辣椒疫霉病无毒基因RXLR128001克隆与蛋白表达纯化 被引量：1

1

作者 王晓梅 张钟文 杨楠 《山东农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 2016年第1期25-29,共5页

本文从强致病辣椒疫霉菌SD33分离克隆了1个效应分子RXLR128001基因,利用生物信息学软件BLAST and Signal P4.1 Server,分析了该效应分子的基因序列结构。在此基础上进行了该基因大肠杆菌(Escherichia coli)表达与纯化,界定了适宜该基因... 本文从强致病辣椒疫霉菌SD33分离克隆了1个效应分子RXLR128001基因,利用生物信息学软件BLAST and Signal P4.1 Server,分析了该效应分子的基因序列结构。在此基础上进行了该基因大肠杆菌(Escherichia coli)表达与纯化,界定了适宜该基因高效表达的诱导条件,经过亲和层析和离子交换层析,获得了RXLR128001基因较高纯度的蛋白,以利于后续晶体的培养与优化研究。 展开更多

关键词 辣椒疫霉 效应蛋白 基因克隆 蛋白表达纯化

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鸡补体受体2基因克隆、蛋白表达纯化及其多克隆抗体的制备和鉴定 被引量：3

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作者 孔子萌 江波 +3 位作者 蔡云虹 何后军 李永清 靳换 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第1期201-208,共8页

为初步鉴定鸡补体受体2(ChCR2)基因,本试验设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增ChCR 2基因。利用同源臂连接的方法构建去掉跨膜区的ChCR2-△TM基因的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-... 为初步鉴定鸡补体受体2(ChCR2)基因,本试验设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增ChCR 2基因。利用同源臂连接的方法构建去掉跨膜区的ChCR2-△TM基因的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM,将两个原核质粒转入大肠杆菌表达系统中表达GST-ChCR2-△TM和His-ChCR2-△TM蛋白。将纯化后的GST-ChCR2-△TM蛋白免疫BALB/c小鼠制备血清多克隆抗体,以His-ChCR2-△TM蛋白为包被原,ELISA检测血清多克隆抗体效价。利用间接免疫荧光试验和Western blotting对抗原抗体的特异结合性进行鉴定。结果显示,扩增到了一条大小为1113 bp的ChCR 2基因条带。成功构建了去掉跨膜区的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM。诱导表达的GST-ChCR2-△TM蛋白在低温(16℃)诱导条件下可溶,而His-ChCR2-△TM蛋白以包涵体的形式存在。经ELISA测定,GST-ChCR2-△TM蛋白免疫的BALB/c小鼠血清效价为1∶512000。间接免疫荧光试验和Western blotting结果显示,制备的抗GST-ChCR2-△TM蛋白血清多克隆抗体可与ChCR2蛋白发生特异性结合。本研究结果为ChCR 2基因的进一步鉴定及鸡乃至禽类的相关免疫学研究提供了参考依据。 展开更多

关键词 ChCR2基因 蛋白表达和纯化 多克隆抗体 ELISA 间接免疫荧光 Western BLOTTING

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志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak的表达纯化与多克隆抗体的制备及应用

3

作者 贾雪娇 刘梦琦 +7 位作者 刘洋 刘长城 李小凤 胡屹硕 李香雨 李润林 李永刚 赵微 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期236-242,共7页

