虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ-(HWTX-Ⅰ)28肽类似物的化学合成与活性鉴定 被引量：12

1

作者 廖黔宁 罗静初 +2 位作者 周培爱 顾孝诚 梁宋平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第5期756-761,共6页

虎纹捕鸟蛛毒素-(huwentoxin-,HWTX-)是从我国虎纹捕鸟蛛毒素中分离纯化得到的一种多肽类神经毒素.该多肽分子由33个氨基酸残基组成,含三对二硫键.其一级结构和三级结构均已测定.弄清该毒素的活性部位,是研究其结构功能关系的基础.用固... 虎纹捕鸟蛛毒素-(huwentoxin-,HWTX-)是从我国虎纹捕鸟蛛毒素中分离纯化得到的一种多肽类神经毒素.该多肽分子由33个氨基酸残基组成,含三对二硫键.其一级结构和三级结构均已测定.弄清该毒素的活性部位,是研究其结构功能关系的基础.用固相Fmoc化学合成的方法,合成了虎纹捕鸟蛛-的28肽类似物.该突变体去掉了天然毒素分子N端的Alal和C端的Lys30-Trp31-Lys32-Leu33共5个残基.用氧化还原型谷胱甘肽法完成二硫键配对,并用HPLC进行纯化,所得突变体与天然HWTX-的紫外光谱相似.质谱鉴定确认合成产物正确,分子量为3124,浓度为1×10-5g/ml的突变体能可逆阻断小白鼠膈神经-膈肌的接头传递,阻断时间为60～70min.与天然毒素比较,活性有所下降.结果说明HWTX-的N端、C端残基对其生物活性有一定影响,但不是位于活性中心的重要残基.由结果推测。 展开更多

关键词 虎纹捕鸟蛛毒素 固相多肽 合成 活性 蜘蛛毒素

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部分还原和分步序列测定法定位虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ二硫键 被引量：7

2

作者 刘中华 梁宋平 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2003年第10期1815-1819,共5页

结合部分还原和分步序列测定法确定了虎纹捕鸟蛛毒素 - 的二硫键配对方式 .在 p H=3和 40℃的条件下与还原剂三羧甲基磷酸 ( TCEP)反应 1 0 min,利用 RP-HPLC分离并分别收集含有一对和两对二硫键被还原的中间体 ,分别与 0 .5 mol/L碘乙... 结合部分还原和分步序列测定法确定了虎纹捕鸟蛛毒素 - 的二硫键配对方式 .在 p H=3和 40℃的条件下与还原剂三羧甲基磷酸 ( TCEP)反应 1 0 min,利用 RP-HPLC分离并分别收集含有一对和两对二硫键被还原的中间体 ,分别与 0 .5 mol/L碘乙酰胺溶液 ( p H=8.3 )反应 1 min,使游离巯基烷基化后 ,测定各中间体的氨基酸序列 ,从而确定虎纹捕鸟蛛毒素 - 的 3对二硫键分别为 Cys2 -Cys1 7,Cys9-Cys2 4和Cys-Cys 3 1 ( 1 -4,2 -5和 3 -6) . 展开更多

关键词 部分还原 分步序列 测定法 定位 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ 二硫键 三羧甲基磷酸 毒素多肽

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虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ突变体A1Y-HWTX-Ⅰ的固相合成和生物学活性测定 被引量：17

3

作者 王贤纯 梁宋平 +1 位作者 罗泽民 public.cs.hn.cn 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 2000年第3期357-362,共6页

用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相多肽合成的方法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了用酪氨酸 (Y)替代虎纹捕鸟蛛毒素 - (HWTX- )第一位丙氨酸 (A1 )的突变体 A1 Y- HWTX- .合成的突变体用 Edman降解和电喷雾质谱法进行鉴定 .活性分析结果证... 用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相多肽合成的方法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了用酪氨酸 (Y)替代虎纹捕鸟蛛毒素 - (HWTX- )第一位丙氨酸 (A1 )的突变体 A1 Y- HWTX- .合成的突变体用 Edman降解和电喷雾质谱法进行鉴定 .活性分析结果证明 ,合成的 A1 Y- HWTX- 在含有谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠后显示出与天然 HWTX- 完全相同的生物学活性 ,提示 Y替代 HWTX- 的 A1后并不明显影响 HWTX- 的活性部位和空间构象 ;A1与 HWTX- 生物学活性无关 .此外 ,将 Y引入 HWTX- 分子有助于利用碘标记方法研究 HWTX- 展开更多

