和99.3%。基于CRISPR检测大肠埃希菌O157∶H7在模拟样品中的应用,结果显示在原样品大肠埃希菌O157∶H7浓度约2.3CFU/mL时,经12h增菌后即能检测出来。大肠埃希菌O157∶H7聚类分析显示,40株O157∶H7大肠埃希菌可分为3类。结论基于CRISPR的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法,可以作为监测大肠埃希菌O157∶H7感染和高毒株大肠埃希菌O157∶H7有价值的流行病学工具。 展开更多

关键词 大肠埃希菌O157∶H7 成簇的规律间隔短回文重复序列(crispr) 聚合酶链反应 检测

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一种靶向基因操作新技术——CRISPR/Cas 被引量：1

5

作者 黄俊骏 王华华 梁卫红 《湖北农业科学》 2015年第19期4661-4665,4669,共6页

CRISPR/Cas系统是一种细菌在噬菌体长期选择压力下的获得性免疫系统。该系统是一段规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR),具有保护细菌免遭外源DNA入侵的功能。该系统成功地... CRISPR/Cas系统是一种细菌在噬菌体长期选择压力下的获得性免疫系统。该系统是一段规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR),具有保护细菌免遭外源DNA入侵的功能。该系统成功地被改造为第三代人工核酸内切酶,由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点,目前已成功应用于人类细胞、干细胞、斑马鱼和小鼠以及植物的基因组精确修饰。CRISPR/Cas系统因其在结构上的特殊性以及功能上的特异性正逐渐成为整个生命科学研究领域的热点,被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。回顾了CRISPR/Cas系统的研究历史,综述了近年来有关CRISPR系统的分类结构、作用机制以及最新应用进展,旨在为这一领域的科研工作提供参考。 展开更多

关键词 靶向基因操作 规律成簇间隔短回文重复序列(crispr) crispr/Cas系统 结构 作用机制

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基于CRISPR/Cas9方法构建‘沪农灵芝1号’基因编辑系统 被引量：3

6

作者 张志刚 张劲松 +5 位作者 邹根 唐传红 冯杰 鲍大鹏 陈建波 谭贻 《食用菌学报》 CSCD 北大核心 2023年第2期9-18,共10页

构建密码子优化的cas 9表达质粒pMD-EXP-cas 9,通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化灵芝(Ganoderma lucidum)菌株‘沪农灵芝1号’(‘Hunong No.1’)单核菌株L1,得到含有cas9完整表达盒的菌株L1-cas9。利用T7启动子构建靶向u... 构建密码子优化的cas 9表达质粒pMD-EXP-cas 9,通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化灵芝(Ganoderma lucidum)菌株‘沪农灵芝1号’(‘Hunong No.1’)单核菌株L1,得到含有cas9完整表达盒的菌株L1-cas9。利用T7启动子构建靶向ura3基因的表达质粒psgRNA-1和psgRNA-2,体外转录后得到sgRNA 1和sgRNA 2。通过PEG介导的转化,将sgRNA 1和sgRNA 2转化进L1-cas9的原生质体中,得到ura3基因被破坏的突变体,首次在‘沪农灵芝1号’菌株单核体中构建成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑系统,ura3基因的编辑效率为4个突变体(107个原生质体)。利用0.006%曲拉通X-100优化PEG介导的转化系统,可使ura3基因编辑效率提高至18个以上突变体(107个原生质体),本研究的结果为灵芝基因功能的研究和分子育种提供更高效的方法。 展开更多

关键词 ‘沪农灵芝1号’ 基因破坏 成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(crispr/Cas9) 曲拉通X-100

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运用CRISPR/Cas9技术构建敲除体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因的ACT-1人未分化甲状腺癌细胞系 被引量：2

7

作者 文丹 黄蓉 +2 位作者 谢建平 温琥玲 林师宇 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期419-424,共6页

目的构建体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因敲除的ACT-1人未分化甲状腺癌单克隆细胞系。方法用分子克隆技术及成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建AXIN1基因敲除的单克隆细胞系;采用实时荧光定量PCR检测AC... 目的构建体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因敲除的ACT-1人未分化甲状腺癌单克隆细胞系。方法用分子克隆技术及成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建AXIN1基因敲除的单克隆细胞系;采用实时荧光定量PCR检测ACT-1细胞的AXIN1 mRNA水平,Western blot法检测AXIN1蛋白水平。结果通过T7检测成功获得有效的两个单链导向RNA(sgRNA)Cr3及Cr5;通过酶切鉴定及测序成功构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的靶向AXIN1的sgRNA病毒载体;成功获得包括阴性对照在内的4个单克隆ACT-1未分化甲状腺癌细胞系;敲除组细胞AXIN1 mRNA及蛋白水平均明显降低。结论采用CRISPR-Cas9技术成功建立了敲除AXIN1基因的ACT-1未分化甲状腺癌细胞系。 展开更多