目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dn... 目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak;pET24a(+)-Dnak原核表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经镍柱纯化Dnak蛋白。以纯化后的重组蛋白为免疫原免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测效价,Western Blot法检测灵敏度和特异性。利用制备的多克隆抗体在GST Pull-down实验中检测Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2的相互作用。真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak转染至HEK293T细胞,以制备的DnaK多克隆抗体为一抗,Western blot法检测Dnak在细胞中的表达。利用MEGA11及Genedoc软件分析此志贺氏杆菌与志贺菌属其他细菌Dnak氨基酸序列同源性。结果重组质粒pET24a(+)-Dnak与PCDNA3.1-Dnak经测序比对包含与此志贺氏杆菌(Shigella:PRJNA804371)序列一致的基因,证明质粒构建成功。诱导表达的重组Dnak蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约为75 kDa,浓度可达0.62 mg/mL;Dnak鼠多克隆抗体可与重组Dnak蛋白发生特异性反应,效价为1∶32000,至少可以在1∶6000稀释度下检测到Dnak蛋白。GST Pull-down实验可以检测到Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2发生相互作用。转染PCDNA3.1-Dnak重组质粒的HEK293T细胞可以表达Dnak蛋白。经MEGA11和Genedoc软件比对PRJNA804371株与宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)Dnak氨基酸序列同源性较高。结论成功表达志贺氏杆菌Dnak蛋白,具有良好反应性与免疫原性;制备的鼠多克隆抗体效价及灵敏度较高可满足后续实验需要。 展开更多

关键词 志贺氏杆菌 DNAK 蛋白表达与纯化 多克隆抗体 轮状病毒

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组蛋白去甲基化酶JARID1B的表达纯化及酶活力分析 被引量：1

4

作者 郭雪 刘意 +1 位作者 杨慧蓉 徐彦辉 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期342-347,共6页

目的筛选能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的组蛋白去甲基化酶JARID1B(jumonji AT-richinteractive domain 1B)的截短体。方法通过Bac-to-Bac系统制备含目的基因的杆粒(bacmid),转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒基因组,并感染Hi5昆虫细... 目的筛选能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的组蛋白去甲基化酶JARID1B(jumonji AT-richinteractive domain 1B)的截短体。方法通过Bac-to-Bac系统制备含目的基因的杆粒(bacmid),转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒基因组,并感染Hi5昆虫细胞表达目的蛋白,用Ni-NTA亲和层析,离子交换层析和分子筛纯化目的蛋白。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time offlight mass spectrometer,MALDI-TOF)分析截短体的酶活力。结果去除C-端两个PHD结构域的截短体JARID1B1-825能够在昆虫细胞Hi5中得以大量表达(1L细胞含10mg蛋白),经Ni-NTA亲和层析,阴离子交换层析和分子筛三步纯化,获得纯度大于90%的目的蛋白,MALDI-TOF质谱分析显示JARID1B1-825仍拥有去组蛋白甲基化修饰的酶活性。结论筛选到了能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的JARID1B的截短体,对其后续的功能研究和药物开发具有重要的意义。 展开更多

关键词 组蛋白去甲基化酶 JARID1B 昆虫细胞表达系统 蛋白表达纯化

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嗜热毛壳菌端粒酶的表达纯化及酶学特性分析

5

作者 尹虎 宋泽玉 奚绪光 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期532-541,共10页

为进一步探究端粒酶的酶学特性,以嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum, Thermo)端粒酶为研究对象,通过生物化学、生物信息学等方法得到4种不同长度的Thermo端粒酶蛋白,分别与体外转录得到的Thermo端粒酶RNA进行组装。通过端粒酶体外延... 为进一步探究端粒酶的酶学特性,以嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum, Thermo)端粒酶为研究对象,通过生物化学、生物信息学等方法得到4种不同长度的Thermo端粒酶蛋白,分别与体外转录得到的Thermo端粒酶RNA进行组装。通过端粒酶体外延伸试验检测组装体的反转录活性,进一步分析影响其反转录活性的各种因素。结果表明,4种不同长度的Thermo端粒酶蛋白重组质粒经大肠杆菌表达系统诱导表达后均可得到相应的Thermo端粒酶蛋白,且纯度均在90%以上;体外孵育试验表明,在10 mmol/L HEPES-KOH(pH 8.0)、1 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、体积分数25%Glycerol、10units/μL Rnasin的条件下,端粒酶蛋白与RNA的摩尔浓度比达到1∶1及以上时,两者能有效复合;端粒酶体外延伸试验发现,结构完整的Thermo端粒酶组装体具有很强的反转录活性,可使18nt-DNA引物反复延伸。TEN结构域不完整并未减弱Thermo端粒酶组装体的反转录活性,说明其在反转录过程中未发挥显著作用。T-PK区或TWJ区缺失的组装体均不能使18nt-DNA引物发生延伸,表明RNA结构的完整性是端粒酶发挥反转录功能的必要条件。 展开更多

