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甘薯腐烂茎线虫重组酶聚合酶扩增方法的建立与应用 被引量：5
1
作者 马居奎 张成玲 +2 位作者 杨冬静 谢逸萍 孙厚俊 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2021年第2期293-298,共6页
【目的】本文以甘薯腐烂茎线虫ITS序列基因片段为靶标,建立了一种针对该线虫的RPA检测方法。【方法】RPA检测反应使用TwistAmp?Basic Kit,分别对甘薯腐烂茎线虫群体、单条线虫以及甘薯组织或土壤中的线虫进行特异性和灵敏度检测。【结果... 【目的】本文以甘薯腐烂茎线虫ITS序列基因片段为靶标,建立了一种针对该线虫的RPA检测方法。【方法】RPA检测反应使用TwistAmp?Basic Kit,分别对甘薯腐烂茎线虫群体、单条线虫以及甘薯组织或土壤中的线虫进行特异性和灵敏度检测。【结果】RPA方法可特异性鉴定甘薯腐烂茎线虫群体、单条线虫以及甘薯组织或土壤中的线虫。甘薯腐烂茎线虫基因组DNA和单条线虫的检出限分别为10-2 ng/μl和1/100条,与普通PCR检测灵敏度相当。【结论】RPA技术是一种耗时短、灵敏度高、稳定性强的甘薯腐烂茎线虫分子鉴定技术。 展开更多
关键词 甘薯腐烂茎线虫 重组酶聚合酶扩增 分子诊断
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金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增方法的建立 被引量：12
2
作者 吴华华 王锦鑫 +3 位作者 谷庆花 孙奥 司鑫鑫 董井泉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期797-801,共5页
为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的金黄色葡萄球菌快速检测方法,本研究根据该菌耐热核酸酶nuc基因的保守序列,设计特异性RPA扩增引物,并经反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。结果显示:建立的金黄色葡萄球菌快速检测方法可... 为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的金黄色葡萄球菌快速检测方法,本研究根据该菌耐热核酸酶nuc基因的保守序列,设计特异性RPA扩增引物,并经反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。结果显示:建立的金黄色葡萄球菌快速检测方法可在37℃孵育35 min特异性检测金黄色葡萄球菌,而对其它病原的检测结果为阴性,特异性较强;对该菌的纯培养物和人工污染该菌的牛奶样品中的最低检出限均为10 cfu,敏感性高。利用该方法和国标培养法同时检测市场购买的牛奶样品和猪肉样品,结果显示二者检测结果一致。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高且不依赖于昂贵的仪器设备,适用于基层实验室检测。 展开更多
关键词 重组酶聚合酶扩增 快速检测 金黄色葡萄球菌
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检测鱼传染性造血器官坏死病毒重组酶聚合酶扩增方法的建立及初步应用 被引量：4
3
作者 梁君妮 尹伟力 +3 位作者 刘鹏 马晓玲 段效辉 林森 《动物医学进展》 北大核心 2020年第2期14-17,共4页
为建立鱼类传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的快速检测方法,根据IHNV的G基因保守序列设计特异性引物,建立了基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的IHNV检测方法。该方法在30℃20min即可完成,对IHNV具有良好的特异性和敏感性,最低检出限为156ng/mL;... 为建立鱼类传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的快速检测方法,根据IHNV的G基因保守序列设计特异性引物,建立了基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的IHNV检测方法。该方法在30℃20min即可完成,对IHNV具有良好的特异性和敏感性,最低检出限为156ng/mL;用建立的RPA和RT-PCR对实验室保存的50份样品进行检测,结果显示,RPA的阳性检出率为14.00%,RT-PCR的阳性检出率为12.00%,说明RPA比RT-PCR具有更高的灵敏度。建立的RPA方法为IHNV的实验室检测提供了更多选择。 展开更多
关键词 重组酶聚合酶扩增技术 快速检测 鱼类传染性造血器官坏死病毒
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基于重组聚合酶扩增技术检测弓形虫方法的建立及应用 被引量：1
4
