人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建与初步应用 被引量：5

1

作者 章卫平 曹雪涛 +4 位作者 马施华 黄欣 张明徽 陶群 叶天星 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1996年第1期26-32,共7页

利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包... 利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包装，病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10^6CFU／m1)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后．分泌G-CSF达168U／m1．Southern分析表明hG-CSF基因己整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中，Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在ENIH3T3-G-CSF细胞的表达。NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内．能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 人G-CSF基因 克隆 重组逆转录病毒载体 构建 应用 粒细胞集落刺激因子 基因治疗

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人白细胞介素2重组逆转录病毒载体的构建与表达 被引量：3

2

作者 章卫平 曹雪涛 +3 位作者 王建莉 马施华 黄欣 于益芝 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1996年第3期186-190,共5页

通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA．并经核苷酸测序加以证实，将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN，构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2．体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10^4CFU／ml,NIH 3T3小鼠成纤... 通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA．并经核苷酸测序加以证实，将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN，构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2．体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10^4CFU／ml,NIH 3T3小鼠成纤维细胞感染hIL-2重组逆转录病毒后．分泌IL-2水平达118.2U／ml；PCR从其基因组DNA中扩增到NeoR基因片段．提示重组逆转录病毒载体已整合至宿主细胞的基因组DNA中。本研究为开展人IL-2基因治疗奠定了基础. 展开更多

关键词 人白细胞介素2 重组逆转录病毒载体 构建 表达 基因治疗 肿瘤瘤苗

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重组逆转录病毒浓缩方法研究 被引量：2

3

作者 王凤阳 扈荣良 +6 位作者 邹啸环 池海英 杜卫华 赵君 张守峰 李敏 殷震 《生物学杂志》 CAS CSCD 2001年第2期11-13,共3页

选择含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ (Neor)的重组逆转录病毒载体 ,通过包装细胞进行包装 ,得到了含有重组逆转录病毒粒子的病毒溶液 ,该病毒溶液分别采用差速离心和滤膜截留两种方法进行浓缩 ,浓缩前、后的病毒溶液体外感染靶细胞NIH3T3以测... 选择含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ (Neor)的重组逆转录病毒载体 ,通过包装细胞进行包装 ,得到了含有重组逆转录病毒粒子的病毒溶液 ,该病毒溶液分别采用差速离心和滤膜截留两种方法进行浓缩 ,浓缩前、后的病毒溶液体外感染靶细胞NIH3T3以测定其滴度。结果显示 :差速离心法的浓缩效率要优于滤膜截留法的浓缩效率 ,其浓缩效率能达到 34 5%。 展开更多

关键词 重组逆转录病毒 差速离心 滤膜截留 浓缩方法 载体

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含LacZ重组逆转录病毒的制备及其在NIH_3T_3细胞的表达 被引量：1

4

作者 王凤阳 孟庆文 +4 位作者 扈荣良 池海英 张茂林 于康震 殷震 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期329-331,共3页

构建了含有 3.7kbLacZ的重组逆转录病毒载体 ,转染包装细胞系PA317后 ,经G418筛选 ,得到了G418抗性的产毒细胞系 ,用收获的含有重组逆转录病毒粒子的浓缩病毒上清 ,感染NIH3T3细胞 ,经X_gal染色检测 ,发现表达了LacZ的NIH3T3细胞呈蓝色。

关键词 重组逆转录病毒 LACZ NIH3T3细胞 基因表达 外源基因 转基因

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重组逆转录病毒介导的转蚓激酶基因兔 被引量：1

5

作者 刘殿峰 张嘉保 +4 位作者 张守峰 任文陟 姚伟 张锐 扈荣良 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2007年第6期449-452,I0005,共5页