关键词 成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(crispr/Cas9) 未分化甲状腺癌 体轴抑制蛋白1(AXIN1)

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CRISPR/Cas9技术敲除RAW264.7细胞的GPR43基因抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能 被引量：1

8

作者 徐方明 苏丛 +5 位作者 伍婷 陈昊然 张鹏飞 刘艳艳 兰燕虎 李家斌 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期481-486,共6页

目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sg... 目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sgRNA插入pLenticrisprV2质粒中,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pLenticrisprV2;将病毒感染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序GPR43基因相关序列并与野生型GPR43基因进行比对,确认敲除成功的细胞株(GPR43^-/-RAW264.7细胞),Western blot法检测GPR43蛋白水平。肺炎克雷伯菌感染GPR43^-/-RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测细菌感染后细胞内白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的变化,并观察敲除GPR43后,RAW264.7细胞吞噬能力的变化。结果挑选的单克隆细胞经Western blot验证GPR43蛋白不表达,并且DNA测序结果显示在sgRNA插入位置缺失34个碱基,证明成功敲除GPR43基因。GPR43^-/-RAW264.7细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均低于对照组,且GPR43^-/-RAW264.7细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力降低。结论CRISPR/Cas9技术敲除GPR43基因,抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能及炎性细胞因子的产生。 展开更多

关键词 RAW264.7细胞 成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(crispr/Cas9) G蛋白偶联受体43(GPR43) 肺炎克雷伯

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CRISPR基因编辑技术的发展及应用 被引量：9

9

作者 巩琦凡 郑晓飞 付汉江 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期332-340,共9页

对基因组DNA进行自由编辑,一直是生物学家的梦想,随着CRISPR-Cas9这一强大基因编辑工具的发现及应用,这一梦想终于成真。起初,科学家发现Cas9、Cas12a及Cas12f等多种CRISPR-Cas系统可用于真核细胞DNA的编辑,随后,又陆续发现Cas13a、Cas... 对基因组DNA进行自由编辑,一直是生物学家的梦想,随着CRISPR-Cas9这一强大基因编辑工具的发现及应用,这一梦想终于成真。起初,科学家发现Cas9、Cas12a及Cas12f等多种CRISPR-Cas系统可用于真核细胞DNA的编辑,随后,又陆续发现Cas13a、Cas13b及Cas13d等核酸酶靶向RNA分子。不仅如此,通过各种各样的改造,科学家还开发一系列新型CRISPR-Cas系统。这些人工改造的基因编辑系统比天然的CRISPR系统具有更高的DNA切割活性、更强的特异性以及更小的体积,它们形成了一个强大的工具集,可用于DNA序列的敲除、替换、表观遗传编辑甚至基因表达的激活和抑制。CRISPR基因编辑技术不仅是基因功能研究的强大工具,其在疾病治疗靶点的发现、病原体的核酸诊断与肿瘤等疾病的临床治疗方面也展现出巨大的潜力。当然,CRISPR技术在实际应用中仍然存在许多潜在的问题尚待解决,例如其在体内的高效递送,免疫原性和脱靶效应等。这些问题都将在本综述中展开讨论。相信随着CRISPR编辑技术的进一步改进,它将以更加完善和精确的方式在人类疾病的预防和治疗中发挥更大的作用。 展开更多

关键词 基因编辑 成簇的规律间隔短回文重复序列(crispr) Cas9变体 crispr筛选 免疫治疗

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CRISPR/Cas9基因编辑非病毒递送系统

10

作者 盛劲菡 郑琪臻 汪铭 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2023年第3期156-166,共11页

