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钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ质粒的构建和表达及其与Ca_(V)1.2通道结合的鉴定
1
作者 王红梅 王祥卉 +4 位作者 张文竹 何蕊 廖天佐 高青华 郝丽英 《中国医科大学学报》 北大核心 2025年第1期1-4,11,共5页
目的构建钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)长片段的融合蛋白质粒,表达、提取、纯化,并鉴定其与Ca_(V)1.2通道蛋白的结合。方法将提取的pGEX-6p-1/CaMKⅡ长片段质粒转化到原核大肠杆菌BL21感受态细胞,摇床培养箱中培养12 h,添加异丙... 目的构建钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)长片段的融合蛋白质粒,表达、提取、纯化,并鉴定其与Ca_(V)1.2通道蛋白的结合。方法将提取的pGEX-6p-1/CaMKⅡ长片段质粒转化到原核大肠杆菌BL21感受态细胞,摇床培养箱中培养12 h,添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,促进GST融合蛋白的表达。采用DTT联合超声破碎法,谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B(GS-4B)分离、纯化GST-CaMKⅡ长片段后,经过PreScission蛋白酶处理,切除GST标签,得到CaMKⅡ长片段蛋白。采用15%SDS-PAGE鉴定CaMKⅡ长片段蛋白的分子量和相对纯度;采用Bradford方法测定纯化后蛋白的浓度;采用pull-down结合Western blotting鉴定其与Ca_(V)1.2通道蛋白的结合能力。结果测序结果表明,CaMKⅡ长片段构建成功。通过DTT联合超声破碎法,得到了较高纯度和浓度的长片段CaMKⅡ蛋白,并能够与心肌Ca_(V)1.2钙通道末端CT1蛋白结合。结论本研究成功构建了CaMKⅡ长片段钙调蛋白激酶融合蛋白质粒,提取、纯化了能够与Ca_(V)1.2通道蛋白结合并具有生物活性的CaMKⅡ长片段蛋白,为深入研究CaMKⅡ蛋白的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ 质粒构建 分离 纯化 pull-down
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钙调蛋白突变体D130V与心肌CaV1.2通道IQ基序的相互作用
2
作者 唐路红 刘忆芳 +3 位作者 潘雪婷 邢英美 郝丽英 苏敬阳 《中国医科大学学报》 北大核心 2025年第4期306-311,共6页
目的探讨钙调蛋白(CaM)突变体D130V与心肌CaV1.2通道IQ基序的结合作用。方法采用折叠识别建模、同源建模和蛋白对接方法预测突变体CaM-D130V与IQ基序的结合;利用42℃精确热击法将质粒转化至大肠杆菌BL-21感受态细胞中,诱导GST融合蛋白表... 目的探讨钙调蛋白(CaM)突变体D130V与心肌CaV1.2通道IQ基序的结合作用。方法采用折叠识别建模、同源建模和蛋白对接方法预测突变体CaM-D130V与IQ基序的结合;利用42℃精确热击法将质粒转化至大肠杆菌BL-21感受态细胞中,诱导GST融合蛋白表达;超声破碎法提取蛋白,GS-4B beads纯化、PreScission蛋白酶切除GST标签;利用SDS-PAGE检测蛋白纯度;GST pull-down实验检测CaM-D130V与IQ基序的相互作用。结果蛋白对接结果表明,CaM-WT、CaM-D130V与心肌CaV1.2通道IQ基序均具有结合作用,但与CaM-WT相比,突变体CaM-D130V与IQ基序的结合位点减少,且结合构象发生变化,结合能减小(|S|由48.0866 kcal/mol下降至47.3095 kcal/mol)。GST pull-down实验结果显示,在2 mmol/L Ca^(2+)浓度下,与CaM-WT相比,CaM-D130V与IQ基序的结合量显著减少(P<0.01),亲和力显著降低。结论CaM-D130V与心肌CaV1.2通道IQ基序的结合能力降低,可能导致CaV1.2通道功能改变,为探讨CaM突变体相关的心血管疾病的发病机制和靶向治疗提供理论依据。 展开更多
关键词 钙调蛋白 突变体 心肌CaV1.2通道 结合能力 长QT综合征
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大蒜类钙调蛋白基因AsCML15和AsCML42的分离及其在渗透胁迫中的功能分析
3
作者 王广龙 许吴俊 +3 位作者 陈洋洋 胡珍珠 孙敏 熊爱生 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第4期80-86,共7页