关键词 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ 突变体 固相合成 生物活性

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虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的二硫键定位分析 被引量：4

4

作者 张鹏飞 肖顺勇 梁宋平 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第6期550-555,共6页

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ是从虎纹捕鸟蛛毒液中分离得到的一种昆虫毒素 .它含有 35个氨基酸残基 ,其中 6个半胱氨酸形成三对二硫键 .首先采用多酶将天然的肽链裂解后 ,通过MALDI TOF质谱分析酶解肽段 ,推断出 1对二硫键位于Cys9 Cys2 1,然后利... 虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ是从虎纹捕鸟蛛毒液中分离得到的一种昆虫毒素 .它含有 35个氨基酸残基 ,其中 6个半胱氨酸形成三对二硫键 .首先采用多酶将天然的肽链裂解后 ,通过MALDI TOF质谱分析酶解肽段 ,推断出 1对二硫键位于Cys9 Cys2 1,然后利用改进的部分还原分步测序法 ,确定虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的另外 2对二硫键的配对方式为Cys2 Cys16和Cys15 Cys2 8.因此 ,虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的 3对二硫键分别以Cys2 Cys16 ,Cys9 Cys2 1,Cys15 Cys2 8(即 1 4、 2 5和 3 6 )的方式配对 . 展开更多

关键词 虎纹捕鸟蛛毒素V 二硫键定位 三羧甲基磷酸(TCEP)

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虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ天然突变体的分离纯化与鉴定 被引量：1

5

作者 何小珍 胡卫军 +2 位作者 曹税 王贤纯 梁宋平 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2005年第3期76-79,共4页

通过离子交换及反相HPLC,从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离得到一种虎纹毒素-Ⅰ天然突变体,MALDI-TOF质谱仪分析表明该多肽天然突变体分子量为3 636 Da.Edman测序结合串联质谱和氨基酸组成分析鉴定出该天然突变体的序列为H2N-ACKGV FDACT PGKNE C... 通过离子交换及反相HPLC,从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离得到一种虎纹毒素-Ⅰ天然突变体,MALDI-TOF质谱仪分析表明该多肽天然突变体分子量为3 636 Da.Edman测序结合串联质谱和氨基酸组成分析鉴定出该天然突变体的序列为H2N-ACKGV FDACT PGKNE CCPNR VCSDK HKWCK WQ-COOH.其中6个Cys形成3对二硫键.小鼠脑室注射实验表明,该天然突变体能使小鼠致死,但不能阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉接头传递.本研究结果表明,K32残基对于HWTX-Ⅰ的生物学活性有关键性作用. 展开更多

关键词 天然突变体 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ 虎纹捕鸟蛛

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虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅴ去折叠过程的色谱分析 被引量：1

6

作者 张鹏飞 肖顺勇 梁宋平 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期390-393,共4页

将纯化的天然虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅴ经盐酸胍变性 30min后 ,在pH 3 0、反应温度为 37℃的条件下与三羧甲基磷酸 (TCEP)反应 12min ,用反相高效液相色谱分离得到其全部去折叠中间体 ,通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOFMS)进... 将纯化的天然虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅴ经盐酸胍变性 30min后 ,在pH 3 0、反应温度为 37℃的条件下与三羧甲基磷酸 (TCEP)反应 12min ,用反相高效液相色谱分离得到其全部去折叠中间体 ,通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOFMS)进行鉴定 ,并利用烷基化反应对这些去折叠中间体予以进一步确证。根据其保留时间 ,分析虎纹毒素 Ⅴ各去折叠中间体的色谱行为 ,初步探讨了多肽或蛋白质构象异构体反相色谱行为的多样性。 展开更多

关键词 反相高效液相色谱 基体辅助激光解吸电离-飞行时间质谱 三羧甲基磷酸 去折叠 虎纹捕鸟蛛毒素-V

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化学合成虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅱ基因的克隆

7

作者 徐辉明 陈嘉勤 +1 位作者 梁宋平 李敏 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 2000年第1期61-64,共4页

