枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究 被引量：43

1

作者 李瑞芳 薛雯雯 +2 位作者 黄亮 熊前程 王彬 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期227-230,共4页

为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进。用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DB1342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5 kb质... 为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进。用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DB1342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5 kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响。结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DB1342的转化率为750 CFU/μgDNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/μg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg DNA。根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内。 展开更多

关键词 枯草芽孢杆菌 感受态细胞 质粒转化方法

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一种快速简便的CaCl_2质粒转化方法 被引量：9

2

作者 肖庚富 齐义鹏 +1 位作者 李莉 易巍 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2000年第1期96-98,共3页

介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴3～10min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2h减至3～10min.同时探讨了Ca2+浓度。

关键词 质粒转化 感受态细胞 CaCl2法 转化效率 DNA

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简单高效的感受态细胞制备和质粒转化体系的建立 被引量：6

3

作者 刘卫今 蒋勇 完迪迪 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第7期2745-2746,共2页

[目的]建立重复性好的感受态细胞的快速制备方法和质粒转化方法。[方法]采用改进的氯化钙法制备感受态细胞后,将带有目标片段的质粒转入感受态细胞,使工程菌DH5α转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,接种于添加氨苄青霉素的LB培养基上,... [目的]建立重复性好的感受态细胞的快速制备方法和质粒转化方法。[方法]采用改进的氯化钙法制备感受态细胞后,将带有目标片段的质粒转入感受态细胞,使工程菌DH5α转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,接种于添加氨苄青霉素的LB培养基上,并通过蓝白斑筛选和菌落PCR进行检测。[结果]制备的感受态细菌在不加Amp的LB平板上能较好生长,表明感受态细菌具有较强活性。感受态细菌在添加Amp的平板上不能生长,表明感受态细菌未被杂菌污染。转化后获得白色菌落1 410个,转化率为1.41×105cfu/μg。菌落PCR表明获得的白色菌斑为带有目标片段的阳性菌斑。[结论]该方法十分简便,是一种适于实验室操作的高效感受态细胞的制备方法。 展开更多

关键词 高效 感受态细胞制备 质粒转化 体系

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猪融合抗菌肽基因双质粒共转化重组毕赤酵母菌的构建 被引量：3

4

作者 陈骞 万小平 +3 位作者 肖永乐 唐健雪 赵世纪 高荣 《四川畜牧兽医》 2016年第12期28-31,共4页

为构建高效表达的猪融合抗菌肽蛋白的重组酵母菌发酵表达体系,规模化生产制备新型免疫分子防控动物传染病,本试验从实验室先前构建的p GAPZαA-P质粒中克隆出已构建好的猪融合抗菌肽CAMPs基因片段。通过I nfusion技术,将C AMPs片段分别... 为构建高效表达的猪融合抗菌肽蛋白的重组酵母菌发酵表达体系,规模化生产制备新型免疫分子防控动物传染病,本试验从实验室先前构建的p GAPZαA-P质粒中克隆出已构建好的猪融合抗菌肽CAMPs基因片段。通过I nfusion技术,将C AMPs片段分别克隆入p PIC9K和p PICZαA真核表达质粒中,并通过P CR以及测序验证,成功构建了p PIC9K-CAMPs和p PICZαA-CAMPs重组质粒。通过电转化将线性化p PIC9K-CAMPs转入毕赤酵母G S115基因组中,并筛选高拷贝菌株G S-PK-CAMPs。再将线性化p PICZαA-CAMPs转入重组酵母G S-PK-CAMPs中,筛选出高拷贝菌株G S-PKZ-CAMPs。对重组酵母GS-PKZ-CAMPs进行诱导表达后作转录表达研究,检测抗菌肽是否表达。最终结果显示,成功获得了G S-PKZ-CAMPs可诱导表达菌株,这给猪融合抗菌肽蛋白的大规模发酵制备和应用于动物传染病的防治奠定了可靠的初步基础。 展开更多

关键词 猪抗菌肽 融合基因 共表达 双质粒转化 毕赤酵母

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鸡志贺氏菌β-内酰胺酶的测定及其与耐药质粒的关系 被引量：2

5

作者 梁军 匡秀华 +3 位作者 苑丽 胡功政 杨玉荣 司红彬 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期510-515,共6页

通过对鸡志贺氏菌β-内酰胺酶及ESBLs的测定、质粒提取、细菌转化及质粒结合转移等试验,分析其耐药性与其质粒之间的关系,探讨耐药质粒在细菌间的传递方式.结果表明,质粒转化后的转化子对β-内酰胺类抗生素全部耐药,对氨基糖苷类、氟诺... 通过对鸡志贺氏菌β-内酰胺酶及ESBLs的测定、质粒提取、细菌转化及质粒结合转移等试验,分析其耐药性与其质粒之间的关系,探讨耐药质粒在细菌间的传递方式.结果表明,质粒转化后的转化子对β-内酰胺类抗生素全部耐药,对氨基糖苷类、氟诺酮类有一定程度的敏感;而质粒接合传递体的耐药谱与质粒转化子一致.耐药菌株的质粒可编码β-内酰胺酶,且耐药质粒可通过结合转移方式传递至感受态大肠杆菌. 展开更多