关键词 Thermo端粒酶 蛋白表达纯化 RNA体外转录 反转录活性

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牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Ltp1的表达、纯化及酶学性质研究 被引量：1

6

作者 顾前程 夏荣 孔文文 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2020年第6期974-978,共5页

采用重组法构建Ltp1的原核表达载体,并将其转化至E.coli BL21(DE3)中进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导过表达,然后用镍柱层析法粗纯化,分子筛细纯化得到目的蛋白,以SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达产物;将目的蛋白和底物对... 采用重组法构建Ltp1的原核表达载体,并将其转化至E.coli BL21(DE3)中进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导过表达,然后用镍柱层析法粗纯化,分子筛细纯化得到目的蛋白,以SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达产物;将目的蛋白和底物对硝基苯磷酸二钠显色反应分析其活性。SDS-PAGE结果显示有与目的蛋白理论相对分子质量一致的表达条带;Western blot分析证实该蛋白带有6个组氨酸(His)标签的目的蛋白,能够催化磷酸单酯的活性;计算出米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)分别为70.4μmol、51.1μmol/(L·min),pH 5.0~6.0催化活性最高,在37~50℃具有较高活性。 展开更多

关键词 牙龈卟啉单胞菌 Ltp1(PG1641) 蛋白表达纯化 牙周病 酶学研究

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GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用

7

作者 张珍珍 尹延青 +1 位作者 周嘉伟 乐卫东 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期580-584,共5页

目的构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pulldown方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用。方法以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回... 目的构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pulldown方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用。方法以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白;将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用。结果酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMP1融合蛋白原核表达载体;考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMP1融合蛋白;GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用。结论获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用。 展开更多

关键词 p43/AIMP1 蛋白表达纯化 GST pull-down 神经中间丝轻链蛋白

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HCA518的蛋白表达、纯化和单克隆抗体的制备 被引量：1

8

作者 杨小昂 钱晓萍 +2 位作者 孙秀媛 邵启祥 陈慰峰 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期29-32,共4页

目的:对HCA518蛋白进行表达和纯化,并制备HCA518蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在原核系统表达HCA518蛋白,金属镍螯合的Ni-NAT亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA方法进行单克... 目的:对HCA518蛋白进行表达和纯化,并制备HCA518蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在原核系统表达HCA518蛋白,金属镍螯合的Ni-NAT亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA方法进行单克隆抗体细胞株的筛选;Westem blot方法鉴定单克隆抗体的特异性;免疫荧光法对HCA518蛋白进行定位。结果:成功表达和纯化了HCA518重组蛋白,其纯度达98％。共筛选出2株分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了HCA518的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体的效价分别为1×10-4、5×10-4,属于IgG2b亚型和IgM,该抗体能与重组蛋白和肿瘤细胞核蛋白(P100)发生特异性反应,免疫荧光显示HCA518蛋白主要定位于细胞核中。结论:建立了稳定分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体特异性好,对进一步应用于检测肿瘤组织中HCA518蛋白和判断肿瘤细胞的恶性增生程度预测肿瘤预后具有重要的实用价值。 展开更多

关键词 蛋白表达和纯化 肿瘤相关抗原 HCA518 单克隆抗体

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睾丸特异表达蛋白质RNF138的表达纯化及抗体制备

9

作者 梁俊波 程筱雯 +1 位作者 缪时英 王琳芳 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期111-114,166,共5页

目的:制备RNF138的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法:通过RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mRNF138的开放阅读框,并克隆至原核表达载体pET-30a中;将测序正确的pET-30a(+)/mRNF138重组质粒转化大肠杆菌Rosseta菌株,经IPTG诱导... 目的:制备RNF138的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法:通过RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mRNF138的开放阅读框,并克隆至原核表达载体pET-30a中;将测序正确的pET-30a(+)/mRNF138重组质粒转化大肠杆菌Rosseta菌株,经IPTG诱导表达后通过镍离子螯合柱(Ni-NTA)亲和纯化得到重组的mRNF138蛋白;用纯化的mRNF138蛋白免疫新西兰大白兔得到多克隆抗体.结果:ELISA检测结果显示,制备抗体的滴度达到1∶32万;Western Blot实验结果显示,所制备抗体不仅能识别原核表达的融合蛋白,也可以有效识别小鼠源的RNF138蛋白. 展开更多

