悬浮驯化CHO细胞并用于抗前列腺特异性膜抗原的抗体表达 被引量：3

1

作者 吴介恒 韩东晖 +6 位作者 魏铭 郑国旭 焦点 席文锦 杨安钢 秦卫军 温伟红 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期1-4,9,共5页

目的将贴壁状态的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞驯化成用无血清培养基培养的悬浮CHO细胞(CHO-S),并验证用该悬浮细胞进行抗体表达的可行性。方法将贴壁状态的CHO-S细胞调整为悬浮培养后,再用逐步降低血清含量的方法将其驯化成用无血清培养基悬... 目的将贴壁状态的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞驯化成用无血清培养基培养的悬浮CHO细胞(CHO-S),并验证用该悬浮细胞进行抗体表达的可行性。方法将贴壁状态的CHO-S细胞调整为悬浮培养后,再用逐步降低血清含量的方法将其驯化成用无血清培养基悬浮培养的CHO-S细胞。根据从噬菌体抗体库筛选获得的抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单链抗体的基因序列,人工设计并合成其重链和轻链基因,分别克隆入真核表达载体pc DNA3.1中,所得载体命名为pc DNA3.1-HC和pc DNA3.1-LC。将构建好的2个载体按照轻、重链比例为3∶1的量用Free Style MAX转染试剂瞬时转染CHO-S细胞,转染7 d后收集培养上清,用SDS-PAGE和Western blot法检测抗体表达情况,用流式细胞术检测其与PSMA阳性细胞的结合活性。结果成功将贴壁CHO细胞驯化成悬浮CHO-S细胞,成功构建了表达抗PSMA人源性抗体重链和轻链基因的真核表达载体,并在CHO-S细胞中实现了抗体的分泌表达,流式细胞术检测证实其可特异性结合PSMA阳性前列腺癌细胞。结论成功驯化获得悬浮CHO-S细胞,驯化后的CHO-S细胞可用于抗体的真核表达,为后续抗体的大量表达纯化及功能研究提供了工具。 展开更多

关键词 细胞驯化 CHO细胞 抗体表达 真核表达 转染

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抗人红细胞血型A抗原单链抗体原核表达及活性测定 被引量：3

2

作者 王长军 唐家琪 +2 位作者 李先富 潘秀珍 操敏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期271-273,共3页

目的构建并表达抗人红细胞血型A抗原单链小分子抗体(single-chainFv)蛋白。方法设计合成抗重、轻链可变区引物,通过重叠延伸拼接PCR技术,在50AmAbV和VL基因间引入连结短肽,体外构建50AScFv基因并进行序列分析;将其克隆入表达载体pET-28a... 目的构建并表达抗人红细胞血型A抗原单链小分子抗体(single-chainFv)蛋白。方法设计合成抗重、轻链可变区引物,通过重叠延伸拼接PCR技术,在50AmAbV和VL基因间引入连结短肽,体外构建50AScFv基因并进行序列分析;将其克隆入表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达;并以免疫印迹测定重组蛋白的生物学活性。结果序列分析表明,50AScFv基因全长747bp,编码249个氨基酸;重组体表达产物聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,融合蛋白的相对分子质量(Mr)为29000左右,与预期的结果一致,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在;光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体总蛋白的16.2%,免疫印迹试验显示,重组小分子抗体保留了亲本mAb的特异性和力。结论成功地构建50AScFv基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为进一步研制基因工程血型检定抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 ABO血型系统 基因工程抗体 半链抗体表达

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抗骨形成蛋白单链抗体的构建与表达

3

作者 孙远 杨连甲 +1 位作者 高玉好 金岩 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第4期276-278,共3页

目的：构建抗骨形成蛋白单链抗体并获得表达。方法：应用一段人工合成的含１５个氨基酸的连接肽，采取亚克隆技术，将一株鼠抗ＢＭＰ单克隆抗体的重链可变区（ＶＨ）的Ｎ端和轻链可变区（ＶＬ）的Ｃ端连接起来；将连接产物克隆入融合蛋... 目的：构建抗骨形成蛋白单链抗体并获得表达。方法：应用一段人工合成的含１５个氨基酸的连接肽，采取亚克隆技术，将一株鼠抗ＢＭＰ单克隆抗体的重链可变区（ＶＨ）的Ｎ端和轻链可变区（ＶＬ）的Ｃ端连接起来；将连接产物克隆入融合蛋白表达载体ｐＥＧＸ－４Ｔ－ｌ，在大肠杆菌ＪＭ１０９中进行表达。结果：构建的单链抗体（ＳｃＦｖ）全长７０５ｂｐ，并获得融合表达产物约５２×１０３ｕ。结论：亚克隆方法是一种构建单链抗体快速、简便、可靠的方法。 展开更多

