BVDV囊膜蛋白E2重组腺病毒的构建及免疫效果研究

1

作者 吕雯雯 塞力克·杰恩斯 +4 位作者 叶鸿艳 张亚平 刘芯怡 史慧君 付强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1065-1071,共7页

为构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)囊膜蛋白E2重组腺病毒并分析其免疫效果。本研究通过PCR扩增获得目的基因BVDV E2,将其与穿梭载体pDC316-CMV-EFla-copGFP连接得到重组腺病毒载体,抽提质粒后酶切鉴定。将目的质粒与腺病毒骨架质粒p BHGlox-... 为构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)囊膜蛋白E2重组腺病毒并分析其免疫效果。本研究通过PCR扩增获得目的基因BVDV E2,将其与穿梭载体pDC316-CMV-EFla-copGFP连接得到重组腺病毒载体,抽提质粒后酶切鉴定。将目的质粒与腺病毒骨架质粒p BHGlox-ΔE1,3cre采用AdMax系统共转染至Low Passage 293细胞中得到重组腺病毒rAdv-E2,同时包装重组腺病毒rAdv-EGFP用于阴性对照并均经PCR和测序鉴定;将重组腺病毒rAdv-E2和rAdv-EGFP分别感染Low Passage 293细胞后扩繁,并采用RT-PCR和TCID_(50)检测目的基因的表达及腺病毒滴度;将BVDV E2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,使用IPTG诱导表达后经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化获得重组E2蛋白(rE2),用于后续特异性抗体的检测;以1×10^(8)TCID_(50)/只分别将重组腺病毒r Adv-E2和r Adv-EGFP经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,分别于第0、14 d两次免疫,首免后分别于7 d、14 d、21 d、28 d断尾采血,通过间接ELISA方法检测各组小鼠血清抗体水平;于首免后21 d时分别以BVDV TC株攻毒,于攻毒后0、5 d、10 d及15 d从各组小鼠中随机剖杀3只,取肝脏、肺脏、肾脏组织,使用福尔马林溶液固定小鼠各组织后,经脱水浸蜡、包埋、切片、HE染色后观察攻毒后各组小鼠的组织病理变化情况。结果显示,RT-PCR鉴定结果表明重组腺病毒r Adv-E2表达E2基因;ELISA检测结果显示,rAdv-E2组小鼠在免疫后7 d、14 d、21 d时抗体水平升高,28 d时显著升高,rAdv-EGFP组小鼠抗体水平无明显变化,rAdv-E2组小鼠的抗体水平整体极显著高于rAdv-EGFP组(P<0.001、P<0.0001),表明rAdv-E2诱导小鼠产生了良好的体液免疫反应;组织病理切片观察结果显示,BVDV攻毒后,接种rAdv-EGFP的对照组小鼠肝脏组织出现肝细胞变性坏死、水肿、炎性细胞增多,中央静脉有淤血产生;肺脏组织病变特征主要为肺泡破裂融合,炎性细胞浸润、出血、充血,黏膜脱落;肾脏组织有炎症产生,出现淋巴细胞浸润等病变特征,rAdv-E2免疫组小鼠各组织仅出现较轻的细胞病变,表明重组腺病毒r Adv-E2可以保护BALB/c小鼠免受BVDV的感染而致病。综上结果表明,重组腺病毒r Adv-E2将有望成为防控BVDV感染的新型疫苗。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 囊膜蛋白e2 腺病毒载体 免疫效果 病理变化

在线阅读 下载PDF 职称材料

猪瘟病毒囊膜蛋白E2的锚定序列部分缺失对其在细胞内表达的影响 被引量：1

2

作者 贺番 王靖飞 +1 位作者 郝永清 仇华吉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期342-346,共5页