类钙调素蛋白(CMLs)是植物中的Ca 2+感受器之一,参与植物的生长发育和适应环境变化的过程。为了解大蒜CML的序列特征及其对渗透胁迫的响应,从大蒜品种苍山四六瓣中克隆得到AsCML15和AsCML42基因,并对其在干旱以及盐胁迫条件下的表达模... 类钙调素蛋白(CMLs)是植物中的Ca 2+感受器之一,参与植物的生长发育和适应环境变化的过程。为了解大蒜CML的序列特征及其对渗透胁迫的响应,从大蒜品种苍山四六瓣中克隆得到AsCML15和AsCML42基因,并对其在干旱以及盐胁迫条件下的表达模式进行了分析。结果表明,AsCML15和AsCML42基因开放阅读框长度分别为498,543 bp,编码165,180个氨基酸残基。AsCML15和AsCML42分别含有4,3个EF-hand结构域。AsCML42与拟南芥AtCML42和AtCML43在进化关系上更为接近,而AsCML15与拟南芥AtCML15、AtCML16亲缘关系较近。荧光定量PCR结果表明,AsCML15和AsCML42在鳞茎、叶片、根都有表达,且均能被200 mmol/L NaCl和15%PEG6000所诱导。AsCML15和AsCML42基因可能参与了大蒜抵御盐胁迫和干旱胁迫的过程,可进一步鉴定其生物学功能。 展开更多
关键词 大蒜 类钙调蛋白 基因克隆 表达分析 渗透胁迫
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血清钙调蛋白水平与重型头颅损伤患者病情及预后的相关性
4
作者 李凤玲 罗宽 杨学 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2024年第8期926-929,共4页
目的探讨血清钙调蛋白水平与重型头颅损伤患者病情及预后的相关性。方法选取2021年1月至2023年6月武汉科技大学附属老年病医院和武汉科技大学附属普仁医院收治的老年重型头颅损伤患者208例,随访3个月,最终入选192例,根据预后情况分为预... 目的探讨血清钙调蛋白水平与重型头颅损伤患者病情及预后的相关性。方法选取2021年1月至2023年6月武汉科技大学附属老年病医院和武汉科技大学附属普仁医院收治的老年重型头颅损伤患者208例,随访3个月,最终入选192例,根据预后情况分为预后不良组56例和预后良好组136例。收集一般资料,采用酶联免疫吸附法测量所有患者入组时血清钙调蛋白水平,采用Pearson相关性分析血清钙调蛋白水平与重型头颅损伤患者病情的相关性,采用多因素logistic回归模型筛选重型头颅损伤患者预后的相关因素,并采用限制性立方样条拟合血清钙调蛋白水平与重型头颅损伤患者预后的关系。结果预后良好组中线移位、急性生理与慢性健康评分Ⅱ、钙调蛋白水平较预后不良组明显降低,格拉斯哥昏迷评分、白蛋白水平较预后不良组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。Pearson相关性分析显示,血清钙调蛋白水平与重型头颅损伤患者病情呈负相关(r=-0.804,P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,急性生理与慢性健康评分Ⅱ(OR=1.248,95%CI:1.076~1.447,P=0.003)、钙调蛋白(OR=1.030,95%CI:1.017~1.044,P=0.001)为重型头颅损伤患者预后的危险因素,格拉斯哥昏迷评分(OR=0.730,95%CI:0.536~0.994,P=0.045)、白蛋白(OR=0.730,95%CI:0.649~0.822,P=0.001)为重型头颅损伤患者预后不良的保护因素。限制性立方样条显示,血清钙调蛋白水平与重型头颅损伤患者预后情况呈线性剂量-反应关系(χ^(2)=27.080,P<0.01)。结论血清钙调蛋白水平与重型头颅损伤患者病情及预后相关。 展开更多
关键词 钙调蛋白 颅脑损伤 预后 预测 数据相关性
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β淀粉样蛋白_(1-42)质粒的构建及其与钙调蛋白的结合作用 被引量：1
5
作者 齐爽 孙旋旋 +4 位作者 王绮萱 贺意婷 李佳睿 苏敬阳 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第6期495-500,共6页
目的探讨β淀粉样蛋白_(1-42)(Aβ_(1-42))与钙调蛋白(CaM)的结合作用。方法采用生物信息学方法获取阿尔茨海默病(AD)异常表达的核心基因,预测AD防治的潜在靶蛋白;通过基因重组的方法构建GST-Aβ_(1-42)重组质粒并进行DNA测序;琼脂糖凝... 目的探讨β淀粉样蛋白_(1-42)(Aβ_(1-42))与钙调蛋白(CaM)的结合作用。方法采用生物信息学方法获取阿尔茨海默病(AD)异常表达的核心基因,预测AD防治的潜在靶蛋白;通过基因重组的方法构建GST-Aβ_(1-42)重组质粒并进行DNA测序;琼脂糖凝胶电泳进行重组质粒的酶切鉴定;提取纯化GST-Aβ_(1-42)融合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否纯化成功;GST pull-down检测质粒表达的GST-Aβ_(1-42)蛋白与CaM的结合作用。结果获取连接度排名前20的核心基因,将CaM作为靶蛋白;质粒的DNA测序结果证明重组质粒构建成功,琼脂糖凝胶电泳结果显示,酶切后的片段与Aβ_(1-42)片段分子量大小理论值符合,进一步证明重组质粒构建成功;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示GST-Aβ_(1-42)蛋白能够与CaM结合,并具有浓度依赖性。结论Aβ_(1-42)重组质粒构建成功,且与CaM具有结合作用。 展开更多