关键词 BMP 连接肽 单链抗体 骨形成蛋白 抗体表达

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GST-PPARγC1原核表达载体的构建、表达及抗GST-PPARγC1多克隆抗体的制备 被引量：3

4

作者 张燕 薛耀明 +1 位作者 郭爱林 张文敏 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第5期558-561,共4页

目的在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗PPARγC1的多克隆抗体。方法从肝癌细胞系HepG2提取总RNA,用RT-PCR扩增出PPARγC1cDNA的编码序列,克隆入表达载体p... 目的在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗PPARγC1的多克隆抗体。方法从肝癌细胞系HepG2提取总RNA,用RT-PCR扩增出PPARγC1cDNA的编码序列,克隆入表达载体pGEX-4T-1中,重组载体在酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-PPARγC1蛋白,SDS-PAGE分析表达产物。通过亲和层吸法纯化表达的GST-PPARγC1融合蛋白,并以此为抗原制备多克隆抗体。Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果经测序、酶切鉴定证明,PPARγC1基因已正确插入到pGEX-4T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为44000的融合蛋白。Westernblotting鉴定所制备的多克隆抗体可以与PPARγC1特异性结合。结论PPARγC1片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体,为检测PPARγC1及其在其他组织中的表达提供了一种检测途径。 展开更多

关键词 过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1) 大肠杆菌 表达 多克隆抗体

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抗人肺腺癌单抗5F-11噬菌体抗体库的构建及表达

5

作者 岳文涛 赖百塘 +3 位作者 汪惠 湛秀萍 张春彦 扬学慧 《中国肺癌杂志》 CAS 2002年第2期119-122,共4页

目的　构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法　利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬... 目的　构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法　利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬菌体表达文库。结果　制备了库容为 8× 10 7pfu/ml的噬菌体展示文库。随机抽取未经筛选的克隆进行酶切 ,酶切图谱呈多样性 ,富集后的酶切图谱则显示特异构型的噬菌体得到富集。检测 30个噬菌体克隆上清 ,其中 2 3个与A2 细胞有较强反应。结论　本研究获得了抗人肺腺癌单抗 5F 11的单链抗体 ,为拓展抗体的应用创造了条件。 展开更多

关键词 噬菌体展示文库 抗体库 ScFv基因 肺腺癌 RT-PCR法 抗人肺腺癌单抗5F-11 单链抗体 构建 抗体表达

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基于抗原-抗体共表达的细菌展示技术的优化

6

作者 徐黎明 郭茉 +2 位作者 任桂萍 尹杰超 李德山 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期396-399,共4页

目的建立细菌周质内抗原抗体共表达系统。方法将人白介素-1β(hIL-1β)基因和抗人白介素1β单链抗体(anti-hIL-1βscFv)基因分别插入到细菌展示载体pBFD的pelB前导肽(游离型前导肽)和NlpA前导肽(锚定型前导肽)下游构建出重组载体pBFD-Ab... 目的建立细菌周质内抗原抗体共表达系统。方法将人白介素-1β(hIL-1β)基因和抗人白介素1β单链抗体(anti-hIL-1βscFv)基因分别插入到细菌展示载体pBFD的pelB前导肽(游离型前导肽)和NlpA前导肽(锚定型前导肽)下游构建出重组载体pBFD-Ab-Ag。将pBFD-Ab-Ag转入到E.coli DH5α中诱导表达,抗原和抗体蛋白相互结合而被锚定到细菌内膜外侧,破除细菌外壁(原生质球制备)后与适当浓度的FITC标记的小鼠抗hIL-1β抗体进行孵育,最后经流式细胞仪检测荧光信号,根据荧光信号强弱分析抗原抗体表达和相互作用情况。结果 pBFD-Ab-Ag E.coli DH5α具有很强的荧光信号,阳性率获得了大大的提高。结论成功建立了建立细菌周质内抗原抗体共表达系统,实现了抗体和抗原细菌周质内的正确折叠和相互识别。简化了现有的抗体筛选的流程,为蛋白质相互作用的研究提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 周质空间 抗原抗体共表达 流式细胞仪筛选 抗体库筛选 蛋白相互作用