作者 宋绍征 顾乐盈 +3 位作者 武颖超 孟雅琴 于康英 黄晓华 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第2期107-112,共6页
目的 旨在建立一种基于重组聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术检测弓形虫的方法,并应用于宠物猫临床样本验证。方法 以弓形虫基因529重复序列(Rep-529)作为靶标基因序列,设计引物和探针,构建Rep-529重组质粒作... 目的 旨在建立一种基于重组聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术检测弓形虫的方法,并应用于宠物猫临床样本验证。方法 以弓形虫基因529重复序列(Rep-529)作为靶标基因序列,设计引物和探针,构建Rep-529重组质粒作为标准品,建立荧光RPA反应体系。将质粒标准品10倍比稀释成不同浓度作为检测模板,进行灵敏度测试;分别以弓形虫、隐孢子虫、新孢子虫、旋毛虫、贾第鞭毛虫、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫等几种寄生虫基因组DNA作为模板,进行特异性测试;同时应用荧光RPA法和RT-PCR法对52例阳性和40例阴性猫临床样本进行检测,比较分析2种方法检测结果的符合率。结果 本实验成功建立了一种以PTRep重组质粒为标准品、ToxD-F/ToxD-R为引物、RepD-P为荧光探针的RPA反应体系,反应恒定温度为39℃,反应时间为30 min,检测灵敏度为1拷贝/μL,与隐孢子虫、新孢子虫、旋毛虫、贾第鞭毛虫、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫等寄生虫无任何明显交叉反应,特异性良好。共检测了92例猫临床粪便样本,荧光RPA检测方法的阳性符合率高于常规RT-PCR法(98.08%vs.82.69%),阳性率差异无统计学意义(χ^(2)=1.392,P>0.05)。结论 本研究成功建立的弓形虫荧光RPA检测方法,具有快速、灵敏、特异、准确等特点,有可能作为弓形虫临床现场快速检测方法。 展开更多
关键词 重组聚合酶扩增 弓形虫 检测 灵敏度 特异性
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热带水产品中溶藻弧菌重组酶聚合酶等温扩增快速检测方法的建立
5
作者 钟键 孙良娟 +3 位作者 李红权 蔡永红 关睿 蔡双虎 《热带农业科学》 2025年第6期72-77,共6页
研究旨在开发一种用于水产品中溶藻弧菌的快速检测技术,以满足口岸和基层部门对食品安全监控的迫切需求。研究建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的新型检测技术,在恒定37℃条件下,该技术能够在短时间内实现核酸的指数级扩增,整个检... 研究旨在开发一种用于水产品中溶藻弧菌的快速检测技术,以满足口岸和基层部门对食品安全监控的迫切需求。研究建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的新型检测技术,在恒定37℃条件下,该技术能够在短时间内实现核酸的指数级扩增,整个检测流程仅需20 min。通过优化反应体系和条件,成功实现了对溶藻弧菌的高效和快速检测。结果表明,该检测技术具有高灵敏度和特异性,能够在50 cfu/管的菌量下准确检测到溶藻弧菌;此外,该技术操作简便、快速且节能,非常适合在口岸和基层部门推广应用,具有高效、快速、灵敏度高和特异性强的特点,在20 min内即可完成检测,为热带水产品的安全监控提供了强有力的技术支持。该技术不仅满足口岸和基层部门的快速检测需求,而且具有良好的应用推广前景。 展开更多
关键词 热带 水产品 溶藻弧菌 重组酶聚合酶等温扩增技术 快速检测
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重组酶聚合酶扩增技术在动物疫病病原检测中的应用
6
作者 张铭石 周若言 +2 位作者 杨婧 林佳笛 赵晓民 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第7期119-123,128,共6页
重组酶聚合酶扩增方法是近年来新发明的一种基于能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶的等温核酸扩增技术,不需要PCR仪,其操作简单、反应快速、特异性强、检测灵敏度高,对于动物疫病快速检测具有重... 重组酶聚合酶扩增方法是近年来新发明的一种基于能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶的等温核酸扩增技术,不需要PCR仪,其操作简单、反应快速、特异性强、检测灵敏度高,对于动物疫病快速检测具有重要应用价值。该文综述了重组酶聚合酶扩增技术在动物疫病病原检测中的应用现状,展望了应用前景,旨在为动物疫病的快速诊断及防控提供参考。 展开更多
关键词 重组酶 聚合酶 动物疫病 等温扩增
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基于重组酶聚合酶等温扩增的间日疟快速可视化检测研究