关键词 Β淀粉样蛋白 质粒构建 钙调蛋白 结合能力 活性鉴定
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杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白PbCBL10基因的克隆和表达特性研究 被引量：9
6
作者 李慧 丛郁 +2 位作者 常有宏 蔺经 盛宝龙 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期550-556,共7页
【目的】为了探明杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白（CalcineurinB—likeprotein，CBL）基因的序列特征和表达特点，【方法】以杜梨幼苗为试材，运用同源克隆和半定量RT—PCR对PbCBLIO基因进行克隆和表达分析。【结果】结果表明．PbCBLIO基因... 【目的】为了探明杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白（CalcineurinB—likeprotein，CBL）基因的序列特征和表达特点，【方法】以杜梨幼苗为试材，运用同源克隆和半定量RT—PCR对PbCBLIO基因进行克隆和表达分析。【结果】结果表明．PbCBLIO基因编码区cDNA长度为801bp，编码的多肽由266个氨基酸组成。该多肽预测的等电点为4．56，估计的相对分子质量为30．45ku。其对应基因组DNA序列长1983bp，包括9个外显子和8个内含子。通过PSORT进行亚细胞定位分析发现PbCBLl0蛋白位于质膜上的几率最大。PbCBLIO基因编码的多肽具有4个钙离子结合域EF手形结构和1个钙调磷酸酶A亚基结合位点。PbCBLl0与番茄S1CBLIO（NP_001239045）和拟南芥AtCBLl0（NP_195026）蛋白间的同源性较高，分别为82％和77％，并与AtCBL10亲缘关系最近。PbCBL10基因在杜梨幼苗根、茎和叶片中均为诱导型表达，50～200mmol·L^（-1）CaCl2、20μmol·L^（-1）ABA、100mmol·L^（-1）NaCl、10％（w／v）PEG6000或180mmol·L^（-1）甘露醇处理后其表达量明显上调。【结论】PbCBLIO基因具备植物CBL基因家族的固有特征，能够响应胞内钙浓度变化，对ABA、盐碱、干旱和渗透胁迫均存在转录响应。 展开更多
关键词 杜梨 类钙调磷酸酶B亚基蛋白 基因克隆 表达特性
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低温锻炼对香蕉幼苗钙调蛋白含量及其可能调节酶类活性的影响 被引量：13
7
作者 林善枝 蔡世英 陈晓敏 《热带作物学报》 CSCD 2001年第4期29-35,共7页
首次对不同抗冷性的香蕉幼苗在低温锻炼中钙调蛋白(CaM)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、腺苷三磷酸酶(ATPase)、膜伤害率及幼苗存活率的动态变化过程进行测定。结果表明,低温锻炼提高了幼苗叶片中CaM含量和SOD、POD及ATPase活... 首次对不同抗冷性的香蕉幼苗在低温锻炼中钙调蛋白(CaM)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、腺苷三磷酸酶(ATPase)、膜伤害率及幼苗存活率的动态变化过程进行测定。结果表明,低温锻炼提高了幼苗叶片中CaM含量和SOD、POD及ATPase活性,降低了膜伤害率,从而提高了幼苗的存活率,但不同抗冷性品种上述各项指标变化略有差异。进一步分析发现,在低温锻炼期间,不同抗冷性香蕉幼苗的CaM含量和SOD、POD及ATPase活性都呈现先上升后下降的动态变化趋势,而且它们的变化与幼苗抗冷性的提高存在着明显的相关性,据此推测CaM可能参与SOD、POD及ATPase活性的调节。 展开更多
关键词 香蕉 幼苗 低温 钙调蛋白 膜伤害率 存活率 抗冷性 酶类活性
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葡萄类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因VvCBL4的克隆与表达分析 被引量：4
8
作者 余义和 李秀珍 +4 位作者 郭大龙 杨英军 李桂荣 李学强 张国海 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期385-392,共8页
