共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响(R68) 被引量：1

1

作者 张元豫 刘霞 +2 位作者 李坤 郭永荣 白靖平 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期755-760,788,共7页

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/... 目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为7.410±1.738、8.844±1.981、22.4272±2.058、2.445±0.2517(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。 展开更多

关键词 重组结核杆菌热休克蛋白10 破骨细胞生成 共培养 核因子KB受体活化因子配体 活化T细胞核因子1蛋白 护骨素 C-Fos

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人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定 被引量：1

2

作者 高红 戴五星 +4 位作者 黄海浪 陈智浩 梁靓 程继忠 皇甫永穆 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期243-246,251,共5页

目的　构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法　用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 p... 目的　构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法　用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果　酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论　成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。 展开更多

关键词 HSP65 BCG 结核杆菌 热休克蛋白 高效表达 重组卡介苗 质粒 信号肽 重组体 基因

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结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达 被引量：3

3

作者 叶菁 隋延仿 +1 位作者 陈广生 张秀敏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期443-445,共3页

目的 :克隆结核杆菌热休克蛋白 70 (TBhsp70 )基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因 ,并将其克隆到pUC19中 ,进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组表达质粒pGEX TBhs... 目的 :克隆结核杆菌热休克蛋白 70 (TBhsp70 )基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因 ,并将其克隆到pUC19中 ,进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组表达质粒pGEX TBhsp70 ,在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果 :成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实 ,与GenBank公布的序列一致。含pGEX TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,能够表达相对分子质量 (Mr)约为 96 0 0 0的融合蛋白。结论 :获得了TBhsp70基因 ,成功地构建了原核表达质粒pGEX TBhsp70 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为其相关研究奠定了一定的基础。 展开更多

关键词 结核杆菌 热休克蛋白 克隆 原核表达

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结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建 被引量：3

4

作者 曾曙光 张积仁 +4 位作者 章锦才 吴世卿 刘启才 艾伟健 薛国初 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期433-436,445,共5页

目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物... 目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列。将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒。将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒。Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Westernblot检测mtHSP70蛋白表达情况。结果酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达。结论含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础。 展开更多

关键词 结核杆菌 热休克蛋白70 增强型绿色荧光蛋白 真核表达 免疫治疗 肿瘤

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人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定 被引量：5

5

作者 程继忠 梁驹卿 +2 位作者 肖红 海涛 皇甫永穆 《同济医科大学学报》 CSCD 1997年第5期331-335,共5页

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆... 用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。 展开更多

关键词 结核杆菌 卡介苗 启动子 热休克蛋白

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人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达 被引量：1

6

作者 党育平 王刚 +3 位作者 范雪莉 沈柱 樊建勇 刘玉峰 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期208-210,共3页

目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插... 目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 人乳头瘤病毒6型 E7蛋白 结核杆菌 热休克蛋白70 融合基因 原核表达

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结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的高效自发再折叠和再组装 被引量：5

7

作者 毛启龙 冯修光 昌增益 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第1期87-90,共4页

来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3以九聚体的形式存在 .用三种不同的强变性条件 (10 0℃加热15min ,12mol/L脲或 8mol/L盐酸胍处理 4h)将Hsp16 3变性 ,然后通过冷却或透析使之复性 ,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色... 来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3以九聚体的形式存在 .用三种不同的强变性条件 (10 0℃加热15min ,12mol/L脲或 8mol/L盐酸胍处理 4h)将Hsp16 3变性 ,然后通过冷却或透析使之复性 ,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色性光谱比较了变性 复性前后Hsp16 3的各个层次高级结构 .结果显示 ,变性的Hsp16 3几乎可以完全恢复至天然构象 ,这表明小分子热休克蛋白Hsp16 3具有很强的自发折叠和组装能力 . 展开更多

关键词 热休克蛋白 变性 复性 再折叠 再组装 结核杆菌 HSP16.3 小分子

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从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位 被引量：2

8

作者 王缚鲲 邹全明 +4 位作者 张卫军 田文标 杨王君 郭学青 郭红 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第11期1332-1335,共4页