7
作者 李诗慧 高春花 +5 位作者 危芙蓉 王多全 贾孝凯 张璟 王颖 石锋 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第4期413-418,共6页
目的基于重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)建立一种快速、可视化检测间日疟原虫的方法,并进行检测效果评价。方法以间日疟原虫18S rRNA基因保守序列(Ge... 目的基于重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)建立一种快速、可视化检测间日疟原虫的方法,并进行检测效果评价。方法以间日疟原虫18S rRNA基因保守序列(GenBank:DQ660817.1)为靶序列,利用Primer Premier 5设计引物和探针,以间日疟原虫标准质粒(pUCPv)为模板进行RPA和LFD检测,建立敏感、特异的间日疟原虫核酸RPA-LFD快速可视化检测方法。用RPA-LFD检测浓度为1×10^(3)、1×10^(2)、1×10^(1)、1×10^(0)、1×10^(-1) copies/μL的pUCPv,评价其灵敏度;用RPA-LFD检测恶性疟、三日疟、卵形疟、内脏利什曼病患者及健康参与者全血DNA,评价其特异性,并利用该方法检测24例确诊间日疟患者全血DNA样本,评价其敏感性。结果建立了敏感、特异、快速可视化检测间日疟核酸的RPA-LFD方法,该方法能够在39℃恒温条件下20 min内完成对间日疟原虫的检测,灵敏度可达1 copy/μL,与其他疟原虫、内脏利什曼原虫无任何明显交叉反应,特异性为100%。24例确诊间日疟患者的DNA样本检测阳性率为100%。结论建立的检测间日疟原虫核酸的快速可视化RPA-LFD方法敏感性高、特异性好、操作简便,且只需简易加热装置即可进行,适用于低资源环境下间日疟原虫的快速检测。 展开更多
关键词 间日疟原虫 重组酶聚合酶等温扩增 侧流层析试纸条 快速检测
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基于重组酶介导等温核酸扩增技术快速检测食品中骆驼源性成分的方法建立及评价
8
作者 周臣清 张娟 +3 位作者 綦艳 赵玲 黄宝莹 杨纯佳 《中国乳品工业》 北大核心 2025年第2期75-80,共6页
文章开发一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)的方法,实现对食品中骆驼源性成分快速检测。针对骆驼细胞色素B(Cytochrome b,Cyt b)基因设计特异性引物,对建立的RAA体系优化其反应扩增条件,评估其... 文章开发一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)的方法,实现对食品中骆驼源性成分快速检测。针对骆驼细胞色素B(Cytochrome b,Cyt b)基因设计特异性引物,对建立的RAA体系优化其反应扩增条件,评估其特异性和灵敏度,并用建立的RAA法与GB/T 38164标准方法分别对24份市售骆驼制品进行检测并比对结果。结果表明,本研究建立的RAA法特异性强,乳及乳制品检出限为1.0%,肉及肉制品检出限为0.1%,且2种方法对24份骆驼乳肉及其制品检测结果一致。因此,本研究开发的RAA方法具有快速、特异性强、灵敏度高、操作简单等优点,市场应用前景广阔。 展开更多
关键词 重组酶介导等温核酸扩增技术 骆驼源性成分 细胞色素B基因 快速检测
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鸡星状病毒实时荧光逆转录重组酶介导核酸等温扩增检测方法的建立
9
作者 赵俊柯 余丹 +4 位作者 喻华英 尹文巧 张艳芳 谢志勤 谢芝勋 《动物医学进展》 北大核心 2025年第9期22-27,共6页
为建立针对鸡星状病毒(CAstV)的实时荧光逆转录重组酶介导核酸等温扩增(RT-RAA)检测方法,基于CAstV的ORF1b基因序列设计引物和探针。通过试验筛选,确定最优的引物和探针组合,并对反应条件进行优化。利用优化好的反应条件进行特异性、敏... 为建立针对鸡星状病毒(CAstV)的实时荧光逆转录重组酶介导核酸等温扩增(RT-RAA)检测方法,基于CAstV的ORF1b基因序列设计引物和探针。通过试验筛选,确定最优的引物和探针组合,并对反应条件进行优化。利用优化好的反应条件进行特异性、敏感性和重复性测试。针对从广西南宁不同地区采集的200份临床样品进行检测,并将结果与RT-PCR和RT-qPCR进行对比。结果显示,建立的实时荧光RT-RAA方法能在20 min内完成反应,最佳反应温度为41℃,显示出极高的灵敏度,最低检测限达到1.4×10^(1)copies/μL,比普通RT-PCR高100倍。所设计的引物特异性高,仅能扩增出CAstV病毒,而对其他病原体无交叉反应。重复性试验结果表明该方法具有良好的稳定性。与RT-qPCR相比,实时荧光RT-RAA的检测结果符合率高达98.27%,而普通RT-PCR与RT-RAA相比符合率仅为82.45%。建立了一种高效、快速、准确、灵敏且特异性强的实时荧光RT-RAA方法,适用于CAstV的临床大规模鉴别检测,为CAstV感染的监控提供了技术支持。 展开更多