目的通过重组逆转录病毒介导获得转蚓激酶基因家兔。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清... 目的通过重组逆转录病毒介导获得转蚓激酶基因家兔。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清直接注射雄性兔的睾丸组织转染精原干细胞。结果病毒上清经NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL。病毒注射3月龄兔睾丸组织,过1.5个月取其睾丸、肾、脾、肝、肺进行组织切片观察,结果正常。提取交配所得F0、F1代仔兔基因组,经PCR、Southern检测,转基因阳性率F0代为6.3%(2/32)、F1代为15.3%(2/13)。结论通过重组逆转录病毒直接注射3月龄兔睾丸组织可获得转基因兔,病毒对兔的脏器无损害。 展开更多

关键词 蚓激酶 重组逆转录病毒 包装 转染 转基因

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含人TNF-α基因的重组逆转录病毒载体的构建、包装及对人肝癌细胞的感染

6

作者 冯学胜 汤钊猷 +4 位作者 叶胜龙 戈凯 郑仲承 王立群 刘新垣 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1995年第4期275-275,共1页

利用逆转录病毒载体LN系列的三种载体LXSN，LNCX和LNSX构建了插入TNFα基因的重组逆转录病毒载体L-tnfSN，LNC-tnf和LNS-tnf．重组载体用磷酸钙沉淀法引入病毒包装细胞PA317，经G418筛选后，用NIH3T3细胞测定病毒滴度，结果表明L-tnfSN... 利用逆转录病毒载体LN系列的三种载体LXSN，LNCX和LNSX构建了插入TNFα基因的重组逆转录病毒载体L-tnfSN，LNC-tnf和LNS-tnf．重组载体用磷酸钙沉淀法引入病毒包装细胞PA317，经G418筛选后，用NIH3T3细胞测定病毒滴度，结果表明L-tnfSN产生的病毒滴度最高(1×10^5CFU／ml)， 展开更多

关键词 人肝癌细胞 TNF-Α基因 病毒滴度 感染 重组逆转录病毒载体 TNFΑ基因 包装细胞 磷酸钙沉淀法 构建 NIH3T3细胞

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hEPO　cDNA重组逆转录病毒的构建

7

作者 瞿成奎 魏汉东 +2 位作者 贺福初 王立生 吴祖泽 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1996年第2期150-153,共4页

通过ＤＮＡ重组技术，将不含非编码区的ｈＥＰＯｃＤＮＡ片段重组到逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ，ｐＬＮＣＸ中重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞培养上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，使之在筛选培养基中形... 通过ＤＮＡ重组技术，将不含非编码区的ｈＥＰＯｃＤＮＡ片段重组到逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ，ｐＬＮＣＸ中重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞培养上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，使之在筛选培养基中形成典型的Ｇ４１８抗性克隆，该克隆细胞染色体中成功地整合了ＥＰＯｃＤＮＡ，并且表达出有生物学活性的红细胞生成素（ＥＰＯ）产物。 展开更多

关键词 红细胞生成素 重组逆转录病毒 载体 基因转移

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勘误:EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

8

作者 陈云 周锋 +3 位作者 孙倍成 刘根焰 王冰 姚堃 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期274-274,共1页

因本文作者失误,发表在《细胞与分子免疫学杂志》2009年第25卷第11期第1013-1015页的“EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定”论文中,图2A及图3用错了荧光显微镜和流式细胞术的图像。

关键词 重组逆转录病毒载体 流式细胞术 稳定表达细胞株 荧光显微镜 A基因 《细胞与分子免疫学杂志》

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615小鼠MHC Ⅰ cDNA重组逆转录病毒基因治疗载体的构建和包装 被引量：2

9

作者 龚浩 李龙江 +3 位作者 温玉明 王昌美 陈俊杰 彭文珍 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期404-407,共4页