目的　建立一种有效的从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法　重组基因工程大肠杆菌发酵后 ,表达的Hp的HspA包涵体经洗涤、变性、复性 ,采用QSepharoseHighPerformance阴离子交换层析和Superdex 75凝胶过... 目的　建立一种有效的从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法　重组基因工程大肠杆菌发酵后 ,表达的Hp的HspA包涵体经洗涤、变性、复性 ,采用QSepharoseHighPerformance阴离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化。使用SDS PAGE和HPLC检测纯度 ,选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果　Hp的HspA包涵体经洗涤和溶解后 ,Hp的HspA的纯度 >60 %。包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过 95 %。Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论　本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白 。 展开更多

关键词 包涵体 蛋白纯化 重组人幽门螺杆菌 热休克蛋白

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重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化 被引量：1

9

作者 冉向阳 邹全明 +2 位作者 毛旭虎 田文标 王缚鲲 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期539-542,共4页

目的　在大肠杆菌中高效表达幽门螺杆菌的热休克蛋白A基因 (hspA) ,并对其初步纯化。 方法　用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后 ,克隆于表达载体 pIM 1中 ,转化大肠杆菌。以SDS PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达 ,并测定N 端氨基酸... 目的　在大肠杆菌中高效表达幽门螺杆菌的热休克蛋白A基因 (hspA) ,并对其初步纯化。 方法　用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后 ,克隆于表达载体 pIM 1中 ,转化大肠杆菌。以SDS PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达 ,并测定N 端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析 ,对重组hspA进行初步纯化。结果　扩增的hspA基因为 35 7bp ,并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的 6 0 .5 %。免疫印迹及氨基酸测序结果证实 ,表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为 87.8%。结论　hspA亚单位的高效表达与初步纯化 。 展开更多

关键词 幽门螺杆菌 热休克蛋白A亚单位 重组表达 纯化 SDS-PAGE 免疫印迹

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重组人热休克蛋白70-抗原肽复合物对肿瘤的免疫治疗作用研究 被引量：6

10

作者 马杰 蒋春晓 +3 位作者 焦平 陈月 耿学军 颜炜群 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期285-289,共5页

目的:使用以毕赤酵母X-33为宿主菌,重组表达制备的rhHSP70与合成的HER2/neu抗原肽体外结合形成复合物,探讨其在肿瘤免疫治疗中的有效性。方法:在ADP存在的条件下,将rhHSP70与纯化的HER2/neu抗原肽体外非共价结合形成复合物,并分次免疫BA... 目的:使用以毕赤酵母X-33为宿主菌,重组表达制备的rhHSP70与合成的HER2/neu抗原肽体外结合形成复合物,探讨其在肿瘤免疫治疗中的有效性。方法:在ADP存在的条件下,将rhHSP70与纯化的HER2/neu抗原肽体外非共价结合形成复合物,并分次免疫BALB/c小鼠,通过ELISPOT和颗粒酶释放法,检测该复合物诱导特异性CTL的能力。通过检测小鼠体内肿瘤的生长情况和肿瘤的组织切片,来观测该复合物对小鼠乳腺癌的免疫治疗作用。结果:rhHSP70-HER2/neu抗原肽复合物免疫小鼠后,可以增加T细胞分泌IFN-γ的能力,诱导出肿瘤特异性CTL,并对小鼠的乳腺癌有明显的治疗作用。结论:在毕赤酵母中重组表达的rhHSP70可以在体外与一定的抗原肽非共价结合形成复合物,该复合物具有较强的诱导特异性CTL的能力,可对实验鼠的乳腺癌起到明显的治疗作用。 展开更多

关键词 重组人热休克蛋白70 细胞毒性T细胞 肿瘤 免疫治疗

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热休克蛋白10和热休克蛋白的60表达、纯化及与线粒体DNA转录因子A相互结合 被引量：5

11

作者 程晓丽 神吉智丈 +2 位作者 李春燕 金秀日 康東天 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2007年第1期50-52,共3页