报道了全化学合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅱ (HWTX Ⅱ )基因 ,在克隆载体pBluescript中的克隆 .但HWTX Ⅱ基因在表达载体pGEX KT中几乎无表达 .根据以前成功地表达全化学合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )基因的实验结果 ,对在同一表达系统所... 报道了全化学合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅱ (HWTX Ⅱ )基因 ,在克隆载体pBluescript中的克隆 .但HWTX Ⅱ基因在表达载体pGEX KT中几乎无表达 .根据以前成功地表达全化学合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )基因的实验结果 ,对在同一表达系统所构建的HWTX Ⅰ与HWTX Ⅱ基因的表达产物进行比较 ,认为HWTX Ⅰ与HWTX Ⅱ在原核表达系统的表达行为上的差异有助于我们进一步探讨HWTX 展开更多

关键词 蜘蛛 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅱ基因 化学合成 克隆

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重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ用pMAL-p2X载体的表达和纯化 被引量：4

8

作者 刘君梁 刁建波 +2 位作者 唐建洲 谢锦云 梁宋平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期39-44,共6页

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ基因通过PCR扩增 ,插入pMAL p2X载体 ,基因 5′端插入凝血酶切割位点 .在大肠杆菌中经IPTG诱导高效分泌表达 .表达产物N端含麦芽糖结合蛋白 ,融合蛋白被分泌到大肠杆菌的胞间质 .经冷渗透休克后 ,透析脱盐 ,用凝血酶切... 虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ基因通过PCR扩增 ,插入pMAL p2X载体 ,基因 5′端插入凝血酶切割位点 .在大肠杆菌中经IPTG诱导高效分泌表达 .表达产物N端含麦芽糖结合蛋白 ,融合蛋白被分泌到大肠杆菌的胞间质 .经冷渗透休克后 ,透析脱盐 ,用凝血酶切割融合蛋白 ,再经SuperdexTM75分子筛柱层析、高效液相色谱反相C18柱纯化 ,得到重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ .质谱分析表明 ,rHWTX Ⅺ系正确表达产物 ,重组HWTX Ⅺ表现出与天然HWTX Ⅺ一致的生物学活性 . 展开更多

关键词 虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ pMAL—p2X 凝血酶 胰蛋白酶抑制剂

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重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ用pET_(31)b载体的表达和纯化 被引量：2

9

作者 刁建波 刘君梁 梁宋平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期195-200,共6页

化学全合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )基因在大肠杆菌中被表达 ,采用pET31b载体 ,表达产物N端为大肠杆菌酮基立体异构酶的融合蛋白 ,经亲和连续 6个组氨酸的亲和柱层析后 ,溴化氰切割融合蛋白 ,再经高效液相色谱反相柱纯化 ,得到了... 化学全合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )基因在大肠杆菌中被表达 ,采用pET31b载体 ,表达产物N端为大肠杆菌酮基立体异构酶的融合蛋白 ,经亲和连续 6个组氨酸的亲和柱层析后 ,溴化氰切割融合蛋白 ,再经高效液相色谱反相柱纯化 ,得到了重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ .质谱分析及N端测序表明 ,rHWTX Ⅰ系正确表达产物 .还原复性的rHWTX Ⅰ表现出与天然HWTX 展开更多

关键词 虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ 基因工程 基因克隆 基因表达 融合蛋白 纯化 pET31b载体 生物学活性

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ω-芋螺毒素MVIIA/虎纹捕鸟蛛毒素-I嵌合体HM-1227的合成及活性测定 被引量：1

10

作者 汤辉 王贤纯 梁宋平 《湖南师范大学自然科学学报》 EI CAS 北大核心 2002年第3期68-71,共4页

用Fmoc固相多肽合成的方法手工合成了一种ω 芋螺毒素MVIIA和虎纹捕鸟蛛毒素 I的嵌合体HM 1 2 2 7,经过RP HPLC纯化和氧化复性 ,小鼠隔神经 隔肌标本的阻断实验显示此嵌合体能实现二硫键完全配对与稳定折叠并具有微弱的神经毒活性 .实... 用Fmoc固相多肽合成的方法手工合成了一种ω 芋螺毒素MVIIA和虎纹捕鸟蛛毒素 I的嵌合体HM 1 2 2 7,经过RP HPLC纯化和氧化复性 ,小鼠隔神经 隔肌标本的阻断实验显示此嵌合体能实现二硫键完全配对与稳定折叠并具有微弱的神经毒活性 .实验结果表明 ,ω CtxMVIIA和HWTX I的分子框架稳定 ,部分序列交换后仍能实现二硫键配对与折叠 。 展开更多