【目的】在京秀(Vitis vinifera‘Jingxiu’)葡萄中克隆类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因Vv CBL4及其启动子,分析Vv CBL4的表达特性与逆境胁迫的关系。【方法】用RACE技术克隆Vv CBL4的全长,实时荧光定量PCR检测Vv CBL4在不同逆境下的表达;用... 【目的】在京秀(Vitis vinifera‘Jingxiu’)葡萄中克隆类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因Vv CBL4及其启动子,分析Vv CBL4的表达特性与逆境胁迫的关系。【方法】用RACE技术克隆Vv CBL4的全长,实时荧光定量PCR检测Vv CBL4在不同逆境下的表达;用同源克隆技术获得Vv CBL4的启动子,在烟草叶片中瞬时表达分析Vv CBL4启动子的活性。【结果】Vv CBL4全长为959 bp,ORF为642 bp,编码213个氨基酸,具有3个EF手钙结合结构域。Vv CBL4在根部表达量最高,其次是果实。Vv CBL4的转录本能对干旱、低温和盐胁迫处理快速做出响应。Vv CBL4启动子富含与逆境响应相关的顺式作用元件。干旱、低温和盐胁迫处理能够增强启动子活性。【结论】获得Vv CBL4及其启动子序列,Vv CBL4的表达能对逆境胁迫做出响应,Vv CBL4启动子的活性受逆境胁迫诱导,说明Vv CBL4在葡萄逆境胁迫反应中具有重要的作用。 展开更多
关键词 葡萄 类钙调磷酸酶B亚基蛋白 VvCBL4 逆境 表达分析
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桃钙调磷酸酶B类似蛋白基因家族鉴定与分析 被引量：2
9
作者 张杰伟 吴婷 +2 位作者 任飞 谢华 魏建华 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第3期511-516,共6页
为了研究桃钙调磷酸酶B类似蛋白(CBLs)基因家族在桃中如何发挥作用。利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CBL家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃基因组中含有8个CBL家族... 为了研究桃钙调磷酸酶B类似蛋白(CBLs)基因家族在桃中如何发挥作用。利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CBL家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃基因组中含有8个CBL家族基因,分布于桃的5条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,桃CBL蛋白均含有4个保守的EF结构域。进化树分析表明CBLs可分为4个亚家族。TMHMM 2.0Server分析显示仅PpCBL1含有1个跨膜区。PlantsPFeatureScan分析显示PpCBL2、3和5均含有1个N-豆蔻酰化位点。NetPhos 2.0 Server结果显示PpCBLs存在着大量的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)潜在磷酸化位点。以上结果将为今后揭示桃CBL的功能提供重要的理论基础。 展开更多
关键词 钙调磷酸酶B类似蛋白 桃 基因家族 进化分析 序列特征
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17β-雌二醇对人的类成骨细胞HOS TE85胞内游离钙、IP_3及钙调蛋白影响 被引量：3
10
作者 刘景生 孙兰 +2 位作者 汪青 翁玲玲 郑虎 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期105-110,共6页
目的观察１７β－雌二醇（Ｅ２）对成骨细胞胞内游离钙（［Ｃａ２＋］ｉ）、１，４，５－三磷酸肌醇（ＩＰ３）含量及钙调蛋白（ＣａＭ）含量的影响。方法以Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ为钙荧光指示剂，采用激光共聚焦显微系统测定细胞内钙荧光... 目的观察１７β－雌二醇（Ｅ２）对成骨细胞胞内游离钙（［Ｃａ２＋］ｉ）、１，４，５－三磷酸肌醇（ＩＰ３）含量及钙调蛋白（ＣａＭ）含量的影响。方法以Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ为钙荧光指示剂，采用激光共聚焦显微系统测定细胞内钙荧光值的改变，以反映［Ｃａ２＋］ｉ含量的变化。用阳离子交换法测定ＩＰ３含量。以测定钙依赖的磷酸二酯酶活性方法测定ＣａＭ含量。结果给予０．１、１．０ｎｍｏｌ／ＬＥ２后５０ｓ胞内钙荧光值分别增加４．７和６．１倍，持续８０～１６０ｓ；以１００ｎｍｏｌ／Ｌｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ预处理细胞，Ｅ２仅使胞内钙荧光值升高１．５倍。加入１．０ｎｍｏｌ／ＬＥ２，ＩＰ３含量在给药后２０～３０ｓ和６０～７０ｓ呈双峰升高。同样剂量的Ｅ２可使ＣａＭ含量增加８５．２％。他莫西芬不能阻断Ｅ２引起的胞内钙荧光值、ＩＰ３及ＣａＭ含量升高的作用，而磷脂酶Ｃ抑制剂使Ｅ２的作用部分或完全抑制。结论Ｅ２作用于胞膜引起胞外钙内流，并通过ＩＰ３导致［Ｃａ２＋］ｉ进一步增加，激活ＣａＭ从而调节细胞功能。 展开更多
