重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a在大肠杆菌中的表达和纯化 被引量：4

1

作者 王新 陈海旭 +3 位作者 陆坚峰 张毅 屈贤铭 杨胜利 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期337-341,共5页

为了大量制备重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa) ,对构建的基因工程菌株E .coliBL2 1(DE3)pET2 2b mETIa进行了表达条件的优化 .用摇瓶培养 ,rETIa蛋白占菌体总蛋白 4 0 %以上 .经破碎菌体 洗涤包涵体 溶解包涵体 复性初步纯化后 ,再... 为了大量制备重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa) ,对构建的基因工程菌株E .coliBL2 1(DE3)pET2 2b mETIa进行了表达条件的优化 .用摇瓶培养 ,rETIa蛋白占菌体总蛋白 4 0 %以上 .经破碎菌体 洗涤包涵体 溶解包涵体 复性初步纯化后 ,再经二步柱层析纯化获得电泳纯的rETIa蛋白 .测定了rETIa对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织型纤溶酶原激活因子缺失突变体 (NTA)的抑制活性 . 展开更多

关键词 重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a 大肠杆菌 表达 纯化

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重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a的制备及其在tPA突变体纯化中的应用 被引量：4

2

作者 王新 屈贤铭 杨胜利 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第3期420-423,共4页

将基因工程菌株E .coliBL2 1(DE3)pET2 2b mETIa高密度发酵 ,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a (rETIa)蛋白在E .coli中得到较高水平表达 ,表达量占菌体总蛋白的 4 0 %以上 .经菌体破碎、包涵体变性、复... 将基因工程菌株E .coliBL2 1(DE3)pET2 2b mETIa高密度发酵 ,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a (rETIa)蛋白在E .coli中得到较高水平表达 ,表达量占菌体总蛋白的 4 0 %以上 .经菌体破碎、包涵体变性、复性 ,二步柱层析纯化得到电泳纯的rETIa蛋白 .测得rETIa对t PA突变体(NTA)的抑制平衡常数Ki 为 8 72× 10 -8mol/L .据此利用纯化的rETIa蛋白制备rETIa Sepharose 4B亲和层析柱 .直接一步纯化NTA复性液 ,纯化的NTA纯度达 90 %以上 ,收率为 96 2 % ,纯化倍数为 13 2 ,比活为(5 6 5 7± 71 3)U/μg . 展开更多

关键词 重组刺桐胰蛋白酶 抑制剂a 制备 tPA突变体 纯化 应用 高效表达 亲和层析

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重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定(英文)

3

作者 马志峰 孙自勇 +1 位作者 陈均勇 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期462-469,共8页

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶... 刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( +)中构建重组表达质粒pET25b ( +)/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L. 展开更多

关键词 刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI) 胰蛋白酶 瑞替普酶 纤溶酶 抑制

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重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的促凋亡作用 被引量：15

4

作者 高丽 李玉英 +4 位作者 张政 王转花 王宏伟 张丽 朱镭 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2007年第1期59-62,共4页

为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理,用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL-60细胞,采用MTT比色法检测其对HL-60细胞的抑制率,应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化,用DNA凝... 为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理,用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL-60细胞,采用MTT比色法检测其对HL-60细胞的抑制率,应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化,用DNA凝胶电泳法检测HL-60细胞的凋亡,用流式细胞术检测该抑制剂作用于HL-60细胞后引起的凋亡现象。结果表明:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞(PBMNC)无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100μg/ml重组荞麦胰蛋白酶抑制剂作用后,凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。结论:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导细胞凋亡,这为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据,也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路。 展开更多

关键词 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 HL-60细胞 细胞凋亡

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重组荞麦胰蛋白酶抑制剂理化性质的研究 被引量：5

5

作者 李晨 张政 +1 位作者 李玉英 王转花 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第8期52-56,共5页