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抗大肠癌组织差异表达蛋白(SCAP47)抗体的制备及初步应用

7

作者 王志红 曹建彪 李世荣 《科学技术与工程》 2004年第7期562-565,570,共5页

制备一种新的大肠癌组织差异表达蛋白质抗体(抗SCAP47),用于检测大肠癌相关肿瘤抗原SCAP47。采用本室制备的大肠癌组织差异表达蛋白质(SCAP47)免疫新西兰纯种兔,制备兔抗SCAP47抗体,用双向免疫扩散法和ELISA法测定抗体效价;并用ELISA法... 制备一种新的大肠癌组织差异表达蛋白质抗体(抗SCAP47),用于检测大肠癌相关肿瘤抗原SCAP47。采用本室制备的大肠癌组织差异表达蛋白质(SCAP47)免疫新西兰纯种兔,制备兔抗SCAP47抗体,用双向免疫扩散法和ELISA法测定抗体效价;并用ELISA法检测129例患者的胃肠道肿瘤和疾病及正常对照组织的可溶性SCAP47抗原。用SCAP47抗原免疫新西兰纯种兔,获得抗SCAP47抗体,经检测其最高效价:双向免疫扩散法为1∶32;ELISA法为1∶6400。129例患者的胃肠道肿瘤和疾病及正常对照组织可溶性SCAP47抗原ELISA法检测结果显示:诊断大肠癌的敏感性52.4％,特异性95.4％,阳性预示值84.6％,阴性预示值80.6％,似然比11.4,约登指数0.47。本实验制备的抗SCAP47抗体是一种新的大肠癌相关抗原SCAP47抗体。由于SCAP47不同于CEA、P^(27)、CCA等大肠癌肿瘤标志物,且在大肠癌中呈现高度表达,推测其可能是一种新的大肠癌相关抗原。因此,制备抗SCAP47抗体为用于多种指标联合检测早期大肠肿瘤提供了一种新的检测工具。 展开更多

关键词 大肠癌 抗大肠癌组织差异表达蛋白质抗体 大肠癌早期诊断

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单链抗体表达研究进展 被引量：5

8

作者 邓亮 舒建昌 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2009年第2期321-322,共2页

单链抗体（single-chain antibody fragment．scFv）由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽（1inker）连接而成。在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物，将极大增强对靶细胞的杀伤能力。Kanter等研究发现... 单链抗体（single-chain antibody fragment．scFv）由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽（1inker）连接而成。在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物，将极大增强对靶细胞的杀伤能力。Kanter等研究发现将个体基因型scFv和细胞因子粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子或免疫刺激肽组成融合蛋白，是一种有效治疗淋巴瘤的疫苗。Wang等通过抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和抗单端孢霉毒素（ZEN）seFv基因融合，表达为抗DON和抗ZEN scFv，结果显示双功能抗体成功构建．并可应用于DON和ZEN检测。 展开更多

关键词 抗体表达 单链抗体 巨噬细胞集落刺激因子 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 SCFV 生物毒素 轻链可变区 重链可变区

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GST-UCP2-N和GST-UCP2-C原核表达载体的构建表达及多克隆抗体的制备

9

作者 白蕊 郭亚楠 +2 位作者 卞桢 刘丹青 曾科 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期192-196,共5页

以pMD18-T-hucp2为模板,用设计的两对特异性的引物PCR得到hucp2cDNA N端和C端的两断基因片段,然后将其插入到pGEX-5X-1表达载体上,重组质粒在PCR、双酶切、测序鉴定后,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21表达大量融合蛋白GST-UCP2-N(C),经GST亲... 以pMD18-T-hucp2为模板,用设计的两对特异性的引物PCR得到hucp2cDNA N端和C端的两断基因片段,然后将其插入到pGEX-5X-1表达载体上,重组质粒在PCR、双酶切、测序鉴定后,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21表达大量融合蛋白GST-UCP2-N(C),经GST亲和层析纯化蛋白.以该蛋白为抗原免疫ucp2基因敲除小鼠,western blot鉴定血清中抗体的反应性.实验证明成功构建了构建pGEX-5X-1-UCP-N(C)重组质粒,表达出了融合蛋白.并获得了抗血清.为进一步获得灵敏性更高,特异性更强的UCP2的抗体打下了基础. 展开更多