关键词 HM-1227 活性测定 ω-芋螺毒素MVIIA 虎纹捕鸟蛛毒素-I 嵌合体 固相多肽合成 多肽类神经毒素 蛋白质工程

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虎纹捕鸟蛛毒素IV突变体K27A-HWTX-IV的合成和复性及其生物学活性研究 被引量：1

11

作者 陈再冉 王贤纯 梁宋平 《湖南师范大学自然科学学报》 EI CAS 北大核心 2003年第3期67-72,共6页

用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成的方法在固相多肽合成仪上合成了用丙氨酸代替虎纹捕鸟蛛毒素 IV的第27位的赖氨酸的突变体K27A HWTX IV,通过反相HPLC对不同条件下突变体的氧化复性结果进行监测,摸索出其最佳氧化复性条件为:0.1mol LTri... 用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成的方法在固相多肽合成仪上合成了用丙氨酸代替虎纹捕鸟蛛毒素 IV的第27位的赖氨酸的突变体K27A HWTX IV,通过反相HPLC对不同条件下突变体的氧化复性结果进行监测,摸索出其最佳氧化复性条件为:0.1mol LTris HCl,pH8.0,GSH1mmol LGSSG0.1mmol L的复性缓冲液,样品浓度为0.1mg mL.复性产物经HPLC纯化并用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法进行鉴定,相对分子质量为4050.63Da.生物学活性实验小鼠离体膈神经 膈肌标本测活实验表明:10μg mL天然HWTX IV阻断小鼠离体膈神经 膈肌接头传递时间为16min,10μg mL复性后的突变体阻断小鼠离体膈神经 膈肌接头传递时间为120min,残基的替换导致突变体生物学活性比天然毒素少,证明了第27位的赖氨酸为虎纹捕鸟蛛毒素 IV活性相关的残基. 展开更多

关键词 虎纹捕鸟蛛毒素—Ⅳ 突变体 K27A—HWTX-Ⅳ 固相多肽合成法 氧化复性 生物学活性 肽类毒素

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虎纹捕鸟蛛毒素HWTX-Ⅰ和芋螺毒素MVIIA嵌合体的固相化学合成

12

作者 喻志强 王贤纯 梁宋平 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2002年第2期65-69,共5页

采用Fmoc固相合成的方法 ,将来自芋螺的ω 芋螺毒素 (ω Conotoxin)MVIIA (N 型钙离子通道阻断剂 )中已知活性位点及可能的相关序列嵌入虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )的非活性位点区 ,代替其相应序列 ,构建同时携带两种活性位点的多肽... 采用Fmoc固相合成的方法 ,将来自芋螺的ω 芋螺毒素 (ω Conotoxin)MVIIA (N 型钙离子通道阻断剂 )中已知活性位点及可能的相关序列嵌入虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )的非活性位点区 ,代替其相应序列 ,构建同时携带两种活性位点的多肽嵌合体 .嵌合体用MALDI TOF质谱鉴定 .通过RP HPLC检测其氧化复性过程 ,摸索出嵌合体的最佳复性条件 .经过两次RP HPLC脱盐纯化 .结果表明 ,设计合成的嵌合体在 1× 10 5g/mL ,利用小鼠隔神经 隔肌标本的阻断实验证明嵌合体显示了 2 7%的天然HWTX Ⅰ的神经毒活性 .实验结果表明 ,HWTX 展开更多

关键词 HWTX-I 固相化学合成 多肽嵌合体 虎纹捕鸟蛛毒素-I ω-芋螺毒素 MVIIA 蛋白质工程 N-型 钙离子通道阻断剂

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虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ cDNA克隆及序列