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是存在于荞麦种子中的一种抗营养因子。本文经过原核表达及两步层析纯化得到高纯度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI。通过分析表明,重组荞麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的... 荞麦胰蛋白酶抑制剂(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是存在于荞麦种子中的一种抗营养因子。本文经过原核表达及两步层析纯化得到高纯度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI。通过分析表明,重组荞麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的性质类似。rBTI的相对分子质量约为11kDa,等电点约为6.2。rBTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制摩尔比(以BApNA为底物)为1:1.5。rBTI的最适pH值为8.0,在pH3.0～8.0之间有较好的热稳定性,100℃加热120min仍保持70%的胰蛋白酶抑制活性。 展开更多

关键词 荞麦胰蛋白酶抑制剂 重组 性质

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重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对人肝癌细胞的凋亡及半胱氨酸天冬酶活性的影响 被引量：8

6

作者 李芳 李玉英 +3 位作者 白崇智 田欣 张政 王转花 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期182-187,共6页

先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的rBTI体外作用于人肝癌细胞HepG2后,采用MTT比色法... 先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的rBTI体外作用于人肝癌细胞HepG2后,采用MTT比色法检测抑制剂对HepG2细胞的抑制率,用DNA凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测HepG2细胞的凋亡.结果表明,rBTI在体外能够明显抑制HepG2细胞的增长,并诱导细胞凋亡.另外,细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA水平有关.通过RT-PCR检测发现,细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平下调,促凋亡基因Bax mRNA有所上调,而对照GAPDH无变化.对HepG2细胞中Fas/Fas配体及半胱氨酸天冬酶(caspase)的研究证明,细胞经过rBTI处理后,对死亡受体Fas mRNA没有影响;rBTI可明显激活caspase-3和caspase-9酶活性,对caspase-8活性几乎无影响.上述结果表明,rBTI对HepG2细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及Fas/Fas配体途径. 展开更多

关键词 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 细胞凋亡 人肝癌细胞 半胱氨酸天冬酶

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重组牛胰蛋白酶抑制剂对小鼠急性肝损伤的保护作用 被引量：5

7

作者 杨莉莉 董文 +2 位作者 贺巾超 任秀宝 颜炜群 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期448-451,共4页

目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对小鼠急性肝损伤的保护作用。方法小鼠60只随机分成6组:正常对照组、模型组、rBPTI的3个剂量组(分别为3、6、12×104kIU·kg-1)、抑肽酶组(6×104kIU·kg-1)。每天腹腔注射给药,7... 目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对小鼠急性肝损伤的保护作用。方法小鼠60只随机分成6组:正常对照组、模型组、rBPTI的3个剂量组(分别为3、6、12×104kIU·kg-1)、抑肽酶组(6×104kIU·kg-1)。每天腹腔注射给药,7d后体外注射CCl4建立小鼠急性肝损伤模型。末次给药后眼眶取血测定小鼠血清ALT、AST活性,观察肝脏组织病理改变。结果各剂量rBPTI可不同程度降低小鼠血清ALT、AST活性,降低肝组织MDA含量,与模型组比较差异有统计学意义(P<0·05、P<0·01),同时不同程度减轻肝组织病理损伤。结论rBPTI对体外CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用,作用效果同天然BPTI相当。 展开更多

关键词 重组牛胰蛋白酶抑制剂 四氯化碳 急性肝损伤

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刺桐胰蛋白酶抑制剂亲和层析填料的制备及应用 被引量：4

8

作者 陈嫚 任启生 +1 位作者 宋新荣 冯长根 《北京理工大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第2期172-175,共4页