关键词 解偶联蛋白2(UCP2) 表达 多克隆抗体

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基因工程抗体表达系统

10

作者 刘纯杰 王德文 郑兆荣 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1997年第2期59-60,共2页

关键词 基因工程 抗体表达

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多次油苗免疫刺激禽白血病内源性抗体的表达研究 被引量：1

11

作者 李玉燕 巩新民 +4 位作者 祝永华 衣文娟 丁爱君 来庆梅 郭龙宗 《家禽科学》 2019年第2期27-30,共4页

本试验将200只SPF鸡分为免疫组和非免疫组两组,在4周龄时混入HBD祖代鸡群2个批次,100只/组。将SPF鸡均匀的分布到5个鸡舍,每组每舍20只。免疫组的SPF鸡均按照祖代鸡的免疫程序进行油苗、活苗免疫;非免疫组不进行油苗免疫,仅免疫活苗。... 本试验将200只SPF鸡分为免疫组和非免疫组两组,在4周龄时混入HBD祖代鸡群2个批次,100只/组。将SPF鸡均匀的分布到5个鸡舍,每组每舍20只。免疫组的SPF鸡均按照祖代鸡的免疫程序进行油苗、活苗免疫;非免疫组不进行油苗免疫,仅免疫活苗。分别在9、19、26、30、34周龄采集SPF免疫组和非免疫组的血清,检测ALV-J、ALV-AB的抗体。SPF免疫组和非免疫组ALV抗体的差异显著性分析结果显示:在HBD祖代鸡群ALV-AB和ALV-J亚型抗体水平正常的情况下,随着油苗免疫次数的增加,SPF免疫组和非免疫组在26周龄时的ALV-J和ALV-AB亚型的抗体水平均差异极显著(P<0.001),在19周龄和34周龄均有不同程度的差异。混入的HBD祖代鸡群的种蛋禽白血病(ALV)p27和病原检测均为阴性,不存在水平传播的情况。这说明经多次油苗免疫刺激后,鸡只携带的内源性ALV诱导产生的抗体能被ALV-AB和ALV-J亚型检测试剂盒所检测到。 展开更多

关键词 油苗免疫 ALV 抗体表达

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单克隆抗体生产的新时代 被引量：3

12

作者 张志文 邹长江 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1994年第2期139-143,共5页

由ｆｄ噬菌体与质粒重组载体噬菌粒（ｐｈａｇｅｍｉｄ）构建大容量，高效筛选的表面表达抗体基因片段文库，经突变、模仿体内Ｂ细胞亲和力成熟过程（ａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）以免疫亲和层析筛选高亲和力特异抗体片段。... 由ｆｄ噬菌体与质粒重组载体噬菌粒（ｐｈａｇｅｍｉｄ）构建大容量，高效筛选的表面表达抗体基因片段文库，经突变、模仿体内Ｂ细胞亲和力成熟过程（ａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）以免疫亲和层析筛选高亲和力特异抗体片段。取代单克隆抗体，应用于免疫分析诊断。 展开更多

关键词 单克隆抗体 抗体片断 表面表达抗体

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杆状病毒AcMNPV p35基因的克隆表达及多抗制备 被引量：1

13

作者 李玲玲 李朝飞 庞义 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2007年第5期1-4,共4页

用PCR方法扩增得到苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californic anucleopolyhedrovirus,AcM N-PV)p35基因,将其克隆至质粒pET-32a(+)上,构建得到重组质粒pET-p35,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达了1条约为55 ku的蛋白带。以... 用PCR方法扩增得到苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californic anucleopolyhedrovirus,AcM N-PV)p35基因,将其克隆至质粒pET-32a(+)上,构建得到重组质粒pET-p35,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达了1条约为55 ku的蛋白带。以Ni2+-NTA偶连抗体检测证明所表达的蛋白为带有组氨酸的融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化融合蛋白,以纯化的融合蛋白制备多克隆抗体,效价为1/1 024。免疫印迹分析表明,该抗血清能与感染苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒的细胞蛋白样品发生特异性反应。 展开更多