关键词 鸡星状病毒 逆转录重组酶介导核酸等温扩增 快速检测 ORF1b基因
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牛支原体可视化重组酶聚合酶扩增检测方法的建立 被引量：1
10
作者 王健霖 田兴苗 +4 位作者 王景松 戴莎莎 郭亚男 何生虎 李继东 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第8期1811-1819,共9页
为建立一种对牛支原体高效、快捷的可视化重组酶聚合酶扩增(LFD-RPA)临床诊断方法,以牛支原体uvrc基因序列为靶基因,设计特异性引物和探针,通过筛选引物和探针、优化反应条件,并通过灵敏度、特异性、重复性和临床样本检测试验进行验证... 为建立一种对牛支原体高效、快捷的可视化重组酶聚合酶扩增(LFD-RPA)临床诊断方法,以牛支原体uvrc基因序列为靶基因,设计特异性引物和探针,通过筛选引物和探针、优化反应条件,并通过灵敏度、特异性、重复性和临床样本检测试验进行验证。结果显示,该试验建立的牛支原体LFD-RPA最佳引物为F2/R2,最佳反应条件为39℃、 25 min;检测灵敏度可达2.08 copies·μL^(-1),是普通PCR灵敏度的100倍;与滑液囊支原体、沙门氏菌、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌之间无交叉反应;重复性稳定;对50份鼻拭子样本进行检测,阳性率为26%,与我国行业标准PCR检测方法的符合率为89.6%。该试验成功建立了牛支原体LFD-RPA检测方法,该方法具有操作简便、快速、高效、敏感等优点,为牛支原体的临床快速诊断提供了技术支撑。 展开更多
关键词 牛支原体 重组酶聚合酶扩增 可视化 检测方法
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重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立与应用 被引量：1
11
作者 季拓 高玉芝 +1 位作者 王彦 高绪柱 《南京医科大学学报（自然科学版）》 北大核心 2024年第1期24-31,共8页
目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引... 目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物。通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对。根据最佳引物对,设计探针和修饰引物。在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系。根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件。使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性。以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度。收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价。结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果。该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强。应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致。与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性。结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌。该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力。 展开更多
关键词 嗜麦芽窄食单胞菌 重组酶聚合酶扩增 侧向流动试纸条
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肉制品中马源性成分重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法的建立及应用 被引量：1
12
作者 范维 孔维恒 +3 位作者 高晓月 董雨馨 李贺楠 郭文萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第3期203-210,共8页