关键词 RNF138 基因克隆 蛋白表达纯化 WESTERNBLOT

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鱼腥藻PCC 7120中all3556蛋白的表达与纯化 被引量：1

10

作者 王小琴 李至敏 +1 位作者 雷国风 李志敏 《江西农业学报》 CAS 2017年第5期1-4,共4页

琥珀酸半醛脱氢酶在生物体中发挥重要的生理功能。通过BLAST序列分析,发现鱼腥藻PCC 7120中all3556基因编码琥珀酸半醛脱氢酶。实验通过常规PCR从鱼腥藻PCC 7120基因组中克隆了all3556基因,将该基因构建到p ET-28a载体上并在大肠杆菌BL2... 琥珀酸半醛脱氢酶在生物体中发挥重要的生理功能。通过BLAST序列分析,发现鱼腥藻PCC 7120中all3556基因编码琥珀酸半醛脱氢酶。实验通过常规PCR从鱼腥藻PCC 7120基因组中克隆了all3556基因,将该基因构建到p ET-28a载体上并在大肠杆菌BL21(DE3)菌体中表达。经过SDS-PAGE电泳,结果表明:all3556蛋白可以在该表达体系中高效可溶性表达。利用镍亲和层析纯化方法得到了纯度大于95%的all3556蛋白,蛋白收率约为27 mg/g菌体。研究为进一步阐明all3556蛋白的催化功能及机制奠定了重要基础。 展开更多

关键词 鱼腥藻PCC 7120 all3556蛋白 蛋白表达与纯化

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金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrE的表达、纯化及晶体生长

11

作者 张绍城 郭珍 +3 位作者 张宏鹏 苟冶然 龙小滨 汪德强 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期529-533,共5页

目的:对金黄色葡萄球菌表面蛋白质(serine-aspartate repeat,SdrE)进行克隆表达纯化及晶体培养,以期解析其三维结构,进而深入分析金黄色葡萄球菌感染的分子机制,为研发新的抗菌药物提供基础。方法:利用PCR技术扩增SdrE基因,构建重组质粒... 目的:对金黄色葡萄球菌表面蛋白质(serine-aspartate repeat,SdrE)进行克隆表达纯化及晶体培养,以期解析其三维结构,进而深入分析金黄色葡萄球菌感染的分子机制,为研发新的抗菌药物提供基础。方法:利用PCR技术扩增SdrE基因,构建重组质粒pW28-SdrE,并在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)B834中表达,用Ni2+-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化SdrE蛋白质,再用Hiload Superdex 200凝胶层析柱分析其在溶液中的聚集状态,用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体。结果:(1)构建了重组质粒pW28-SdrE,并在E.coli B834中可溶性表达。(2)获得了纯度较高(85%)的SdrE蛋白质,该蛋白质在溶液中以单体形式存在。(3)培养出晶形较好、衍射能力较强的SdrE蛋白质单晶。结论:利用经典的蛋白质纯化技术和晶体培养技术,可以获得衍射能力较强的SdrE单晶,为其三维结构的解析和基于结构的新型特异性抗菌药物的研发提供了重要的基础。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 表面蛋白质SdrE 蛋白质表达纯化 蛋白质晶体培养 抗菌药物

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水稻锌指蛋白OsRZ3基因克隆及融合蛋白的原核表达、纯化

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作者 孙宇 王金麟 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期492-497,共6页