规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的基因编辑技术为哺乳细胞基因组的精准修饰与编辑研究提供了高效、快捷的工具,但其化学生物学应用依然面临着CRISPR基因编辑工具Cas9蛋白和gRNA的细胞及活体递送等问题.近年来... 规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的基因编辑技术为哺乳细胞基因组的精准修饰与编辑研究提供了高效、快捷的工具,但其化学生物学应用依然面临着CRISPR基因编辑工具Cas9蛋白和gRNA的细胞及活体递送等问题.近年来,研究人员通过开发多种非病毒递送载体,实现了编码CRISPR/Cas9基因编辑工具的DNA和信使RNA(mRNA)以及Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的递送,并应用于靶基因的化学修饰与编辑调控.本文主要概述了近期CRISPR/Cas9基因编辑递送的研究进展,并对其化学生物学应用前景进行了展望. 展开更多

关键词 规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(crispr/Cas9) 基因编辑 药物递送 非病毒载体 纳米颗粒

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CRISPR/Cas9技术在工业微生物中的应用

11

作者 张才达 祁永浩 +5 位作者 米雅萱 张蕴之 秦浩杰 刘东 李小兵 任丽梅 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1629-1637,共9页

近年来,通过基因编辑技术对工业微生物底盘细胞改造从而获得的优良细胞工厂,促进了农业、医学、环境、能源等领域的可持续发展,提高了人民的生活水平。微生物底盘细胞的改造离不开基因编辑,作为现阶段主要的基因编辑技术,规律间隔成簇... 近年来,通过基因编辑技术对工业微生物底盘细胞改造从而获得的优良细胞工厂,促进了农业、医学、环境、能源等领域的可持续发展,提高了人民的生活水平。微生物底盘细胞的改造离不开基因编辑,作为现阶段主要的基因编辑技术,规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9系统自被发现以来,依靠其低成本、高效率等编辑优点,被广泛用于工业微生物底盘细胞的改造。本文主要简述了以CRISPR/Cas9为基础而衍伸出的各种基因编辑技术,提出了常用的工业微生物对应底盘细胞的改造策略,以期为研究者在进行微生物底盘细胞改造时选择出合适的基因编辑方法。最后指出了CRISPR基因编辑技术面临的PAM位点的依赖性、脱靶效应和应用广泛性等问题。 展开更多

关键词 规律间隔成簇短回文重复序列(crispr) 微生物底盘细胞 基因编辑 基因敲除

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弓形虫srs19d基因敲除株的构建及其在宿主细胞中的生物学功能分析 被引量：1

12

作者 牛水珠 潘明 +1 位作者 葛层层 黄思扬 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第8期10-17,共8页

为探究弓形虫表面抗原1相关序列(SRS)蛋白家族新成员SRS19D的功能,本试验以弓形虫Ⅱ型Pru虫株为亲本,运用成簇规律间隔短回文重复-CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建了PruΔsrs 19 d敲除虫株,并进行了噬斑试验、细胞内增殖试验、体... 为探究弓形虫表面抗原1相关序列(SRS)蛋白家族新成员SRS19D的功能,本试验以弓形虫Ⅱ型Pru虫株为亲本,运用成簇规律间隔短回文重复-CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建了PruΔsrs 19 d敲除虫株,并进行了噬斑试验、细胞内增殖试验、体外缓殖子转化试验、小鼠毒力试验和小鼠脑包囊检测试验。噬斑试验和细胞内增殖试验结果显示,与Pru虫株相比,PruΔsrs 19 d敲除虫株在人包皮成纤维(HFF)细胞上形成的噬斑显著变小(P<0.05),纳虫泡内形成的速殖子个数显著减少(P<0.05)。体外缓殖子转化试验发现,与Pru虫株相比,PruΔsrs 19 d敲除虫株的体外缓殖子转化率极显著降低(P<0.01)。小鼠毒力试验结果显示,与Pru虫株相比,弓形虫PruΔsrs 19 d敲除虫株不会引起ICR小鼠的死亡(P<0.05)。小鼠脑包囊检测试验结果显示,与Pru虫株相比,PruΔsrs 19 d敲除虫株感染小鼠后形成的脑包囊数量极显著减少(P<0.01)。本试验成功构建了弓形虫PruΔsrs 19 d敲除虫株,发现srs 19 d基因在弓形虫的体外生长、复制、毒力和慢性感染中发挥重要作用,为进一步探究SRS19D的功能和作用机制提供参考。 展开更多

关键词 弓形虫 表面抗原1相关序列(SRS) srs19d 成簇规律间隔短回文重复-crispr相关蛋白9(crispr/Cas9) 生物学功能

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