关键词 骨质疏松 雌激素 钙调蛋白 三磷酸肌醇
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钙调蛋白结合蛋白、类肌钙蛋白和脊椎动物平滑肌收缩的调节 被引量：7
11
作者 陈明 李爱媛 《生理科学进展》 CAS CSCD 北大核心 1994年第4期314-318,共5页
平滑肌细胞包含有粗肌丝、细肌丝和中等纤维。一般认为ｃａ^（２＋）／ＣａＭ依赖性的肌球蛋白磷酸化作用是平滑肌收缩的重要调控环节。然而，新近在平滑肌中发现钙调蛋白结合蛋白（ｃａｌｄｅｓｍｏｎ）和类肌钙蛋白（ｃａｌｐｏｎｉ... 平滑肌细胞包含有粗肌丝、细肌丝和中等纤维。一般认为ｃａ^（２＋）／ＣａＭ依赖性的肌球蛋白磷酸化作用是平滑肌收缩的重要调控环节。然而，新近在平滑肌中发现钙调蛋白结合蛋白（ｃａｌｄｅｓｍｏｎ）和类肌钙蛋白（ｃａｌｐｏｎｉｎ），它们也参与平滑肌收缩的调节。 展开更多
关键词 平滑机 收缩 调钙蛋白 结合蛋白 类肌钙蛋白
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黄瓜类钙调蛋白CML8与性型分化主效基因编码蛋白的互作分析 被引量：1
12
作者 许俊强 张新梅 +4 位作者 吕霞 苏甜 张国平 张应华 许彬 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第5期904-912,共9页
【目的】为探索类钙调蛋白CMLs是否参与黄瓜性型分化过程,以便进一步完善性型分化调控网络提供参考。【方法】通过克隆黄瓜CML8、ACS1G、ACS2及ACS11基因,qPCR检测CML8基因在不同花型中的表达量,酵母双杂交检测CML8与黄瓜性型分化主效... 【目的】为探索类钙调蛋白CMLs是否参与黄瓜性型分化过程,以便进一步完善性型分化调控网络提供参考。【方法】通过克隆黄瓜CML8、ACS1G、ACS2及ACS11基因,qPCR检测CML8基因在不同花型中的表达量,酵母双杂交检测CML8与黄瓜性型分化主效基因编码蛋白间的互作情况。【结果】克隆得到黄瓜CML8基因,完整ORF 441 bp,编码146 aa,不含信号肽;不含跨膜域,为胞外蛋白,含4个具有Ca^(2+)结合能力的EF-hand结构域,不含内含子,亚细胞定位在细胞膜和细胞质;克隆得到黄瓜性型分化关键基因F(ACS1G)、M(ACS2)及A(ACS11),序列比对表明三者的基因序列及编码蛋白序列与黄瓜数据库中的一致,且在雌花、雄花和两性花3种不同花型中的表达量差异显著,在雄花中差异极显著;酵母双杂交试验表明,CML8均可与ACS1G和ACS2发生互作,而不能与ACS11发生互作。【结论】成功克隆得到黄瓜CML8基因,且CML8可与ACS1G和ACS2发生互作,可能参与黄瓜性型分化过程,本研究首次探索类钙调蛋白参与植物性型分化过程,期望为钙信号系统参与植物性型分化提供参考。 展开更多
关键词 黄瓜 类钙调蛋白(CML8) 性型分化 主效基因 蛋白互作
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长QT综合征相关钙调蛋白突变体E141G的C末端片段载体构建和蛋白制备
13
作者 邵冬雪 张晨阳 +2 位作者 叶苗苗 陈帆 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第11期967-971,共5页
目的构建长QT综合征(LQTS)相关钙调蛋白(CaM)突变体E141G的C末端片段(C-lobe_(E141G))原核表达载体并进行蛋白表达、纯化及活性鉴定。方法将C-lobe_(E141G) cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-... 目的构建长QT综合征(LQTS)相关钙调蛋白(CaM)突变体E141G的C末端片段(C-lobe_(E141G))原核表达载体并进行蛋白表达、纯化及活性鉴定。方法将C-lobe_(E141G) cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads对融合蛋白进行分离纯化,经蛋白酶切除GST标签后,分别采用SDS-PAGE及BCA方法检测纯化后的目的蛋白纯度及浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果GST-C-lobe_(E141G)融合蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度C-lobe_(E141G)蛋白。纯化后C-lobe_(E141G)蛋白具有能与CaV1.2型钙通道结合并维持大鼠心室肌细胞通道开放的活性。结论成功构建可以表达生物活性蛋白的C-lobe_(E141G)原核表达载体,可为CaM的C-lobe位点突变介导的LQTS机制研究提供材料基础。 展开更多
关键词 钙调蛋白 C末端片段 突变体 融合蛋白