13

作者 李敏 周政 梁宋平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期51-55,共5页

从中国珍稀毒蛛种虎纹捕鸟蛛 (Selenocosmia huwena)毒腺中分离纯化的虎纹捕鸟蛛毒素 - (Huwentoxin ,HWTX- ) ,其一级结构、二级结构和溶液构象均已阐明 ,生理功能实验已证实 HWTX- 是一种作用于突触前膜的神经毒素和高阈值钙通道抑... 从中国珍稀毒蛛种虎纹捕鸟蛛 (Selenocosmia huwena)毒腺中分离纯化的虎纹捕鸟蛛毒素 - (Huwentoxin ,HWTX- ) ,其一级结构、二级结构和溶液构象均已阐明 ,生理功能实验已证实 HWTX- 是一种作用于突触前膜的神经毒素和高阈值钙通道抑制剂 .为深入开展对 HWTX- 的应用研究 ,根据 HWTX- 多肽氨基酸序列 ,设计其 N-端、C-端和中间段 3组简并引物 (引物 、引物 和引物 ) .从虎纹捕鸟蛛毒腺提取制备 m RNA,逆转录合成 c DNA.以引物 和引物 为引物 ,采用 PCR方法对虎纹捕鸟蛛毒腺总 c DNA进行简并引物扩增 ,得到两条相对特异性的 DNA片段 ,产物直接与 PCR克隆载体 p UC- T连接 .重组子经原引物再次 PCR扩增和同位素标记引物 进行 Southern分子杂交鉴定 .对 4个重组子测序结果表明 ,有 1个重组子所对应的氨基酸顺序与 HWTX- 一致 ,Gen Bank数据检索说明 HWTX- c DNA编码序列确实是一个从未报道的序列 .本研究结果为 HWTX- 在真核细胞表达 ,大量获取蜘蛛毒素组分奠定了基础 . 展开更多

关键词 蜘蛛 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ CDNA序列 克隆

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两种虎纹捕鸟蛛昆虫毒素的分离纯化及生物学活性鉴定 被引量：5

14

作者 戴捷 梁宋平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期488-492,共5页

结合离子交换和反相高效液相色谱从虎纹捕鸟蛛粗毒分离纯化到 2种虎纹捕鸟蛛毒素 ,命名为虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ和虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ .经质谱测定这 2种毒素的分子量分别为 3981 0 2和 4 171 12 .氨基酸序列分析发现 ,这 2种虎纹捕鸟蛛毒... 结合离子交换和反相高效液相色谱从虎纹捕鸟蛛粗毒分离纯化到 2种虎纹捕鸟蛛毒素 ,命名为虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ和虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ .经质谱测定这 2种毒素的分子量分别为 3981 0 2和 4 171 12 .氨基酸序列分析发现 ,这 2种虎纹捕鸟蛛毒素同源性非常高 ,只有 6个残基位点的不同 .虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ和虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ的生物学功能相似 ,都能对蝗虫起到麻痹作用 ;对小鼠的中枢神经作用高剂量能使小鼠产生致死 ,但低剂量虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ能使小鼠产生惊厥反应 ,而低剂量虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ不能使小鼠产生惊厥反应 ;这 2种毒素都能阻断小鼠离体膈神经膈肌的神经肌肉传递 ,且与虎纹捕鸟蛛毒素 展开更多

关键词 虎纹捕鸟蛛昆虫毒素 分离 纯化 生物学活性 氨基酸序列

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两种蜘蛛多肽毒素的电喷雾电离质谱法序列分析 被引量：2

15

作者 范春明 王贤纯 梁宋平 《质谱学报》 EI CAS CSCD 2005年第2期65-70,共6页

虎纹捕鸟蛛毒素-(HWTX-)和敬钊缨毛蛛毒素-(JZTX-)是两种蜘蛛多肽类神经毒素。它们的大部分氨基酸序列已由Edman降解法测出,但仍有部分序列由于某些原因未能确定。为了鉴定未知部分的序列,利用电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Qq-TO... 虎纹捕鸟蛛毒素-(HWTX-)和敬钊缨毛蛛毒素-(JZTX-)是两种蜘蛛多肽类神经毒素。它们的大部分氨基酸序列已由Edman降解法测出,但仍有部分序列由于某些原因未能确定。为了鉴定未知部分的序列,利用电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Qq-TOF-MS)对两种蜘蛛毒素的酶解产物进行分析,获得其酶解片段的一级(MS)和二级(MS/MS)图谱,在用软件和手工的方式对含有未知序列的肽段进行解析后,得到未知部分确切氨基酸序列。研究表明:利用质谱的从头测序(denovosequencing)方法获得HWTX-和JZTX-完整的氨基酸序列。该方法在蛋白质和多肽的结构分析和鉴定与传统方法相比具有高灵敏度和快速的优势,是对传统Edman化学降解法的一个很好的补充。 展开更多

关键词 多肽毒素 电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱(ESI—Qq—TOF—MS) 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅵ 敬钊缨毛蛛毒素-Ⅷ 从头测序

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