根据NCBI登录的水稻锌指蛋白基因(NO.AK062094,OsRZ3 gene)设计特异引物,通过RT-PCR克隆该基因cDNA全长序列,核苷酸测序并比对氨基酸同源性表明具有C2HC-锌指结构域、分析预测蛋白质分子量为34kD和等电点为9.05;拟南芥原生质体亚细胞定... 根据NCBI登录的水稻锌指蛋白基因(NO.AK062094,OsRZ3 gene)设计特异引物,通过RT-PCR克隆该基因cDNA全长序列,核苷酸测序并比对氨基酸同源性表明具有C2HC-锌指结构域、分析预测蛋白质分子量为34kD和等电点为9.05;拟南芥原生质体亚细胞定位检测表明其在细胞核。构建pGEX6P-3::OsRZ3融合载体,电转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株经1 mmol·L-1IPTG小量诱导表达,SDS-pAGEX蛋白电泳表明60 kD融合蛋白4 h最大;在LB液体培养中0.5 mmol·L-1IPTG过夜大量诱导表达,通过GST吸附柱层析获得大量包涵体纯化蛋白,1L菌液可诱导纯化到浓度1.58 mg·mL-1包涵体融合蛋白。所构建的融合蛋白原核表达系统能有效表达pGEX6P-3::OsRZ3融合蛋白,0.5 mmol·L-1IPTG大量诱导,通过GST柱吸附获得包涵体纯化蛋白,为作进一步的抗体制备和染色质免疫共沉淀等DNA结合的特性研究准备了基础。 展开更多

关键词 水稻 锌指蛋白 原核蛋白表达与纯化

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拟南芥FT基因原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化 被引量：8

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作者 任霞 吴忠义 +1 位作者 黄丛林 张秀海 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期99-103,共5页

FT基因是植物成花素,在植物的开花调控中起着重要作用。构建了用于原核表达的FT-eGFP表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白的诱导表达。从IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度等方面进行了细致的分析,最终建立了FT-eGFP融合蛋白诱导... FT基因是植物成花素,在植物的开花调控中起着重要作用。构建了用于原核表达的FT-eGFP表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白的诱导表达。从IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度等方面进行了细致的分析,最终建立了FT-eGFP融合蛋白诱导表达的优化体系:当菌液OD600=0.6-1.0时,采用IPTG1.0mol/L,在28℃诱导表达6h。摸索和建立了利用HisTrapKit标签,经过镍柱纯化,纯化目的蛋白的技术体系,为进一步研究FT基因在植物开花调控中的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 FT—eGFP融合蛋白 原核表达蛋白纯化

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碱茅PutSnRK2基因表达、克隆及其蛋白纯化 被引量：3

14

作者 刘伟 张欣欣 《草业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期2004-2011,共8页

从NaHCO_3逆境胁迫下碱茅(Puccinellia tenuiflora)的cDNA文库中克隆得到PutSnRK2基因全长cDNA。PutSnRK2基因序列中存在1 077bp的开放阅读框,编码358个氨基酸,预测蛋白分子量为41.11kDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR分析表明,在NaHC... 从NaHCO_3逆境胁迫下碱茅(Puccinellia tenuiflora)的cDNA文库中克隆得到PutSnRK2基因全长cDNA。PutSnRK2基因序列中存在1 077bp的开放阅读框,编码358个氨基酸,预测蛋白分子量为41.11kDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR分析表明,在NaHCO_3、NaCl、ABA和PEG胁迫下,PutSnRK2基因在碱茅叶、根中均受到显著诱导(P<0.05)。同时用pGEX-6p-3载体构建了PutSnRK2基因的原核表达载体,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达纯化得到GST-PutSnRK2融合蛋白,为后续试验分析PutSnRK2蛋白的激酶活性、验证蛋白间的相互作用等研究奠定了基础。 展开更多

关键词 碱茅 SnRK2 非生物胁迫 基因表达 蛋白表达与纯化

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大劣按蚊卵黄蛋白原基因cDNA全长序列扩增及功能域蛋白的表达与纯化研究 被引量：1

15

作者 于莎莎 胡辉 +4 位作者 秦杰 王静 刘婷 刘婷婷 王英 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1140-1145,共6页