目的:建立一种快速鉴定肉及肉制品中马源性成分的重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法。方法:以马源性ATpase 6基因为靶基因设计多组特异性引物和Exo探针,通过引物筛选及反应参数优化,建立一种采用重组酶介导链置换等温扩增技术检测... 目的:建立一种快速鉴定肉及肉制品中马源性成分的重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法。方法:以马源性ATpase 6基因为靶基因设计多组特异性引物和Exo探针,通过引物筛选及反应参数优化,建立一种采用重组酶介导链置换等温扩增技术检测马源性成分的方法,并对该方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证,同时通过对不同掺入比例混合样品、不同加工工艺模拟样品和市售样品进行检测,分析方法的检出限、适用性和准确性。结果:该方法反应迅速、特异性强、灵敏度高。可在39℃恒温条件下16min内完成反应;对23种非目标源性具有良好特异性;目标DNA的检测灵敏度可达到1.8copies/μL水平;对生肉的检出限为0.01%(质量分数,下同),对熟肉制品的检出限为0.1%;对90份市售样品进行检测,结果与标准方法一致。结论:建立的重组酶介导链置换等温扩增方法可用于肉及肉制品中马源性成分的掺假鉴别检测。 展开更多
关键词 重组酶介导链置换等温扩增 掺假鉴别 马源性成分 肉及肉制品
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实时重组酶辅助扩增技术快速检测狗源性成分
13
作者 刘明明 颜海燕 +3 位作者 周朝旭 叶语桦 李志刚 肖昭竞 《肉类研究》 北大核心 2025年第4期24-29,共6页
为快速检测狗源性成分,针对cytb基因保守区域设计3对重组酶辅助扩增(recombinaseaided amplification,RAA)引物和1条核酸外切酶(exonuclease,exo)探针,通过引物和探针浓度的筛选,构建一种实时RAA(real-time RAA,Rt-RAA)方法。利用交叉... 为快速检测狗源性成分,针对cytb基因保守区域设计3对重组酶辅助扩增(recombinaseaided amplification,RAA)引物和1条核酸外切酶(exonuclease,exo)探针,通过引物和探针浓度的筛选,构建一种实时RAA(real-time RAA,Rt-RAA)方法。利用交叉反应和重复性实验对该检测方法的特异性和稳定性进行评估,并将Rt-RAA方法灵敏度以及对混合模拟样品和市售样品的检测结果与相应的国标检测方法进行对比。结果表明,Rt-RAA检测方法特异性强、稳定性好,在30 min内可检测到目的序列,对狗源性成分的检出限为0.2%,明显优于实时荧光聚合酶链式反应检测方法,应用Rt-RAA方法与国标方法对模拟样品和市售实际样品检测结果完全一致。因此,本研究建立的Rt-RAA检测方法适用于狗源性成分的检测,为肉源性成分鉴定提供了另一种快速、准确的新方法。 展开更多
关键词 实时荧光重组酶辅助扩增技术 狗源性成分 肉制品掺假
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副结核分枝杆菌重组酶介导扩增-侧向流试纸条检测方法的建立与初步应用 被引量：3
14
作者 南岳 龙美贞 +2 位作者 王元智 刘一朵 周向梅 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期3255-3260,共6页
旨在建立一种副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)精准快速的检测方法,结合重组酶介导扩增(recombinase-aid amplification,RAA)和侧向流试纸条(lateral flow dipstick,LFD)技术,以MAP的特异性多拷贝插入元... 旨在建立一种副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)精准快速的检测方法,结合重组酶介导扩增(recombinase-aid amplification,RAA)和侧向流试纸条(lateral flow dipstick,LFD)技术,以MAP的特异性多拷贝插入元件IS900设计引物和探针,通过优化反应时间和温度等条件,建立可用于MAP现场可视化检测的RAA-LFD方法。该检测方法在35℃条件下恒温反应30 min即可实现对MAP目的基因的有效扩增。试验结果显示:该方法可特异性地检测出MAP,不与其他常见的病原发生交叉反应;对MAP标准品的最低检测限可达到10 fg·μL^(-1);使用该方法对149份牛奶样品进行检测,与传统的PCR相比,其敏感性为100%。综上,本研究成功建立了一种针对于MAP的精准快速的试纸条检测方法,并具有广泛的应用前景。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 重组酶介导扩增 侧向流试纸条
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猪伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增快速检测方法的建立与应用
15
作者 谢明杰 康龙滨 +4 位作者 陈秋勇 吴学敏 王隆柏 周伦江 刘玉涛 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期753-758,共6页