目的:制备615小鼠MHCⅠ目的基因(H-2Kk)载体,获得高表达MHCⅠ分子功能的单克隆细胞株。方法:将615小鼠MHCⅠ(H-2Kk)cDNA定向连接至PLXSN逆转录病毒质粒,转染E.coli JM109,限制性酶切分析法筛选出重组质粒PLXSN-H-2Kk,继而转染PA317细胞,... 目的:制备615小鼠MHCⅠ目的基因(H-2Kk)载体,获得高表达MHCⅠ分子功能的单克隆细胞株。方法:将615小鼠MHCⅠ(H-2Kk)cDNA定向连接至PLXSN逆转录病毒质粒,转染E.coli JM109,限制性酶切分析法筛选出重组质粒PLXSN-H-2Kk,继而转染PA317细胞,经G418筛选获得抗性PA317单克隆细胞株,并转染NIH3T3细胞,依抗性NIH3T3细胞克隆数目,鉴定病毒液的滴度和PA317单克隆细胞株。结果:转染成功的病毒液滴度位于1.6×104～1.1×105 CFU/ml之间,PA317单克隆细胞株成片生长良好,并高表达H-2Kk产物。结论:H-2Kk cDNA重组逆转录病毒质粒的成功构建、包装和滴度鉴定为在615小鼠上进行恶性肿瘤的MHC Ⅰ转基因治疗奠定了物质基础。 展开更多

关键词 基因治疗 MHCⅠ目的基因 PA317细胞 基因载体 重组逆转录病毒质粒 肿瘤治疗

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蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达 被引量：1

10

作者 周兴 张居农 《中国奶牛》 2007年第S1期116-119,共4页

构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R,以200μg、500μg、1000μg、2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染... 构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R,以200μg、500μg、1000μg、2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后收集病毒上清感染NIH_3T_3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×10~4CFU/mL。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,即蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。 展开更多

关键词 蚓激酶 重组逆转录病毒 包装 转染 表达

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人endostatin基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中表达

11

作者 王轩 李希 +2 位作者 刘福坤 黎介寿 徐根兴 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期693-697,共5页

　为探讨转人血管内皮抑制基因(endostatin)在转染细胞中的表达,利用逆转录病毒载体构建人endostatin基因的重组质粒,通过脂质体(lipofectamine)将重组质粒导入包装细胞PA317,制备重组病毒液.用重组病毒液感染NIH3T3细胞,经G418筛选获... 　为探讨转人血管内皮抑制基因(endostatin)在转染细胞中的表达,利用逆转录病毒载体构建人endostatin基因的重组质粒,通过脂质体(lipofectamine)将重组质粒导入包装细胞PA317,制备重组病毒液.用重组病毒液感染NIH3T3细胞,经G418筛选获得转人endostatin基因细胞株NIH3T3＿endo.同法制备对照细胞株NIH3T3＿pLncx.PCR检测NIH3T3＿endo细胞基因组,在扩增产物中有一550bp人endostatin基因特异性片段,对照组为阴性.免疫组化测定示仅NIH3T3＿endo细胞中有外源性endostatin蛋白的表达.说明人endostatin基因已被成功导入NIH3T3细胞,并获得稳定表达. 展开更多

关键词 人endostatin基因组 血管内皮抑制素 重组逆转录病毒 NIH3T3细胞 基因重组 基因表达 载体构建 抗肿瘤血管疗法

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蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达

12

作者 周兴 张居农 《草食家畜》 2007年第1期17-20,共4页

构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR,以200μg、500μg、1000μg、2000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA... 构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR,以200μg、500μg、1000μg、2000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/ml。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,也就是说蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。 展开更多

关键词 蚓激酶 重组逆转录病毒 包装 转染 表达

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绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建及其表达 被引量：7

13

作者 刘德莉 胡晓洁 +2 位作者 吴娟娟 刘伟 曹谊林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期424-425,438,共3页

目的　实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法　构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果　转染细... 目的　实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法　构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果　转染细胞于 48h后 ,在荧光显微镜蓝光激发波长下 ,可发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～5 0 %。感染靶细胞内GFP的有效表达可维持 2个月。结论　构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,可作为组织工程化细胞标记 ,用于细胞动态研究 ,其方法简便、灵敏。 展开更多

关键词 重组逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白 细胞标记 GFP

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携EGFP基因的逆转录病毒包装细胞的分选和滴度测定 被引量：5

