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牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达 被引量：3
1
作者 房红莹 鲁俊鹏 +4 位作者 曾小娜 王雷 陈钜豪 刘健 罗满林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期159-164,共6页
目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延... 目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 esat-6 cfp-10 重组腺病毒载体
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Rv3872/CFP-10/ESAT-6融合蛋白的人工合成及表达
2
作者 王楠 付延军 +2 位作者 赵子丰 王春华 王晓锋 《吉林畜牧兽医》 2013年第6期33-35,共3页
根据牛分枝杆菌AF2122/97基因组中Rv3872、CFP-1O和ESAT-6全长基因序列,以柔性linke(rG4S)3,将三基因序列进行串联,形成表达基因盒(Rv3872-CFP1O-ESAT6,RCE),人工合成并克隆于PUC57转移载体上(PUC57-RCE)。经EcoRI和HindIII双酶切PUC57-... 根据牛分枝杆菌AF2122/97基因组中Rv3872、CFP-1O和ESAT-6全长基因序列,以柔性linke(rG4S)3,将三基因序列进行串联,形成表达基因盒(Rv3872-CFP1O-ESAT6,RCE),人工合成并克隆于PUC57转移载体上(PUC57-RCE)。经EcoRI和HindIII双酶切PUC57-RCE,回收纯化RCE片段,与经过相同双酶切的pET-28a载体,于16℃水浴连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,重组质粒经培养鉴定,测序结果证实插入的REC片段序列编码和方向与预期一致。在优化的诱导条件下表达蛋白,分段收集样本,并各取少量进行SDS-PAGE,经Western-blot分析显示,融合蛋白RCE具有较好的免疫原性,与阳性牛血清在35kDa位置处有明显的反应带。 展开更多
关键词 奶牛结核病 融合蛋白 Rv3872 cfp-10 esat-6 人工合成 表达
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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力 被引量：12
3
作者 张海 师长宏 +3 位作者 薛莹 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期443-446,共4页
目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原... 目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。末次免疫后,取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后计数脾脏中的细菌数。结果:ESAT6-CFP10融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6400。淋巴细胞刺激增殖指数为1.90±0.15,明显高于生理盐水组(0.90±0.15);IFN-γ和IL-2的含量分别为1.792±19ng/L和0.211±11ng/L,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时融合蛋白诱导的脾细胞杀伤率为36%。与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,融和蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为5.24±0.15,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏中细菌负荷减少甚微。结论:ESAT6-CFP10融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 疫苗 ESAT6 CFP10 重组融合蛋白
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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定 被引量：6
4
作者 都伟欣 陈保文 +2 位作者 沈小兵 苏城 王国治 《中国防痨杂志》 CAS 2006年第4期221-224,共4页
目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达... 目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上。重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5μg/ml重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml)等效。结论重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组CFP10-ESAT6融合蛋白 豚鼠 皮试
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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步评价 被引量：2
5
作者 栾秀丽 范雪亭 +9 位作者 王瑞欢 李马超 于晋杰 钱程宇 曹斌 赵秀芹 刘志广 刘海灿 李桂莲 万康林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期589-596,共8页
目的融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpo... 目的融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpot与Luminex检测细胞因子,进行MTB体外生长抑制试验。卡介苗(BCG)为阳性对照。结果CE免疫小鼠,能诱导产生高效价的IgG、IgG1和IgG2a,且IgG1(t=19.1,P<0.0001)和IgG2a(t=8.7,P<0.0001)抗体水平均高于BCG组。CE组与BCG组诱导产生的分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)数量差异无统计学意义(t=0.4,P>0.05),但诱导分泌IL-4的SFC数量高于BCG组(t=8.0,P<0.0001)。CE组诱导分泌GM-CSF(t=8.4,P<0.05)、IL-6(t=8.3,P<0.05)、IL-10(t=2.5,P<0.05)和IL-4(t=7.0,P<0.05)均高于BCG组,而CE组诱导分泌IFN-γ(t=1.4,P>0.05)、TNF-α(t=1.8,P>0.05)、IL-2(t=2.0,P>0.05)、IL-12(t=0.9,P>0.05)和IL-17(t=1.3,P>0.05)均与BCG组相似,差异无统计学意义。CE组小鼠脾细胞的MTB体外生长抑制结果与BCG组相似(t=0.8,P>0.05)。结论CE免疫小鼠可诱导较强的Th1与Th2混合型免疫反应,且有较强的体外抑制MTB生长的能力,表明CE具有良好的结核疫苗研制应用价值。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10 早期分泌抗原靶6 重组融合蛋白CE 疫苗