为了将猪瘟病毒(CFSV)的囊膜蛋白表达在细胞表面,本研究根据与CSFV同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的囊膜蛋白E2锚定序列,推测出CSFV的E2锚定序列。利用生物信息学软件对CSFV的E2锚定序列进行分析、建模与部分缺失,构建成4种不同的表达CSF... 为了将猪瘟病毒(CFSV)的囊膜蛋白表达在细胞表面,本研究根据与CSFV同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的囊膜蛋白E2锚定序列,推测出CSFV的E2锚定序列。利用生物信息学软件对CSFV的E2锚定序列进行分析、建模与部分缺失,构建成4种不同的表达CSFV囊膜蛋白EmsE1E2的片段。将以上4种片段分别连接到真核表达载体pCAGGS中,转染幼仓鼠肾(BHK21)细胞,利用抗E2蛋白的单克隆抗体对表达蛋白进行westernblot检测与间接免疫荧光(IFA)检测,研究结果表明:跨膜区中锚定序列的部分缺失会降低E2在细胞内的表达,为猪瘟伪型病毒的研制提供了实验依据。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 e2囊膜蛋白 锚定序列 分子模拟技术

在线阅读 下载PDF 职称材料

猪瘟病毒囊膜蛋白在杆状病毒表面的展示及展示蛋白的免疫原性试验 被引量：3

3

作者 许信刚 童德文 刘宏仁 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第12期73-79,共7页

【目的】研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪瘟基因工程亚单位疫苗。【方法】利用杆状病毒表面展示(Baculovirus display)技术,构建展示猪瘟病毒(CSFV)囊膜蛋白的重组杆状病毒BacSC-E0E1E2,该重组杆状病毒带有His6标签,且胞质区域(C... 【目的】研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪瘟基因工程亚单位疫苗。【方法】利用杆状病毒表面展示(Baculovirus display)技术,构建展示猪瘟病毒(CSFV)囊膜蛋白的重组杆状病毒BacSC-E0E1E2,该重组杆状病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组杆状病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验。【结果】Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组E0E1E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测结果表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后在昆虫细胞膜上表达了重组E0E1E2蛋白;免疫金电子显微镜观察表明,重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上;动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠血清OD450值达到1.82;血清中和试验表明,免疫小鼠的血清50%中和效价(PD50)达到512。【结论】成功构建了表面展示猪瘟囊膜蛋白的重组杆状病毒。 展开更多

关键词 杆状病毒表面展示系统 猪瘟病毒 囊膜蛋白 动物免疫试验

在线阅读 下载PDF 职称材料

蜱传脑炎病毒作模型、黄病毒囊膜蛋白E抗原的分子结构

4

作者 Mandl C.W. 丁天兵 《单克隆抗体通讯》 CSCD 1989年第4期65-67,共3页

蜱传脑炎(TBE)病毒是一种主要人类致病性黄病毒，在其结构蛋白中囊膜蛋白E具有重要的生物学活性，可诱导保护性免疫懂答，可使病毒结合到细胞受体上。因此，蛋白E的结构和功能就成了正确理解黄病毒生物学活性及病毒一细胞相互作用机制... 蜱传脑炎(TBE)病毒是一种主要人类致病性黄病毒，在其结构蛋白中囊膜蛋白E具有重要的生物学活性，可诱导保护性免疫懂答，可使病毒结合到细胞受体上。因此，蛋白E的结构和功能就成了正确理解黄病毒生物学活性及病毒一细胞相互作用机制的中心环节。 展开更多

关键词 囊膜蛋白 蜱传脑炎病毒 黄病毒 分子结构 e抗原 生物学活性 模型 保护性免疫 结构和功能 结构蛋白 细胞受体 作用机制 致病性

在线阅读 下载PDF 职称材料

流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究 被引量：8

5

作者 闫丽萍 华荣虹 +1 位作者 亓文宝 童光志 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第3期341-348,共8页

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附、融合,决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿... 流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附、融合,决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域Ⅲ(EⅢ)是诱导中和抗体的重要区域.为确定乙型脑炎EⅢ的抗原表位,实验首先克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的EⅢ区域,并用pGEX-6P-1载体进行融合表达,免疫印迹分析表明,该融合蛋白能被抗JEV血清识别.为了进一步对该结构域进行抗原表位作图,设计了14个覆盖该区域且部分重叠的短肽.将各短肽与GST进行融合表达与纯化.短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹和ELISA免疫反应性扫描分析,结果鉴定出,E39(305TEKFSFAKNPVDTGHG320)、E45-1(355VTVNPFVATSSA366)、E48-1(377PFGDSYIV384)和E49(385VGRGDKQINHHWHKAG400)4个线性抗原表位.分别将4个抗原表位融合蛋白免疫小鼠,制备各抗原表位单因子血清,结果经体外病毒中和试验表明,E39为具有病毒中和活性的抗原表位.试验结果为进一步分析JEVE蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究提供了重要工作基础. 展开更多