目的对大劣按蚊卵黄蛋白原(Anopheles dirus vitellogenin, AdVg)基因cDNA的全长序列进行扩增和分析,并对其功能域蛋白进行表达与纯化。方法基于前期克隆的AdVg基因cDNA片段,利用RACE PCR技术,扩增AdVg基因的5′末端及3′末端序列。用Ve... 目的对大劣按蚊卵黄蛋白原(Anopheles dirus vitellogenin, AdVg)基因cDNA的全长序列进行扩增和分析,并对其功能域蛋白进行表达与纯化。方法基于前期克隆的AdVg基因cDNA片段,利用RACE PCR技术,扩增AdVg基因的5′末端及3′末端序列。用Vector NTI软件将测序得到的AdVg cDNA片段、5′末端序列、3′末端序列进行校正,拼接得到完整的AdVg cDNA全长序列。对AdVg全长序列进行功能域预测。利用pet28a(+)构建重组质粒进行AdVg功能域蛋白的表达与纯化。结果成功获得AdVg基因全长cDNA序列,包括117 bp的5′UTR序列、192 bp的3′UTR序列和6 186 bp的ORF序列。AdVg蛋白主要包含Vit N、DUF1943及vWD 3个结构域。通过构建重组质粒,成功表达和纯化了AdVg Vit N功能域蛋白。结论成功克隆了大劣按蚊卵黄蛋白原基因的全长序列,并获得了重组蛋白。 展开更多

关键词 大劣按蚊 卵黄蛋白原基因 RACE扩增 蛋白表达与纯化

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粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备 被引量：2

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作者 刘雁霞 李少杰 樊振川 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期216-222,共7页

构建p ET-28a(+)-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入p ET-28a(+)原核表达载体,并转入E.coli BL21(DE3)感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西... 构建p ET-28a(+)-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入p ET-28a(+)原核表达载体,并转入E.coli BL21(DE3)感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了p ET-28a(+)-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6×His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。 展开更多

关键词 粗超脉孢菌ERG-11基因 克隆 蛋白表达及纯化 多克隆抗体

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肺炎链球菌热休克蛋白Grp E的表达、纯化及热稳定性研究

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作者 张宏鹏 赵沙沙 +5 位作者 龙小滨 吴爽 白垒 罗淼 黄爱龙 汪德强 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1448-1451,共4页

目的:肺炎链球菌可引起细菌性肺炎和脑膜炎、发热性菌血症等多种疾病。对肺炎链球菌热休克蛋白Grp E进行克隆表达,纯化及热稳定性测定,以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。方法:利用PCR技术扩增Grp E基因,构建重组质粒p W28-Grp... 目的:肺炎链球菌可引起细菌性肺炎和脑膜炎、发热性菌血症等多种疾病。对肺炎链球菌热休克蛋白Grp E进行克隆表达,纯化及热稳定性测定,以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。方法:利用PCR技术扩增Grp E基因,构建重组质粒p W28-Grp E,并在大肠杆菌(escherichia coli,E.coli)B834中表达,Ni2+-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化Grp E蛋白,Hiload Superdex 75凝胶层析柱分析在溶液中的聚集状态,热稳定性(thermal shift assay,TSA)法测定热稳定性。结果:1成功构建重组质粒p W28-Grp E,在表达菌E.coli B834中可溶性表达。2获得高纯度(95.0%以上)Grp E蛋白,发现该蛋白在溶液中以二聚体形式存在。3测定Grp E蛋白在p H 6.0、20 mmol/L盐浓度缓冲液中有较高热稳定性。结论:利用经典的蛋白质克隆表达纯化技术,获得了高表达量高纯度的Grp E蛋白,并初步测定其热稳定性为下一步蛋白晶体培养、三维结构解析及感染机制研究提供重要基础。 展开更多

关键词 肺炎链球菌 热休克蛋白Grp E 蛋白质表达纯化 热稳定性

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甘蔗DELLA蛋白GAI基因的蛋白表达及纯化

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作者 方金兰 柴哲 +1 位作者 陈保善 张木清 《中国糖料》 2020年第1期1-5,共5页