【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重... 【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重组酶介导核酸扩增检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,应用该方法对临床样品进行检测。【结果】该方法在43℃恒温反应23 min即可完成PRV核酸扩增,最低检出限为111 copies·μL^(-1);与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrheavirus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)均无交叉反应。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;40份临床样品检测结果显示PRV阳性率为15%(6/40),检测结果与常规聚合酶链式反应(PCR)一致。【结论】成功建立了简便快速、高效准确的PRV实时荧光RAA检测方法,为PRV的快速检测和流行病学调查提供了新的检测手段。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 荧光重组酶介导核酸扩增 检测方法
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重组酶聚合酶扩增技术在动物病原菌检测中的应用进展 被引量：8
16
作者 张蕾 陈亮 +12 位作者 江波涛 冯万宇 兰世捷 苗艳 沈思思 李丹 田秋丰 杨昊天 张艳 刘雪松 黄宣凯 钟鹏 史同瑞 《动物医学进展》 北大核心 2024年第1期89-94,共6页
体外核酸扩增技术在动物疫病病原检测中应用广泛。重组酶聚合酶扩增(RPA)作为一种新型的核酸等温扩增技术,可在较低温度(37~42℃)下扩增DNA或RNA,具有反应时间短、样品制备量少、特异性和敏感性高等优点。RPA突破了常规聚合酶链反应(PCR... 体外核酸扩增技术在动物疫病病原检测中应用广泛。重组酶聚合酶扩增(RPA)作为一种新型的核酸等温扩增技术,可在较低温度(37~42℃)下扩增DNA或RNA,具有反应时间短、样品制备量少、特异性和敏感性高等优点。RPA突破了常规聚合酶链反应(PCR)实施时对实验室条件的依赖性,并能高效和灵敏地检测动物疫病病原。基于RPA技术的病原菌检测方法可实现对动物细菌病的现场快速诊断。论文综述了RPA技术的反应体系和条件、反应原理和产物检测方法等,介绍了RPA技术在动物病原菌检测中的应用和潜在价值,以期为动物疾病快速诊断研究提供参考。 展开更多
关键词 重组酶聚合酶扩增 快速检测 病原菌 应用
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十足目虹彩病毒重组酶介导等温扩增检测方法的建立与应用 被引量：1
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作者 黄海莉 田飞焱 +4 位作者 孟霞 裴建明 徐节华 刘文珍 周文华 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期1153-1158,共6页
十足目虹彩病毒(DIV1)的宿主范围和流行区域广泛,已成为近些年危害我国虾类养殖的重要病原之一。为建立一种DIV1重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法,本研究根据DIV1 ATPase基因保守序列设计了2对引物和1条探针,经过反应条件优化,结果显示... 十足目虹彩病毒(DIV1)的宿主范围和流行区域广泛,已成为近些年危害我国虾类养殖的重要病原之一。为建立一种DIV1重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法,本研究根据DIV1 ATPase基因保守序列设计了2对引物和1条探针,经过反应条件优化,结果显示,引物对DIV1-RAA-F1/R1与探针DIV1-RAA-P的组合扩增效率较高,在配制50μL反应体系中采用浓度为10μmol/L的DIV1-RAA-F1/R1各2μL,10μmol/L的DIV1-RAA-P 0.6μL,42℃恒温条件下反应15 min即可高效检出DIV1,初步建立了DIV1 RAA检测方法。提取DIV1、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病病毒(IHHNV)、虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、嗜水气单胞菌(Ah)及弗氏柠檬酸杆菌(Cf)等病原的DNA为模板,利用该方法检测。结果显示,该方法仅能检测到DIV1,与其他虾类病原均无交叉反应;以浓度为1.05×10^(7)拷贝/μL~1.05×10^(0)拷贝/μL的pUC57-DIV1质粒标准品为模板,利用该方法检测。结果显示,该方法的检测限为1.05×10^(1)拷贝/μL,与qPCR的检测限一致;以同一批次和不同批次提取的2个不同浓度的质粒标准品pUC57-DIV1为模板,进行重复性试验,结果显示,该方法对相同浓度质粒标准品的检测结果均一致,扩增曲线差异较小。利用该RAA方法与报道的qPCR、套式PCR方法分别对60份克氏原螯虾组织样品提取的DNA进行检测并对比结果,结果显示RAA方法和qPCR方法均检测到6份DIV1阳性样品,而套式PCR仅检测到5份阳性样品,RAA方法和qPCR方法的符合率达100%,敏感性较套式PCR高。本研究建立的DIV1 RRA检测方法特异性强、灵敏度高,操作简单,反应时间短,结果可靠,可用于DIV1临床和现地的快速检测。 展开更多