关键词 流行性乙型脑炎 表面囊膜蛋白(e蛋白) 抗原表位

在线阅读 下载PDF 职称材料

猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及抗E2蛋白单克隆抗体的制备 被引量：7

6

作者 许信刚 胡建和 +2 位作者 张彦明 张海棠 陈永耀 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1318-1322,共5页

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感... 利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆和筛选获得了4株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗可与CSFV产生特异性反应并具有中和活性。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 e2囊膜蛋白 逆转录病毒载体 假病毒 FACS 单克隆抗体

在线阅读 下载PDF 职称材料

前列腺素E_1干预大鼠血管球囊损伤后再狭窄的机制探讨 被引量：1

7

作者 冯国清 赵胜 +4 位作者 程红梅 付润芳 刘红 杨万雷 秦攀 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期876-880,共5页

目的观察前列腺素E1(PGE1)在大鼠血管球囊损伤术后对血小板颗粒膜蛋白(GMP140)、D二聚体(Ddimer)、血浆内皮素(ET)及炎性细胞因子白介素1β(IL1β)、白介素6(IL6)、肿瘤坏死因子(TNFα)水平的影响,探讨PGE1对血管球囊损伤术后再狭窄形... 目的观察前列腺素E1(PGE1)在大鼠血管球囊损伤术后对血小板颗粒膜蛋白(GMP140)、D二聚体(Ddimer)、血浆内皮素(ET)及炎性细胞因子白介素1β(IL1β)、白介素6(IL6)、肿瘤坏死因子(TNFα)水平的影响,探讨PGE1对血管球囊损伤术后再狭窄形成的防治机制。方法采用大鼠腹主动脉球囊损伤模型,用药组术前连续5d经尾静脉给予PGE1(8、24、72μg·kg-1),模型组及假手术组给予等容积NS。各组动物于术后6h、24h、10d、21d4个时间点取血,采用酶连免疫吸附试验双抗体夹心法测定血浆中GMP140、Ddimer的含量;采用平衡法测定血浆中内皮素及血清中IL1β、IL6、TNFα的含量。结果与假手术组比球囊损伤模型组术后6h血浆GMP140、Ddimer含量明显升高(P<0.01),PGE1(8、24、72μg·kg-1)各组血浆GMPI40和D二聚体的含量显著降低(P<0.01)。模型组血浆ET含量6h开始增加,24h达高峰,10d降至正常。PGE1(24、72μg·kg-1)两组能明显降低6、24h血浆ET含量(P<0.01)。血管球囊损伤术后6h,模型组TNFα含量达高峰,而IL1β、IL6则在术后24h达高峰,PGE1各组均可在高峰时显著降低IL1β、IL6、TNFα的含量,与模型组相比差异显著(P<0.01),并呈良好的剂量相关性(r=0.747,0.907,0.747)。结论PGE1在大鼠血管球囊损伤术后可降低GMP140、Ddimer及血浆中ET、血清中IL1β、IL6、TNF浕水平的作用,是其干预血管再狭窄形成的重要机制。 展开更多