14

作者 张银刚 郭雄 +2 位作者 周京军 鱼兵 刘兵 《第一军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期30-32,36,共4页

目的探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞,用荧光显微镜观察转染结果;依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞,并利用PCR、RT-... 目的探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞,用荧光显微镜观察转染结果;依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞,并利用PCR、RT-PCR对其鉴定;以NIH3T3为靶细胞,对其滴度进行测定。结果荧光显微镜显示用脂质体介导的方法成功的转染PA317细胞,在4次连续流式细胞仪分选后得到了稳定表达的多克隆和单克隆源性的包装细胞。PCR和RT-PCR分别从多克隆和单克隆源性的包装细胞细胞基因组DNA以及多克隆和部分(6/8)单克隆源性的包装细胞培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的EGFP片段。滴度测定显示得到的包装细胞能够产生有效的病毒滴度。结论荧光激活细胞分选技术是获得有效病毒滴度的包装细胞的有效方法。 展开更多

关键词 EGFP 重组逆转录病毒载体 荧光激活细胞分选技术 基因转染

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骨形成蛋白-7基因逆转录病毒载体的构建及其表达 被引量：3

15

作者 祝联 刘伟 +5 位作者 陈兵 刘德莉 刘方军 吴娟娟 陆俊弘 曹谊林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期329-331,共3页

目的 :实现骨形成蛋白 7(BMP 7)基因在骨髓基质干细胞中的稳定、长久表达。方法 :构建重组BMP 7逆转录病毒表达载体。通过PT6 7包装细胞克隆 ,嘌呤霉素筛选、扩增 ,获得含BMP 7基因的逆转录病毒液 ,直接感染骨髓基质干细胞 ,用免疫组化... 目的 :实现骨形成蛋白 7(BMP 7)基因在骨髓基质干细胞中的稳定、长久表达。方法 :构建重组BMP 7逆转录病毒表达载体。通过PT6 7包装细胞克隆 ,嘌呤霉素筛选、扩增 ,获得含BMP 7基因的逆转录病毒液 ,直接感染骨髓基质干细胞 ,用免疫组化方法检测BMP 7的表达。结果 :成功地构建了重组BMP 7逆转录病毒表达载体 ,并可在骨髓基质干细胞中表达BMP 7。结论 :重组逆转录病毒表达载体转染的靶细胞可表达BMP 7,为组织工程中骨和软骨种子细胞的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 重组逆转录病毒载体 骨形成蛋白—7 组织工程 骨髓基质干细胞

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Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

16

作者 刘佳梅 陈东 孟晓婷 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期831-833,共3页

目的:分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1(Islet-1)基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1TA中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其... 目的:分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1(Islet-1)基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1TA中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果:RT-PCR产物为1050bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论:分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。 展开更多

关键词 胰岛素基因增强结合蛋白1基因 克隆 重组逆转录病毒载体

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重组多顺反子逆转录病毒介导的人载脂蛋白AI与卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶在肌源性细胞的表达

17

作者 于书真 范乐明 +3 位作者 王南 陈秀英 陈琪 魏恩会 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第10期964-965,共2页

关键词 动脉粥样硬化 重组多顺反子逆转录病毒 cPOAI

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经典方法与LaSRT法测定绿色荧光蛋白标记重组病毒滴度的研究 被引量：15

18

作者 江千里 王健民 +2 位作者 江汕 温丽敏 周虹 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第10期1101-1103,共3页