关键词 志贺氏菌 超广谱Β-内酰胺酶 耐药质粒 质粒转化 接合传递

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焦化废水中细菌质粒的研究

6

作者 王翠红 辛晓芸 《环境污染与防治》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期195-197,共3页

细菌质粒中常带有一些可编码降解特殊有毒物质酶的基因,为了研究质粒对有毒物质CN-的降解的意义,主要调查了焦化废水中好氧异养菌的质粒分布特点。从山西省焦化企业公司生化站、太原煤气公司焦化厂生化站中筛选出53株细菌,利用琼脂糖凝... 细菌质粒中常带有一些可编码降解特殊有毒物质酶的基因,为了研究质粒对有毒物质CN-的降解的意义,主要调查了焦化废水中好氧异养菌的质粒分布特点。从山西省焦化企业公司生化站、太原煤气公司焦化厂生化站中筛选出53株细菌,利用琼脂糖凝胶电泳法,采用GDS8000型凝胶电泳分析仪进行拍照,同时测定各菌株降氰、降酚能力,CN-采用异烟酸吡唑啉酮法,酚采用4氨基安替比林法测定。结果表明,质粒的存在与降氰力有一定的关系,但对降酚力的影响差异不显著。同时,通过对其中11#号菌株进行了质粒转化和消除实验,证明质粒稳定,不可用十二烷基磺酸钠(SDS)消除掉,用E.ColiDHI作受体菌,用11#菌株作供体菌,作转化实验,但由于种种原因,没有筛选到转化子。 展开更多

关键词 细菌质粒 焦化废水 琼脂糖凝胶电泳法 4-氨基安替比林 十二烷基磺酸钠 有毒物质 CN^- 分布特点 焦化企业 煤气公司 同时测定 质粒转化 异养菌 山西省 焦化厂 分析仪 菌株 异烟酸 受体菌 DHI 转化子 降解 生化 降酚 实验

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质粒研究与载体构建

7

《生物技术通报》 CAS CSCD 1993年第9期25-26,共2页

932879Lactococcus lactis subsp lactis 的 pCI301体内融合质粒的物理分析[英]/Hayes,F.…//FE-MS Microbiol.Lett.-1993,106(3).-295～300[译自 DBA,1993,12(6)。

关键词 载体构建 报道基因 SUBSP 物理分析 Hayes 穿梭载体 电激法 重组质粒转化 转座子 多克隆位点

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侧孢短芽孢杆菌S62-9抗菌肽基因的初步定位 被引量：3

8

作者 张楠 刘洋 +3 位作者 柯晓静 于宏伟 郭润芳 贾英民 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期82-86,共5页

侧孢短芽孢杆菌S62-9可以产生高效广谱抑菌活性的细菌肽,为了确定该抗菌肽基因的遗传定位,本研究采用质粒消除和质粒转化进行正反论证。结果发现,电击法消除S62-9菌株的野生质粒pBLS62后,其突变株抑菌活性消失,而且对S62-9细菌肽的敏感... 侧孢短芽孢杆菌S62-9可以产生高效广谱抑菌活性的细菌肽,为了确定该抗菌肽基因的遗传定位,本研究采用质粒消除和质粒转化进行正反论证。结果发现,电击法消除S62-9菌株的野生质粒pBLS62后,其突变株抑菌活性消失,而且对S62-9细菌肽的敏感性大大增强;而野生质粒pBLS62导入没有抑菌活性的枯草芽孢杆菌Wb800中,转化子Z4产生了抑菌活性,而且RP-HPLC结果表明Z4表达的抗菌物质与原始菌株S62-9抗菌肽为同一产物。从质粒消除和质粒转化与由此带来的表观性状的关系上,可以推断,侧孢短芽孢杆菌S62-9细菌肽及其免疫相关基因位于质粒而不是染色体上。 展开更多

关键词 侧孢短芽孢杆菌 细菌肽 质粒消除 质粒转化 遗传定位

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人肥胖基因在大肠杆菌中的表达 被引量：2

9

作者 昔奋攻 李宁 吴常信 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期63-66,共4页

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能.本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5'端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,... 肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能.本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5'端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45%以上.表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性. 展开更多

关键词 大肠杆菌 肥胖基因 SDS-PAGE电泳 CDNA序列 原核表达载体 重组蛋白 PCR方法 生物学活性 脂肪含量 基因编码 扩增片段 质粒转化 温度诱导 蛋白表达 菌体蛋白 小白鼠 瘦蛋白 信号肽 CCG 密码子 CCC 分子量 表达量 纯化 造血