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原核生物中的类钙调蛋白 被引量：7
14
作者 张蔚文 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1995年第2期98-102,共5页
钙是重要的生命元素之一，真核生物中普遍存在介导钙信号的钙调蛋白已有深入的研究，证明钙调蛋白是细胞复杂调控系统中的一个重要成员，但是在原核生物中是否也存在类似的蛋白因子却一直说法不一。自８０年代初在大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅ... 钙是重要的生命元素之一，真核生物中普遍存在介导钙信号的钙调蛋白已有深入的研究，证明钙调蛋白是细胞复杂调控系统中的一个重要成员，但是在原核生物中是否也存在类似的蛋白因子却一直说法不一。自８０年代初在大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中首次发现类钙调蛋白（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ）以来，已在多种原核生物中陆续发现了类钙调蛋白的存在，证明其可能参与了原核生物的孢子形成，细胞分裂，生物固氮，异型胞形成和兰细菌光合作用等多种调控功能。文章综述了近年来这一领域的部分研究成果。 展开更多
关键词 原核生物 类钙调蛋白 生理功能
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类钙调磷酸酶B亚基蛋白GhCBL3-A01调控棉花黄萎病抗性的功能分析 被引量：1
15
作者 高升旗 邵武奎 +3 位作者 赵准 邵盘霞 胡文冉 黄全生 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2023年第6期447-458,共12页
【目的】解析类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcium B-like protein,CBL)基因GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病反应中的功能,为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得GhCBL3-A01基因的同源序列,进行生物信息学分析。采用实时荧... 【目的】解析类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcium B-like protein,CBL)基因GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病反应中的功能,为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得GhCBL3-A01基因的同源序列,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)和H2O2处理的棉株中GhCBL3-A01基因的表达量变化。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术研究GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病中的功能。通过检测活性氧积累以及相关基因的表达量,初步分析GhCBL3-A01的作用机制。【结果】陆地棉中GhCBL3-A01及其3个同源蛋白均含有3个CBL家族典型的EF-hand结构域。大丽轮枝菌、MeJA和H2O2处理后,GhCBL3-A01的表达量显著升高。VIGS沉默GhCBL3-A01导致病株率和病情指数显著降低,茎秆维管束褐变程度减轻,有病菌繁殖的茎段数量明显减少,增强了棉株对黄萎病的抗性。GhCBL3-A01基因沉默棉株叶片中活性氧积累增多,防御相关基因PR1、NPR1、PR4和PDF1.2以及茉莉酸信号通路关键基因AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表达量增加。【结论】GhCBL3-A01通过调控防御相关基因、茉莉酸信号通路基因的表达和活性氧积累负调控棉花对黄萎病的抗性,是提高棉花黄萎病抗性的候选基因。 展开更多
关键词 棉花 黄萎病 类钙调磷酸酶B亚基蛋白 GhCBL3-A01 抗病基因 病毒诱导的基因沉默
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大麦类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶基因克隆及表达分析
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作者 方伏荣 金平 +5 位作者 王峰 聂石辉 王仙 杜卫军 张金汕 吴志明 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期1079-1084,共6页