关键词 十足目虹彩病毒 重组酶介导等温扩增技术 快检方法
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塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立 被引量：16
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作者 樊晓旭 宋翥远 +11 位作者 赵永刚 赵明 董雅琴 张永强 李园丽 迟田英 刘春菊 戈胜强 张志诚 吴晓东 王树双 王志亮 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期406-410,共5页
为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病... 为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。 展开更多
关键词 塞尼卡谷病毒 重组酶聚合酶扩增 侧向流试纸条
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基于重组酶聚合酶扩增技术的犬细小病毒快速检测方法的建立 被引量：10
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作者 姜一曈 王昭华 +4 位作者 鑫婷 贾红 郭晓宇 朱鸿飞 侯绍华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期926-929,共4页
为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法。该方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出CPV。特异性试验... 为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法。该方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出CPV。特异性试验结果显示,除CPV (BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等检测均为阴性;敏感性试验结果显示,以重组质粒pEASY-CPV-VP2为模板,RPA的检测下限为1×10~1拷贝/μL,其敏感度比普通PCR方法高10倍。利用建立的RPA方法对疑似CPV感染的临床样品的阳性检出率为88%,高于普通PCR的检出率(82%)和胶体金的检出率(76%)。本研究建立的CPV RPA检测方法操作简单,反应灵敏,结果确实可靠,适用于CPV的快速检测。 展开更多
关键词 犬细小病毒 重组酶聚合酶扩增技术 快速检测
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塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术(RPA)实时荧光检测方法的建立 被引量：18
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作者 樊晓旭 哈登楚日亚 +7 位作者 王英丽 王姣 刘春菊 迟田英 赵永刚 张志诚 吴晓东 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2017年第8期81-86,共6页
塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特... 塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,本方法在40℃、10 min内检测的最低浓度为28拷贝/μL;与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应;通过3次重复试验检测2.8×10~6~2.8×10~1拷贝/μL的6个稀释度样品,在荧光强度达1500 mV所需时间变异系数范围在2.44%~14.95%。该等温、快速扩增方法为猪群出现水疱性疾病的鉴别诊断提供了技术支持,对及时采取适当防控措施具有重要意义。 展开更多
关键词 塞尼卡谷病毒 实时 荧光 重组酶聚合酶扩增
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