目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl... 目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl带有GFP 标记基因的病毒感染,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以流式细胞仪检测细胞eGFP+率。病毒滴度(TU/ml)=(2×105×细胞eGFP+率)/病毒原液体积。(2)LaSRT法:NIH3T3 细胞以5 000/孔接种于96 孔板,12 h后更换成完全培养液90 μl/孔,以8孔为一组,第1 孔中加入病毒液10 μl,此后每孔依次10∶1 倍比稀释,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以浓度自高到低的方向,在荧光倒置显微镜下确定计量孔(第n孔),计数孔中的阳性细胞数m。病毒滴度(TU/ml)=m×10n+1。(3)对7批病毒以LaSRT法研究,探讨冻存/复苏过程对重组病毒滴度的影响。结果经典方法测定的重组病毒滴度为(1.54±0.38)×106 TU/ml,LaSRT法测定的病毒滴度为(1.33±0.57)×106 TU/ml,两者无统计学差异(P>0.05)。LaSRT法可以大批量、快速地测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度。单次冻存/复苏后的病毒滴度为冻存前的(18.1±9.9)%(n=7)。结论LaSRT法和经典方法测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度,结果无统计学差异; 展开更多

关键词 经典方法 LaSRT法 测定 绿色荧光蛋白 病毒滴度测定法 基因重组逆转录病毒

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嵌合跨膜型人CD55基因的重组逆病毒表达质粒的构建 被引量：1

19

作者 杜瑞琴 白云 +1 位作者 黎万玲 姜曼 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期48-51,共4页

目的　构建嵌合跨膜型CD5 5基因的重组逆病毒表达质粒。方法　采用PCR技术扩增编码CD5 5信号肽及成熟蛋白胞外区 (-3 4 -3 0 4aa)的DNA片段 ,双侧引入EcoRⅠ、SspⅠ位点 ,与编码CD46分子的跨膜区及膜内区 (2 70～ 3 5 0aa)的DNA片段的5... 目的　构建嵌合跨膜型CD5 5基因的重组逆病毒表达质粒。方法　采用PCR技术扩增编码CD5 5信号肽及成熟蛋白胞外区 (-3 4 -3 0 4aa)的DNA片段 ,双侧引入EcoRⅠ、SspⅠ位点 ,与编码CD46分子的跨膜区及膜内区 (2 70～ 3 5 0aa)的DNA片段的5’末端自身的StuI位点连接 ,构建嵌合跨膜型CD5 5DNA片段 ,序列测定后将此嵌合CD5 5片段与pLXSN逆病毒载体连接构建重组表达质粒 ,酶切鉴定插入片段的方向。结果　DNA序列测定证实所构建的嵌合跨膜型CD5DNA阅读框完整、连接部位序列正确 ;HindⅢ酶切鉴定得到了正向插入的CD5 5TM pLXSN重组表达质粒。结论　我们成功构建了嵌合跨膜型CD5 5DNA片段及含此片段的重组逆病毒表达载体CD5 5TM pLXSN ,为进一步在真核细胞中表达嵌合分子 ,比较研究GPI锚固型CD5 5分子与细胞活化信号转导的关系建立良好对照并为应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了分子生物学基础。 展开更多

关键词 嵌合跨膜型分子 重组逆转录病毒表达载体 CD55基因 质粒

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稳定表达猪瘟病毒E2蛋白细胞系的建立及其生物活性分析 被引量：3

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作者 田宏 刘湘涛 +5 位作者 吴锦艳 尚佑军 郑海学 代兴国 孙世琪 谢庆阁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期731-733,共3页

目的:建立一种能稳定表达猪瘟E2蛋白的真核细胞系,并对E2蛋白的生物活性进行分析。方法:从实验感染兔脾组织中提取总RNA,应用RT-PCR得到了CSFVC-株结构蛋白基因E2,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载... 目的:建立一种能稳定表达猪瘟E2蛋白的真核细胞系,并对E2蛋白的生物活性进行分析。方法:从实验感染兔脾组织中提取总RNA,应用RT-PCR得到了CSFVC-株结构蛋白基因E2,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK15细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA方法对表达蛋白的生物活性进行分析。结果:初步检测显示所建立的PK15-E2细胞能稳定携带外源基因进行传代,而且表达的E2蛋白能被CSF阳性血清所识别,并具有良好的生物活性。结论:通过该方法建立的真核表达系统是切实可行的,能为猪瘟的预防和诊断奠定良好的基础。 展开更多

关键词 猪瘟C株E2基因 重组逆转录病毒载体 PK15细胞 基因表达

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