采用RT-PCR法从大麦抗旱品种‘甘啤7号’中克隆了1个类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK)基因HvCIPK1(GenBank登录号为JX679077)。序列分析表明,该基因全长1 359bp,编码的蛋白含有452个氨基酸,分子量为51.05kD,等电点为9.13。推断具有植物C... 采用RT-PCR法从大麦抗旱品种‘甘啤7号’中克隆了1个类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK)基因HvCIPK1(GenBank登录号为JX679077)。序列分析表明,该基因全长1 359bp,编码的蛋白含有452个氨基酸,分子量为51.05kD,等电点为9.13。推断具有植物CIPK家族典型的功能结构域,在N端有一特异的催化结构域,该结构域在保守的氨基酸DFG和APE之间含有一个催化所需的活性环;同时C端区域存在一个独特的24个氨基酸组成的调节域,即NAF结构域。荧光定量分析结果表明,在PEG、NaCl和ABA处理下,HvCIPK1基因在大麦幼苗叶片中表达显著上调。推测HvCIPK1基因参与多种逆境信号的转导,可能在大麦的多种非生物胁迫响应中起着重要的作用。 展开更多
关键词 大麦 类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(CIPK) 克隆 非生物胁迫 实时定量PCR
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微小隐孢子虫类钙调蛋白基因的克隆与原核表达
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作者 杨晓娇 周鹏 +7 位作者 米荣升 黄燕 石凯 王晓娟 王向佩 刘宇轩 雷晓思 陈兆国 《动物医学进展》 北大核心 2015年第1期26-30,共5页
为了对微小隐孢子虫(C.parvum)类钙调蛋白(CML)基因进行原核表达,分析重组表达蛋白的反应原性。以C.parvum卵囊cDNA为模板,用PCR方法扩增得到C.parvum CML基因。将CML基因连接到克隆载体pMD18-T,获得重组质粒pMD-CML,经限制性内切酶Bam... 为了对微小隐孢子虫(C.parvum)类钙调蛋白(CML)基因进行原核表达,分析重组表达蛋白的反应原性。以C.parvum卵囊cDNA为模板,用PCR方法扩增得到C.parvum CML基因。将CML基因连接到克隆载体pMD18-T,获得重组质粒pMD-CML,经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到经相同内切酶酶切的表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达。利用GST亲和树脂法纯化重组表达蛋白,对纯化的重组蛋白进行Western blot分析。结果表明,成功构建了重组原核表达质粒pGEX-CML,重组质粒转化菌经IPTG诱导后成功地表达出了分子质量约为51ku的重组蛋白rCML,纯化的蛋白rCML能与感染兔隐孢子虫(C.cuniculus)的兔血清发生特异性反应,具有很好的反应原性。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 类钙调蛋白基因 克隆 原核表达
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桃钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶基因家族鉴定与分析
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作者 张杰伟 杨育峰 +2 位作者 任飞 谢华 魏建华 《科学技术与工程》 北大核心 2016年第24期127-131,共5页
钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CIPKs)在植物生长发育和抗逆过程中发挥着重要作用。为了对桃中CIPK家族基因进行系统分析,利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CIPK家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对... 钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CIPKs)在植物生长发育和抗逆过程中发挥着重要作用。为了对桃中CIPK家族基因进行系统分析,利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CIPK家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃基因组中含有18个CIPK基因,分布于桃的6条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,桃CIPK蛋白均含有2个保守的PKinase和NAF结构域。进化树分析表明CIPKs可分为2个亚家族。Net Phos 2.0 Server结果显示Pp CIPKs存在着大量的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)潜在磷酸化位点。以上结果将为今后揭示桃CIPK蛋白的功能提供重要的理论基础。 展开更多