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牛分枝杆菌特异性四联融合蛋白在牛结核病诊断中的临床应用 被引量：5
6
作者 吴波 张书环 +8 位作者 邓铨涛 项杰 陈军 刘朝 陈鑫 韩永佩 赵波 陈焕春 郭爱珍 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1123-1126,共4页
目的以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。方法用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。iELISA与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛... 目的以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。方法用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。iELISA与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本;以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国黑白花奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清;对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性。结果iELISA与ICG的符合率为93.33%(140/150),与TST的总符合率为87.32%(489/560),与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。结论该方法具有较高的灵敏度与特异性,与其它方法有较高的符合率。 展开更多
关键词 IELISA 融合蛋白 牛结核病 MPB70 MPB83 CFP10 esat-6
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四种牛分枝杆菌特异性蛋白融合表达及在牛结核病诊断中的临床应用 被引量：7
7
作者 吴波 张书环 +12 位作者 邓铨涛 项杰 陈军 刘朝 陈鑫 宋念华 陶淑珍 黄继根 韩永佩 赵波 林祥梅 陈焕春 郭爱珍 《中国奶牛》 2007年第10期16-20,共5页
以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。该iELISA与导致常见牛病的非相关抗原无交叉反应。用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。与商品化胶体金... 以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。该iELISA与导致常见牛病的非相关抗原无交叉反应。用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本,结果与ICG的符合率为93.33%(140/150)。以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国荷斯坦奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清,结果iELISA与TST的总符合率为87.32%(489/560)。对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性,iELISA与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。 展开更多
关键词 IELISA 融合蛋白 牛结核病 MPB70 MPB83 CFP10 esat-6
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应用酶联免疫斑点试验检测入伍新兵结核潜伏感染 被引量：6
8
作者 梁艳 吴雪琼 +4 位作者 王兰 王志耘 张翠英 阳幼荣 张俊仙 《中国感染控制杂志》 CAS 2011年第4期244-247,共4页
目的 应用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测入伍新兵结核潜伏感染情况，评价ELISPOT在检测结核潜伏感染中的价值。方法以结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）皮肤试验为对照，应用ELISPOT试剂盒检测366例2009年驻京部队入伍新兵外周血中分泌结... 目的 应用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测入伍新兵结核潜伏感染情况，评价ELISPOT在检测结核潜伏感染中的价值。方法以结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）皮肤试验为对照，应用ELISPOT试剂盒检测366例2009年驻京部队入伍新兵外周血中分泌结核菌抗原特异性y干扰素（IFN-y）的T淋巴细胞数。对PPD和ELISPOT均为阴性的入伍新兵接种卡介苗，10个月后再做PPD皮肤试验和ELISPOT，比较结果。结果366例入伍新兵中，PPD皮肤试验和ELISPOT阳性率分别为44．81％和31．69％。202例PPD皮肤试验阴性和164例PPD皮肤试验阳性者中，分别有53例（26．24％）和63例（38．41％）ELISPOT阳性，两者的一致率为57．92％（212／366），两者的检测结果差异具有统计学意义（X^2=14．34，P〈0．001）。在接种过卡介苗者中，PPD皮肤试验阳性率为58．53％（127／217），ELISPOT阳性率为29．1）3％（63／217），斑点形成细胞数为32．44±26．52；在未接种卡介苗者中，PPD皮肤试验阳性率为24．83％（37／149），ELISPOT阳性率为35．57％（53／149），斑点形成细胞数为41．81±30．48。110例PPD和ELISPOT均为阴性的人伍新兵接种卡介苗1（1个月后，PPD皮肤试验阳转率为78．18％，而ELISPOT检测均为阴性。结论ELISPOT具有较高的特异性和敏感性，能真实反映入伍新兵的结核潜伏感染情况，可推广应用。 展开更多
关键词 结核 结核分枝杆菌 潜伏感染 酶联免疫斑点试验 重组cfp-10/esat-6融合蛋白 结核菌素试验 纯蛋白衍生物 卡介苗
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