研究用交联琼脂糖为载体 ,三聚氯氰为活化剂 ,刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基 ,制备亲和填料的方法 .通过紫外和红外光谱分析 ,对制备的填料进行表征 .用制备的亲和填料吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体(reteplase,r- PA) ,研究吸附与... 研究用交联琼脂糖为载体 ,三聚氯氰为活化剂 ,刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基 ,制备亲和填料的方法 .通过紫外和红外光谱分析 ,对制备的填料进行表征 .用制备的亲和填料吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体(reteplase,r- PA) ,研究吸附与解吸附条件 .结果表明 ,用该方法制备的亲和填料 ,制备工艺简单 ,吸附性能良好 ,对r- PA的吸附量为 8.76 mg· g- 1 .解吸附完全 ,不影响活性 ,可以用来分离纯化 r- PA. 展开更多

关键词 三聚氯氰 刺桐胰蛋白酶抑制剂 重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体 亲和色谱

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重组牛胰蛋白酶抑制剂对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的保护作用 被引量：2

9

作者 杨莉莉 贺巾超 +4 位作者 董文 张馨木 周存志 任秀宝 颜炜群 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期193-198,共6页

目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对大鼠慢性肝损伤的保护作用。方法大鼠98只,随机分成7组,分别为正常对照组、模型组、rBPTI3个剂量组(20,40和80MU.kg-1)、抑肽酶组(80MU.kg-1)和促肝细胞生长素组(100mg.kg-1)。除正常对照组外,其... 目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对大鼠慢性肝损伤的保护作用。方法大鼠98只,随机分成7组,分别为正常对照组、模型组、rBPTI3个剂量组(20,40和80MU.kg-1)、抑肽酶组(80MU.kg-1)和促肝细胞生长素组(100mg.kg-1)。除正常对照组外,其余各组皮下注射四氯化碳制备慢性肝损伤模型。8周后每天ip给药,给药4周后测定血清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性、白蛋白(Alb)含量、白蛋白/球蛋白(A/G)比值、唾液酸(SA)含量及肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量,并进行组织病理学检测。结果与正常对照组比较,模型组大鼠血清GPT和GOT活性、SA含量及肝组织Hyp含量明显升高,血清Alb含量和A/G比值明显降低。与模型组比较,rBPTI各剂量组大鼠血清GPT和GOT活性、SA含量及肝组织Hyp含量降低,血清Alb含量和A/G比值明显增高。肝组织病理观察显示,rBPTI明显减轻由四氯化碳所致肝细胞脂肪变性及纤维组织增生等病理改变。结论rBPTI对四氯化碳诱导的大鼠慢性肝损伤具有保护作用和抗纤维化作用,在所观察的剂量范围内作用效果与抑肽酶相当。 展开更多

关键词 胰蛋白酶抑制剂 抑肽酶 重组蛋白质类 四氯化碳 慢性肝损伤

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重组荞麦胰蛋白酶抑制剂延长C.elegans寿命的作用机制 被引量：3

10

作者 李娇 崔晓东 +1 位作者 马晓丽 王转花 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1112-1120,共9页

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI）是一种来源于荞麦PotatoⅠ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,r BTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具... 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI）是一种来源于荞麦PotatoⅠ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,r BTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,r BTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对r BTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的r BTI突变体,分别命名为r BTI-R45A,r BTI-R45F,r BTI-W53R和r BTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型r BTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0-10μmol/L范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10μmol/L野生型r BTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体r BTI-R45 A,r BTI-R45 F和r BTI-W53 R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型r BTI可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种r BTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,r BTI可增强长寿因子DAF-16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发r BTI的功能提供了实验支持和理论基础。 展开更多

关键词 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 突变体 秀丽隐杆线虫 寿命 转录因子DAF-16

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重组Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂的性质及抑制机理 被引量：1

11

作者 刘利 杨帆 +3 位作者 李素霞 郭奥 刘晓 王之可 《华东理工大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期292-299,共8页