关键词 钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶 桃 基因家族 进化分析
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大豆类钙调磷酸酶B亚基GmCBL1互作候选蛋白的筛选 被引量：4
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作者 李林蔚 张双喜 +6 位作者 周永斌 裴丽丽 陈明 李连城 马有志 刘生祥 徐兆师 《植物遗传资源学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期359-363,共5页
Ca2+是非生物胁迫信号转导途径中的重要信号分子,植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL,calcineurin B-like proteins)是一类重要的钙信号受体蛋白,主要通过与其他蛋白的特异结合传递信号,使植物形成对非生物胁迫的响应。本实验室已经获得大豆... Ca2+是非生物胁迫信号转导途径中的重要信号分子,植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL,calcineurin B-like proteins)是一类重要的钙信号受体蛋白,主要通过与其他蛋白的特异结合传递信号,使植物形成对非生物胁迫的响应。本实验室已经获得大豆Gm CBL1基因,功能鉴定显示Gm CBL1增强了转基因拟南芥对非生物胁迫的耐性。为了进一步研究Gm CBL1的作用机理,本研究构建诱饵载体p GBKT7::Gm CBL1,利用酵母双杂交技术筛选大豆Gm CBL1的互作蛋白。通过对筛选获得的106个蛋白基因测序和Blast比对分析,并根据其可能的生理功能对这些候选蛋白归类,整理得到4类蛋白:能量代谢相关蛋白、修饰蛋白、防御蛋白、钙信号转导相关蛋白。筛选得到候选蛋白的功能预测初步表明,大豆Gm CBL1参与多条信号途径,为进一步研究探索大豆CBL介导的抗逆信号转导途径奠定了基础。 展开更多
关键词 大豆 类钙调磷酸酶B亚基 GmCBL1 酵母双杂交 互作蛋白
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蓖麻类钙调蛋白基因RcCML42克隆与表达载体构建 被引量：2
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作者 孙德慧 王晓宇 +4 位作者 王莹 霍红雁 刘海臣 徐惠 张继星 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2023年第1期94-101,共8页
为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式,在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料,克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析,... 为了探究类钙调蛋白基因家族成员在蓖麻体内的作用及表达模式,在蓖麻体内挖掘家族基因CML42,并对其进行克隆与表达分析。以哲蓖三号植株为试验材料,克隆获得RcCML42完整编码区序列(CDS),利用生物信息学方法对RcCML42基因序列进行分析,包括编码氨基酸、蛋白分子量及等电点、跨膜结构域、氨基酸序列一致性等内容。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测RcCML42基因在蓖麻植株根、茎、叶位置不同时间点的特异性表达情况。结果显示,RcCML42 CDS长度为597 bp,编码198个氨基酸,含有3个EF-hand钙结合结构域。蛋白分子量为22.27 ku,等电点为4.55,不存在跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明,RcCML42与巴西橡胶树一致性最高,达86.84%。qRT-PCR结果显示,RcCML42基因在蓖麻根、茎、叶组织中均有表达,在经NaCl处理后,RcCML42在根中的表达量呈现先下降后上升的趋势。RcCML42在茎中12 h高度表达,在叶中为8 h高度表达。且在茎中的表达量显著高于其在根、叶中的表达。CML是植物体内最重要的一类钙感受器,通过与钙调素结合蛋白结合进而对植物细胞进行调控。当植物受到环境中NaCl侵害时,CML可以参加体内钙离子的调节,进而减轻盐胁迫对植物体的损害。综上,推测RcCML42在盐胁迫条件下的蓖麻信号转导中起重要作用。 展开更多
关键词 蓖麻 类钙调蛋白 耐盐 钙离子 生物信息学
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