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含色氨酸启动子载体pMM16的构建

10

作者 杜敏杰 马贤凯 《生物学杂志》 CAS 1987年第5期24-26,共3页

在基因工程中,一个好的表达载体(expression vector)必须具有强启动子和插入筛选标志。Edman等构建的ptrpL1载体(图1)虽然含有强启动子一色氨酸(trp)启动子,但没有插入筛选标记。因此,插入重组体的筛选非常困难。细菌必须同时具备半乳... 在基因工程中,一个好的表达载体(expression vector)必须具有强启动子和插入筛选标志。Edman等构建的ptrpL1载体(图1)虽然含有强启动子一色氨酸(trp)启动子,但没有插入筛选标记。因此,插入重组体的筛选非常困难。细菌必须同时具备半乳糖异构酶、半乳糖转移酶和半乳糖激酶才能发酵半乳糖,这三种酶分别由galE galK和galk基因控制。 展开更多

关键词 色氨酸启动子 DNA Mac 浅红色 质粒转化 pMM16 重组子 交换子 外源基因 菌落 转化子 双酶切 重组质粒

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CRISPR/Cas9的外膜囊泡转运与无乳链球菌清除 被引量：1

11

作者 侯国锋 曾家伟 +7 位作者 羊熙春 王爱媛 刘亚欣 曾纪锋 郭桂英 杨诺 李迁 郑继平 《热带生物学报》 2018年第3期295-301,共7页

人工核酸内切酶技术CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)/Cas9是当前最有效的基因编辑工具。外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)是细菌主动分泌和吸收的双层膜结构,具有运载DNA、蛋白等多种物质... 人工核酸内切酶技术CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)/Cas9是当前最有效的基因编辑工具。外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)是细菌主动分泌和吸收的双层膜结构,具有运载DNA、蛋白等多种物质的能力。为探究以OMVs为CRISPR编辑工具的转运载体、用于病原菌清除的可行性,本研究以高致病性无乳链球菌(Streptococcus agalactiae or Group B Streptococcus,GBS)为材料,在原有CRISRR质粒p Cas9的基础上,通过分子克隆,构建穿梭质粒p Cas9-2. 0和具有靶向剪切无乳链球菌cfb基因的毒性质粒p Cas9-cfb,将质粒p Cas9-cfb转入asd缺陷型大肠杆菌X6097后,一方面进行重组菌的OMVs制备、电镜观察和DNA分析,另一方面与GBS混合培养,最后在选择平板上对GBS菌落计数。结果显示,重组了质粒p Cas9-cfb的X6097能够分泌OMVs且内含质粒;实验组平板上没有GBS菌落产生;对照组平板上菌落经鉴定皆为含p Cas9-2. 0的GBS,且菌落数量随共培养时间的延长和卡那霉素(Kan)的浓度升高而增多。综上可见,OMVs可以运载CRISPR为染色体剪切工具、并实现对靶向病原菌的定向清除,但受OMVs分泌量的限制消除效率较低。同传统的预防性疫苗相比,本研究为病原菌清除提供了一个新的研究方向;同当前以噬菌体为载体的研究思路相比,本方法更简便、成本更低。另外,本研究也为难以进行电击转化的菌株提供了一个更简单的质粒转化方法。 展开更多

关键词 CRISPR OMVs 无乳链球菌 病原菌清除 质粒转化

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生物防治

12

《生物技术通报》 CAS CSCD 1991年第3期89-91,共3页

910914 用各种异源质粒转化真菌病原体Cryphonectria parpsitica[英]/Churchill,A.C.L.…// Curr.Genet,-1990,17(1).-25～ 31[译自DBA,1990,9(15),90-08816]描述了美洲栗(Castanea dentata)病原菌 Cryphonectria parpsitica的转化.

关键词 质粒转化 原体 CASTANEA dentata 真菌病 CHURCHILL 原生质球 转化体 木霉属 潮霉素

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基因工程

13

《生物技术通报》 CAS CSCD 1989年第4期26-33,共8页

关键词 启动子调控 编码人 嵌合基因 重组质粒转化 链霉菌 缺失突变株 野生型 转座子 转化株 转染

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疫苗

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《生物技术通报》 CAS CSCD 1990年第5期70-72,共3页

902712 普氏立克次氏体疫苗株 E 及其回复体 DNA 的限制性内切酶分析[英]/Balaeva,N.M.…//Acta Virol.-1989,33(5).-454～464[译自 DBA,1990,9(6)。

关键词 百日咳毒素 载体表达 牛乳头状瘤病毒 片段连接 蛋白分子量 POLYA 重组质粒转化 陈玉梅 中性蛋白酶 分子克隆

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农业其它

15

《生物技术通报》 CAS CSCD 1989年第11期86-89,共4页

893552 细菌载体质粒向完整玉米苗线粒体的易位[俄]/Konstantinov,Y.M.…//Biokhimiya.-1989,54(1).-154～157[译自 DBA,1989,8(7),89-03980]研究了细菌载体质粒 pBR322和

关键词 载体质粒 马铃薯卷叶病毒 玉米苗 核酮糖 甜菜黄化病毒 读框 重组质粒转化 顺反子 移码突变 外源蛋白

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