关键词 苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒p35基因基因表达多克隆抗体

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λ轻链抗原的克隆与表达

14

作者 韩焕兴 黄宗文 +4 位作者 郑大勇 罗荣城 叶伟民 陆慧琦 孔宪涛 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第10期528-530,共3页

目的:应用分子生物学方法克隆、表达λ轻链基因,探索有效制备高纯度轻链抗原技术.方法:应用已有pComb3抗-HBsFab表达载体,用限制性双酶切去除Fab中的H链基因,合成互补于两酶点粘端的短核苷酸链,并加以多聚组氨酸编码基因,通过复性、连... 目的:应用分子生物学方法克隆、表达λ轻链基因,探索有效制备高纯度轻链抗原技术.方法:应用已有pComb3抗-HBsFab表达载体,用限制性双酶切去除Fab中的H链基因,合成互补于两酶点粘端的短核苷酸链,并加以多聚组氨酸编码基因,通过复性、连接酶连接构建λ轻链表达载体.结果:重构建载体的单酶切、电泳表明分子的大小为4.4 kb,已切除H链基因;阳性株经IPTG诱导表达上清的免疫转印结果显示为抗轻链血清反应带;电泳位置与轻链的分子量吻合,成单一区带;直接ELISA结果表明,正确连接的克隆表达上清与抗Polyhis血清发生反应.结论:用生物工程技术克隆表达λ轻链具有简便、实用的特点,更易获得高纯度产品,是可以替代常规轻链抗原提纯的理想方法. 展开更多

关键词 λ轻链纯化 抗体基因表达 免疫转印

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用磁性细菌培养生产具有机能的磁性体

15

作者 孙国凤 《生物技术通报》 CAS CSCD 1995年第4期12-12,共1页

日本东京农工大学工学部教授忪永是等在磁性细菌所具有的磁性微粒子的表面表达重组蛋白获得成功。如能表达抗体和酶等蛋白,就能用发酵法直接生产具有机能的磁性体。可用于识别目的物质且可用磁力分离机能性材料,扩大了其应用范围。将于1... 日本东京农工大学工学部教授忪永是等在磁性细菌所具有的磁性微粒子的表面表达重组蛋白获得成功。如能表达抗体和酶等蛋白,就能用发酵法直接生产具有机能的磁性体。可用于识别目的物质且可用磁力分离机能性材料,扩大了其应用范围。将于11月底在神户市召开的日本生物工程学会上发表该项成果。 松永等用光度计确认了将荧光素酶基因作为模型基因导入磁性细菌后,发现磁性微粒子表面有荧光素酶活性。目前该氏使用转座子,得到磁性细菌参与整合铁的过程的基因magA。实验表明。 展开更多

关键词 磁性细菌 磁性微粒 磁力分离机 基因导入 磁性体 虫荧光素酶 能性材料 重组蛋白 酶活性 表达抗体

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“Plantibodies”赋予植物新特性

16

作者 李思经 《生物技术通报》 CAS CSCD 1996年第3期17-18,共2页

抗体在植物中表达为遗传工程植物抗诸多病原体提供了一个可供选择的途径。欧共体资助的Biore—search Ireland公司进行的生物技术研究项目的目的就是改进这一基础技术使抗体分子表达并定靶入植物体内。这些抗体分子命名为"Plantibo... 抗体在植物中表达为遗传工程植物抗诸多病原体提供了一个可供选择的途径。欧共体资助的Biore—search Ireland公司进行的生物技术研究项目的目的就是改进这一基础技术使抗体分子表达并定靶入植物体内。这些抗体分子命名为"Plantibodies",它为反义技术的应用开辟了道路。Plantibodies可应用于遗传工程植物抗病性、改变植物代谢途径、促进植物生长。研究证实了通过植物表达抗体(阻止菊芋斑皱病毒侵染烟草)使植物获得抗性的可行性。 展开更多

关键词 植物体 植物抗病性 病毒侵染 促进植物生长 反义技术 模拟抗体 遗传工程 表达抗体 工程植物 植物代谢

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