利用大肠杆菌表达系统,成功表达并纯化获得了重组Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂(rBBTI)。对比研究了天然Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂(BBTI)和rBBTI的酶学性质和稳定性,以及分别抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制动力学。结果表明:rBBTI... 利用大肠杆菌表达系统,成功表达并纯化获得了重组Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂(rBBTI)。对比研究了天然Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂(BBTI)和rBBTI的酶学性质和稳定性,以及分别抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制动力学。结果表明:rBBTI和BBTI都有较好的热稳定性,pH对rBBTI的活性影响较大;rBBTI和BBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适条件分别为pH 8、25℃和pH 9、16℃;二者的抑制机理相同,抑制胰蛋白酶时表现为典型的反竞争性抑制作用,而抑制糜蛋白酶时表现为典型的非竞争性抑制作用;rBBTI和BBTI对胰蛋白酶的抑制效率均高于对糜蛋白酶的抑制效率,但rBBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的效率略低于BBTI。 展开更多

关键词 Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂 重组表达 抑制动力学 酶学性质

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rhKD/APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化

12

作者 王心童 王虹蛟 +3 位作者 王强 孟威宏 颜炜群 任立群 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期529-533,共5页

目的:构建高效分泌表达重组人淀粉样蛋白前体Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体(rhKD/APPvar)的毕氏酵母工程菌,建立适合大规模发酵、纯化rhKD/APPvar的工艺。方法:利用已构建的rhKD/APP表达质粒,在其活性中心两侧设计2个酶切位点(ApaⅠ... 目的:构建高效分泌表达重组人淀粉样蛋白前体Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体(rhKD/APPvar)的毕氏酵母工程菌,建立适合大规模发酵、纯化rhKD/APPvar的工艺。方法:利用已构建的rhKD/APP表达质粒,在其活性中心两侧设计2个酶切位点(ApaⅠ和SacⅡ),实现人KD/APP活性中心RAM与BPTI活性中心KAR的替换,构建rhKD/APPvar表达质粒。将重组质粒转化到酵母菌X-33中,优化rhKD/APPvar表达最佳pH值,使rhKD/APPvar获得高效表达。利用阳离子交换树脂和超滤除盐对重组蛋白进行纯化。结果:酶切鉴定和测序分析显示成功构建了KD/APPvar-pPICZαC重组质粒。经电转化成功地将重组质粒转化至酵母菌X-33中。SDS-PAGE分析,甲醇诱导表达后在相对分子质量约6 700处出现蛋白条带,pH 6.0、甲醇诱导120h蛋白表达水平最高,经纯化获得纯度达95%的重组蛋白。结论:成功构建KD/APPvar-pPICZαC重组质粒,经毕赤酵母表达和纯化获得了rhKD/APPvar蛋白。 展开更多

关键词 毕赤酵母菌 重组KD APP变异体 牛胰蛋白酶抑制剂 淀粉样蛋白前体

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rBTI通过上调PTEN的表达抑制Hep G2细胞增殖 被引量：4

13

作者 任荣 崔晓东 王转花 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期170-177,共8页

磷酸酶及张力蛋白的同源基因(PTEN)是一种抑癌基因,可以调控细胞的增殖,与癌症的发生和发展息息相关。本研究采用MTT法和流式细胞术分别检测了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(r BTI)对人肝癌细胞株Hep G2细胞的增殖以及周期的影响。免疫荧光及W... 磷酸酶及张力蛋白的同源基因(PTEN)是一种抑癌基因,可以调控细胞的增殖,与癌症的发生和发展息息相关。本研究采用MTT法和流式细胞术分别检测了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(r BTI)对人肝癌细胞株Hep G2细胞的增殖以及周期的影响。免疫荧光及Western印迹法检测了PTEN和p-PTEN的亚细胞定位及蛋白表达的变化。采用q RT-PCR及Western印迹法检测了周期相关蛋白的表达。旨在探究PTEN和p-PTEN在r BTI抑制Hep G2细胞增殖和周期阻滞中的作用。结果表明,r BTI能显著抑制Hep G2细胞增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期,并呈时间和剂量依赖性;r BTI作用于Hep G2后,可显著上调PTEN和p-PTEN的表达。同时发现,p-PTEN主要分布于细胞核中,能与核仁发生共定位;周期相关蛋白检测表明,细胞内p53、p21转录水平和蛋白水平均增加。综上所述,r BTI通过上调PTEN的表达,使得细胞周期阻滞于G0/G1期,进而抑制Hep G2细胞的增殖。 展开更多