赤霉素是开花植物生长发育过程中一个重要的激素,调控种子萌发、茎伸长、叶片扩张、花器官发育,参与各种生物胁迫等多种途径;DELLA蛋白是赤霉素信号途径的抑制因子,DELLA蛋白通过与其他蛋白互作进行相关调控。为研究甘蔗蛋白调控机制,... 赤霉素是开花植物生长发育过程中一个重要的激素,调控种子萌发、茎伸长、叶片扩张、花器官发育,参与各种生物胁迫等多种途径;DELLA蛋白是赤霉素信号途径的抑制因子,DELLA蛋白通过与其他蛋白互作进行相关调控。为研究甘蔗蛋白调控机制,本研究利用原核表达技术体外诱导进行表达。结果表明,ScGAI蛋白全长不表达,但ScGAI-C在pET-28a(+MBP)中能够有效表达,大量诱导蛋白表达后经镍柱纯化,Western blot分析验证ScGAI蛋白被成功诱导出来。 展开更多

关键词 甘蔗 DELLA蛋白 ScGAI基因 蛋白表达及纯化

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易通过冷冻食品传播的新冠病毒解旋酶的表达纯化及酶活研究 被引量：3

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作者 李海红 郑亚婷 +3 位作者 高博 韩晓睿 何怡宁 侯锡苗 《农产品加工》 2021年第24期68-71,74,共5页

通过原核表达方式纯化得到新冠病毒解旋酶(SARS-CoV-2-Nsp13),并利用荧光各向异性和凝胶阻滞试验探究了其体外结合DNA、RNA底物的亲和力及解旋双链DNA的最佳解旋条件。结果表明,SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶具有结合单链DNA(ssDNA)、带有5&#... 通过原核表达方式纯化得到新冠病毒解旋酶(SARS-CoV-2-Nsp13),并利用荧光各向异性和凝胶阻滞试验探究了其体外结合DNA、RNA底物的亲和力及解旋双链DNA的最佳解旋条件。结果表明,SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶具有结合单链DNA(ssDNA)、带有5'尾链的双链DNA(5'Oh-dsDNA)及RNA发卡结构(RNA-HP)的活力,亲和性依次为5'Oh-dsDNA≈RNA-HP>ssDNA,结合曲线呈S型。SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶与DNA、RNA底物的结合具有协同性。SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶可以解旋带有5'尾链的双链DNA,解旋的方向为5'-3',发挥完全解旋活性的酶浓度为3μmol/L;而该解旋酶解旋DNA双链的活性相对较弱,解旋活性在NaCl浓度达到80 mmol/L时受到明显的抑制。研究结论可为深入理解冠状病毒解旋酶的生化活性及工作机理提供参考和帮助。 展开更多

关键词 冠状病毒 Nsp13解旋酶 蛋白表达纯化 DNA结合活性 DNA解旋活性

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大白菜渗透压应激活化蛋白激酶基因SRK2F的克隆与表达

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作者 周志国 王聪艳 《中国蔬菜》 北大核心 2015年第5期28-33,共6页

以不耐盐、不耐旱的大白菜自交系SY-14-06为试材,提取根部总RNA,反转录为c DNA。根据大白菜SRK2F基因设计引物,PCR扩增SRK2F基因CDS序列1044bp。SRK2F编码347个氨基酸,预测分子量为39.3k D,理论等电点为4.88。利用p EASY-E1原核表达载... 以不耐盐、不耐旱的大白菜自交系SY-14-06为试材,提取根部总RNA,反转录为c DNA。根据大白菜SRK2F基因设计引物,PCR扩增SRK2F基因CDS序列1044bp。SRK2F编码347个氨基酸,预测分子量为39.3k D,理论等电点为4.88。利用p EASY-E1原核表达载体构建原核表达质粒p EASY-E1-SRK2F,转化表达菌株Transetta（DE3）,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。经Smart-embl预测其具有丝/苏氨酸激酶特有结构域,位于第4~260位氨基酸处。经Clustal X2比对,其与拟南芥同源性最高。最后利用镍离子金属螯合亲和层析介质对该蛋白进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。 展开更多

关键词 大白菜 SRK2F 序列分析 蛋白表达纯化

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