关键词 前列腺素e1 球囊损伤 血小板颗粒膜蛋白 D-二聚体 内皮素 细胞炎性因子

在线阅读 下载PDF 职称材料

杆状病毒表面展示系统的发展及应用

8

作者 郑浩 徐亮亮 +1 位作者 韦磊 孙京臣 《广东蚕业》 2014年第2期29-33,共5页

杆状病毒表面展示系统(Baculovirus Surface Display,BSD)是近年来发展起来的一种崭新的膜展示技术。其主要原理是通过基因工程的方法,将杆状病毒表面囊膜蛋白基因与所要展示的目的蛋白基因进行融合,形成重组杆状病毒。重组杆状病毒的... 杆状病毒表面展示系统(Baculovirus Surface Display,BSD)是近年来发展起来的一种崭新的膜展示技术。其主要原理是通过基因工程的方法,将杆状病毒表面囊膜蛋白基因与所要展示的目的蛋白基因进行融合,形成重组杆状病毒。重组杆状病毒的囊膜蛋白在表达同时,目的蛋白也随即进行表达,并与囊膜蛋白共同运输至病毒囊膜处,特异的与锚定部位结合,展示在杆状病毒表面。该系统由于具有较强的可控性和较高的展示效率,目前已经被广泛应用于基因转导与基因治疗、较复杂的真核蛋白展示、新型疫苗研发以及单克隆抗体的制备等领域。本文对杆状病毒表面展示系统的研究现状进行了阐述和总结,并对其发展和应用前景做出了展望。 展开更多

关键词 杆状病毒 表面展示 囊膜蛋白 融合表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

SYNJ2BP通过线粒体相关内质网膜促进慢病毒Env生成的机制研究

9

作者 DUAN YING-YI WANG XIN-HUI SUN KE-HUI 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1134-1134,共1页

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)在马体内的主要靶细胞是免疫细胞,且可长期潜伏感染马,给养马业造成了巨大的经济损失。慢病毒囊膜蛋白(Envelope,Env)是病毒侵入宿主细胞必不可少的一种病毒蛋白。Env需要在内质... 马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)在马体内的主要靶细胞是免疫细胞,且可长期潜伏感染马,给养马业造成了巨大的经济损失。慢病毒囊膜蛋白(Envelope,Env)是病毒侵入宿主细胞必不可少的一种病毒蛋白。Env需要在内质网(Endoplasmic reticulum,ER)中折叠和修饰才能成熟,进而发挥生物学功能。蛋白质的折叠,需要在较高的氧化状态下进行,内质网具有催化氧化蛋白质通过交联二硫键折叠所必需的细胞内氧化微环境。有证据表明,线粒体活性氧能促进细胞表面蛋白质二硫键形成、折叠和转运。但是,关于慢病毒Env在内质网中的氧化折叠调控机制未知。此外,内质网氧化折叠过程容易出错,并产生大量错误折叠的有细胞毒性的蛋白质。 展开更多

关键词 马传染性贫血病毒 养马业 免疫细胞 病毒蛋白 囊膜蛋白 潜伏感染 表面蛋白质 氧化状态

在线阅读 下载PDF 职称材料

H5亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备 被引量：1

10

作者 崔淑娟 郭鑫 +2 位作者 杨汉春 盖新娜 陈艳红 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2006年第7期17-19,共3页

关键词 H5亚型禽流感病毒 单克隆抗体 高致病性禽流感 抗体检测 制备 表面抗原 病毒检测 神经氨酸酶 PCR方法 囊膜蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

猪PRRSV美国株的结构多肽

11

作者 邱昌庆 《畜牧兽医科技信息》 1997年第20期9-9,共1页

美国明尼苏达州大学兽医学院Autista博士对猪生殖和呼吸综合征(PRRS)美国霉株(VR-2332)的结构多肽进行研究。用蔗糖梯度离心法提纯的病毒子,平均密度为1.15g/cm^3。用该毒株做SDSPAGE试验,表明该病毒含有3个主多肽,其分子量为15、19和26... 美国明尼苏达州大学兽医学院Autista博士对猪生殖和呼吸综合征(PRRS)美国霉株(VR-2332)的结构多肽进行研究。用蔗糖梯度离心法提纯的病毒子,平均密度为1.15g/cm^3。用该毒株做SDSPAGE试验,表明该病毒含有3个主多肽,其分子量为15、19和26—30kDa,分别称之为核衣壳蛋白(N),膜蛋白(M)和囊膜蛋白(E)。用N,N—糖苷酶F消化优势蛋白,仅对E蛋白起作用; 展开更多

关键词 PRRSV 美国株 猪生殖和呼吸综合征 核衣壳蛋白 结构多肽 美国明尼苏达州 蔗糖梯度离心 囊膜蛋白 e蛋白 分子量

在线阅读 下载PDF 职称材料