目的:表达、纯化热休克蛋白10(Hsp10)和热休克蛋白60(Hsp60),研究人类线粒体DNA转录因子A(TFAM)在体外与Hsp10,Hsp60间的相互交联作用。方法:使用Escherichia.Coli(E.coli)诱导表达含有6个组氨酸标记的Hsp10和Hsp60,镍离子鳌合树脂分离... 目的:表达、纯化热休克蛋白10(Hsp10)和热休克蛋白60(Hsp60),研究人类线粒体DNA转录因子A(TFAM)在体外与Hsp10,Hsp60间的相互交联作用。方法:使用Escherichia.Coli(E.coli)诱导表达含有6个组氨酸标记的Hsp10和Hsp60,镍离子鳌合树脂分离纯化后,体外分别与纯化TFAM共育,抗-TFAM抗体免疫沉淀,SDS-PAGE分离蛋白,CBB探测分析。结果:Hsp10可在体外与TFAM发生免疫共沉淀,Hsp60不能。结论:Hsp10可能为TFAM-复合体组分。 展开更多

关键词 热休克蛋白10 热休克蛋白60 分离与提纯 线粒体DNA转录因子A

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乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达 被引量：1

12

作者 葛菲菲 邱亚峰 +2 位作者 杨耀武 高小飞 陈溥言 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第12期1081-1085,共5页

目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosisheat shock protein70,Mt.hsp70)基因融合表达载体,并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况,为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZ... 目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosisheat shock protein70,Mt.hsp70)基因融合表达载体,并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况,为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZα-A为基本单位构建E蛋白基因主要抗原片段与hsp70的融合表达载体,融合基因以酶切位点BamHⅠ连接,用电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果E蛋白基因与hsp70的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为114kD,与实际大小相符,经凝胶薄层扫描分析,表达量为33mg/L,经Western印迹验证,有良好的抗原性。结论E-hsp70融合蛋白在酵母中的表达为下一步研究hsp70是否能作为E蛋白免疫时的理想佐剂作准备。 展开更多

关键词 乙型脑炎E蛋白主要抗原片段 结核杆菌热休克蛋白70 融合 巴斯德毕赤酵母 抗原性

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牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70的克隆与原核表达重组质粒的构建 被引量：1

13

作者 王轶男 贾立军 +3 位作者 薛书江 胡诗悦 钱年超 张守发 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第2期60-63,共4页

为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70(HSP70)基因片段原核重组表达质粒,本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70基因序列(D12692.1),应用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,扩增片段大... 为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70(HSP70)基因片段原核重组表达质粒,本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70基因序列(D12692.1),应用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,扩增片段大小为1 692bp,与参考序列的同源性为99%。将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSP70,本试验为进一步研究牛瑟氏泰勒虫HSP70基因佐剂作用、研制基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 牛瑟氏泰勒虫 热休克蛋白70 重组质粒

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重组人热休克蛋白70D的免疫佐剂样效应研究 被引量：3

14

作者 常卫红 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第10期1118-1122,共5页

目的 :研究重组人热休克蛋白 70 D(rh HSP70 D)蛋白的免疫佐剂样效应。 方法 :用 rh HSP70 D诱导体外培养的树突状细胞 (DC) ,观察 DC分泌前炎性细胞因子的水平、DC成熟及刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力 ;用 rh HSP70 D与OVA2 57- 2 6 ... 目的 :研究重组人热休克蛋白 70 D(rh HSP70 D)蛋白的免疫佐剂样效应。 方法 :用 rh HSP70 D诱导体外培养的树突状细胞 (DC) ,观察 DC分泌前炎性细胞因子的水平、DC成熟及刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力 ;用 rh HSP70 D与OVA2 57- 2 6 4体外交联的蛋白免疫 C5 7BL / 6小鼠 ,观察能否诱导产生抗原特异性免疫保护作用。结果 :rh HSP70 D可以明显刺激DC分泌 IL- 1β、IL- 12 p70、TNF- α等细胞因子 ,可以促进 DC表达 HL A- DR、CD86、CD4 0等膜分子 ,增强 DC诱导同种异体 T淋巴细胞增殖的能力 ;rh HSP70 D- OVA2 57- 2 6 4交联蛋白可诱导小鼠产生具有明显抗原特异性的免疫保护作用 ,而 rh HSP70 D或OVA2 57- 2 6 4单独免疫小鼠均不能产生这种保护作用。 结论 :rh HSP70 D能通过促进 DC成熟、刺激前炎性细胞因子的分泌增强DC的免疫激发功能 ,rh HSP70 D-抗原肽复合物免疫能够诱导产生抗原特异性的免疫保护作用 ,提示 rh HSP70 D有望作为一种新的佐剂应用于抗肿瘤及抗感染免疫治疗。 展开更多