关键词 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 增殖抑制 周期阻滞 磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)

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截短型rBTI的表达、纯化及其对EC9706细胞生长的抑制作用 被引量：1

14

作者 李静舒 李玉英 +1 位作者 崔晓东 王转花 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期467-472,共6页

依据先前获得的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)氨基酸序列及三维分子构像,分别构建了rBTI C末端缺失VVM、TPVVM或VDTPVVM的截短型pExsecI-BTI-t1,pExsecI-BTI-t2和pExsecI-BTI-t3重组质粒.转入大肠杆菌BL21中进行表达,并通过Resource Q... 依据先前获得的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)氨基酸序列及三维分子构像,分别构建了rBTI C末端缺失VVM、TPVVM或VDTPVVM的截短型pExsecI-BTI-t1,pExsecI-BTI-t2和pExsecI-BTI-t3重组质粒.转入大肠杆菌BL21中进行表达,并通过Resource Q阴离子交换层析分离.实验结果显示,3个工程菌均以可溶方式表达,目的蛋白在SDS-PAGE图谱中显示单一条带,其纯度达98%以上.理化性质分析表明,截短型rBTI与野生型rBTI具有相似的胰蛋白酶抑制活性,并具有很好的热稳定性及酸碱稳定性.将野生型和截短型rBTI分别作用于人食管癌EC9706细胞.MTT检测发现,C末端截短不同数目的氨基酸后,与野生型rBTI相比,在相同浓度下截短型rBTI仍具有一定的抑制肿瘤细胞生长作用,其抑制作用范围是截短前的50%左右.这些结果提示,rBTI的C末端氨基酸残基缺失未引起活性区域或功能部位的较大改变,从而保留了其对胰蛋白酶的抑制作用和部分生物学功能. 展开更多

关键词 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 截短型突变体 理化性质 细胞凋亡

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rBTI联合紫杉醇通过激活NFκB/p65促进MCF-7细胞凋亡

15

作者 李玉英 吴燕子 +2 位作者 白崇智 崔晓东 王转花 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期769-777,共9页

rBTI、紫杉醇均有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡等作用,但两者联合用药对肿瘤细胞的影响尚不明确.本文通过MTT比色法检测rBTI与紫杉醇联合作用对MCF-7细胞增殖的影响;采用流式细胞术分析,对MCF-7细胞凋亡以及ROS水平进行检测;利用... rBTI、紫杉醇均有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡等作用,但两者联合用药对肿瘤细胞的影响尚不明确.本文通过MTT比色法检测rBTI与紫杉醇联合作用对MCF-7细胞增殖的影响;采用流式细胞术分析,对MCF-7细胞凋亡以及ROS水平进行检测;利用qRT-PCR和Western印迹方法,检测rBTI与紫杉醇联合作用后凋亡因子表达情况.结果表明,rBTI（2.5μmol/L）与紫杉醇（0.05~0.5μmol/L）联合作用于MCF-7细胞后,能显著抑制其增殖.将rBTI与紫杉醇进行联合协同用药,诱导了MCF-7细胞凋亡及ROS的产生;同时与rBTI单独作用时相比,联合作用明显上调了p53、Bax的表达,促进了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/p65的核转位;与rBTI组和紫杉醇单独作用组相比,两者联合用药明显下调了Bcl-2和CyclinD1的表达.本研究证实,rBTI联合紫杉醇通过诱导ROS的产生,激活NFκB/p65信号转导途径,协同促进MCF-7细胞的凋亡. 展开更多

关键词 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 紫杉醇 核转录因子 MCF-7细胞 活性氧 凋亡

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