关键词 重组人热休克蛋白70D 免疫佐剂样效应 研究 树突状细胞 细胞因子 抗原呈递 肿瘤 免疫疗法

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人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及序列分析

15

作者 姜政 黄爱龙 +2 位作者 蒲丹 陶小红 王丕龙 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2003年第4期414-416,420,共4页

目的 :获取含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A编码基因并构建其重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,为在E .coliBL2 1中表达 ,疫苗的开发奠定基础。方法 :利用分子克隆技术从HpDNA染色体中 ,扩增热休克蛋白A编码基因片段。将目的基因与pET32a... 目的 :获取含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A编码基因并构建其重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,为在E .coliBL2 1中表达 ,疫苗的开发奠定基础。方法 :利用分子克隆技术从HpDNA染色体中 ,扩增热休克蛋白A编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经kpnⅠ、BamHⅠ双酶切、纯化、连接后。转化含有目的基因的重组载体 ,进行序列分析。 结果 :经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为Hp热休克蛋白A编码基因 ,与GenBank的报道相比较 ,有 1.4 %的bp发生变异 ,1.6 %的氨基酸残基改变。其同源性高达 98%。结论 :成功地克隆了Hp热休克蛋白A编码基因 ,为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。 展开更多

关键词 幽门螺杆菌 热休克蛋白A 编码基因 重组载体 疫苗

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罗非鱼热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达与纯化 被引量：3

16

作者 陈明 王秋华 +7 位作者 王瑞 黄婷 梁万文 李超 雷爱莹 陈福艳 余晓丽 甘西 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期58-62,共5页

以尼罗罗非鱼血液mRNA反转录获得编码罗非鱼Hsp70完整cDNA,重组构建罗非鱼真核表达载体pPIC9K/rtHsp70;在毕赤酵母Pichia pastoris KM71中表达重组罗非鱼的热休克蛋白70(rtHsp70),对表达上清液进行SDS-PAGE及Western blot分析;采用亲和... 以尼罗罗非鱼血液mRNA反转录获得编码罗非鱼Hsp70完整cDNA,重组构建罗非鱼真核表达载体pPIC9K/rtHsp70;在毕赤酵母Pichia pastoris KM71中表达重组罗非鱼的热休克蛋白70(rtHsp70),对表达上清液进行SDS-PAGE及Western blot分析;采用亲和层析、HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化目的蛋白。结果表明:克隆至pMD载体上的基因与目的基因完整编码区序列完全一致;诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western blot分析,上清液中蛋白条带大小与目的蛋白相对分子质量大小一致;每升诱导上清液可以获得约2 mg纯化蛋白。本研究中获得的rtHsp70毕赤酵母工程菌及纯化的rtHsp70为后期rtHsp70-肽疫苗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 重组罗非鱼热休克蛋白70(rtHsp70) 基因表达 毕赤酵母

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携带反义热休克蛋白70抑制人喉癌细胞的生长 被引量：1

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作者 王晓侠 姚小宝 +3 位作者 嵇宪生 李胜利 朱宏亮 樊代明 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1888-1891,共4页

目的构建携带反义热休克蛋白70(HSP70)的重组腺病毒载体以用于喉癌的基因治疗研究。方法将HSP70基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒PAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌Bj5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义HSP70... 目的构建携带反义热休克蛋白70(HSP70)的重组腺病毒载体以用于喉癌的基因治疗研究。方法将HSP70基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒PAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌Bj5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义HSP70的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70。结果成功的构建携带反义HSP70的重组腺病毒载体系统,经测病毒滴度可达8×109。HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经Western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70。转染反义HSP70的腺病毒载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有。结论构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70可望有效地将反义HSP70导入人喉癌细胞株,为进一步研究喉癌基因治疗提供实验基础。 展开更多

关键词 反义热休克蛋白70 重组腺病毒 喉癌

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热休克蛋白融合蛋白对人树突状细胞分化成熟的刺激作用 被引量：1

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作者 万敏 张培因 +7 位作者 王宣军 吴秀丽 卫红飞 王燕媚 于永利 王丽颖 邓平 张慧杰 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期835-838,874,共5页

目的 :研究热休克蛋白融合蛋白对人树突状细胞分化成熟的刺激作用。方法 :采用 GM- CSF和 IL- 4将人外周血单核细胞诱导成未成熟树突状细胞 ,然后用热休克蛋白融合蛋白刺激其分化成熟 ,以单核细胞条件培养液 (MCM)和模拟的单核细胞条件... 目的 :研究热休克蛋白融合蛋白对人树突状细胞分化成熟的刺激作用。方法 :采用 GM- CSF和 IL- 4将人外周血单核细胞诱导成未成熟树突状细胞 ,然后用热休克蛋白融合蛋白刺激其分化成熟 ,以单核细胞条件培养液 (MCM)和模拟的单核细胞条件培养液 (MCM m imic)为对照。以流式细胞仪检测树突状细胞表面分子的表达情况。结果 :热休克蛋白融合蛋白可以刺激树突状细胞表面表达 CD4 0、CD80、CD86和 HL A- A2分子。结论 :热休克蛋白融合蛋白可诱导人树突状细胞分化成熟。 展开更多

关键词 树突细胞 热休克蛋白质类 重组融合蛋白质类/生物合成

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乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体的构建

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作者 梁增伟 李用国 任红 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2001年第2期122-125,共4页

目的：构建乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达质粒。方法：用 PCR方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌HSP70 基因序列，应用T-A克隆技术，克隆到质粒 pGEM-T vector，经 DNA测序证实基因碱基无误后，亚克隆到真核表达质粒 pcDNA... 目的：构建乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达质粒。方法：用 PCR方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌HSP70 基因序列，应用T-A克隆技术，克隆到质粒 pGEM-T vector，经 DNA测序证实基因碱基无误后，亚克隆到真核表达质粒 pcDNA3.1（+），构建成pcDNA3.1-HSP70重组质粒。然后，再用PCR方法，从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因，并克隆到质粒pcDNA3.1-HSP70，将HBsAg基因的C端与HSP70基因N端连接，构建 HBsAg和 HSP70融合表达质粒 pcDNA3.1-S-HSP70。结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。结论：乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体构建成功。 展开更多

关键词 乙型肝炎表面抗原 结核杆菌 热休克蛋白70 克隆 PCDNA3.1

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皮下免疫热休克蛋白65对小鼠巨噬细胞胆固醇流出率的影响及机制

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作者 孙海阁 沈剑刚 +5 位作者 谭迎 田迪 刘挺榕 罗甜甜 赖文岩 郭志刚 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2014年第4期416-420,共5页

目的观察皮下免疫不同剂量热休克蛋白65(HSP65)对载脂蛋白E缺失小鼠动脉粥样硬化及巨噬细胞TC流出率的影响。方法选择apoE-/-小鼠24只,随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、5μg HSP65组及25μg HSP65组,每组8只,第3、6周进行皮下免疫。... 目的观察皮下免疫不同剂量热休克蛋白65(HSP65)对载脂蛋白E缺失小鼠动脉粥样硬化及巨噬细胞TC流出率的影响。方法选择apoE-/-小鼠24只,随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、5μg HSP65组及25μg HSP65组,每组8只,第3、6周进行皮下免疫。实验第16周末取标本,分离小鼠主动脉测定血管斑块面积;用自动生化仪测定小鼠血脂水平,酶联免疫吸附法分别检测血清HSP65抗体滴度及炎性因子白细胞介素10(IL-10)和干扰素γ水平,液闪计数仪检测巨噬细胞TC流出率;提取肝脏mRNA及膜蛋白,分别检测ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)和G1(ABCG1)、B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BⅠ)的表达。结果与PBS对照组比较,5μg HSP65组和25μg HSP65组TC流出率明显降低,HSP65抗体滴度和干扰素γ水平明显升高,主动脉粥样硬化斑块面积明显增加(P<0.05,P<0.01);其中25μg HSP65组血清HDL-C和IL-10表达较PBS对照组明显降低(P<0.01);5μg HSP65组和25μg HSP65组ABCA1、ABCG1及SR-BⅠmRNA表达明显低于PBS对照组(P<0.05)。结论皮下免疫HSP65可抑制小鼠巨噬细胞TC流出,可能是通过下调ABCA1、ABCG1和SR-BⅠ的表达。 展开更多

关键词 热休克蛋白质类 载脂蛋白E类 巨噬细胞 动脉粥样硬化 白细胞介素10 干扰素Ⅱ型

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