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SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平 被引量:8
1
作者 陈建 李敏伟 +2 位作者 张国兵 李菌 王临润 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期628-633,共6页
目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平。方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中R... 目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平。方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin的mRNA进行检测。结果:标准曲线呈良好的线性关系。标准品的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,说明基本无非特异性扩增。结论:所建SYBR荧光实时定量PCR方法操作简便,费用低,特异性好,准确度、灵敏度高,为后续研究构建了理想的平台。 展开更多
关键词 SYBR 荧光实时定量 PCR检测 非小细胞 肺癌组织 外周血 RRM1 ERCC1 BRCA1基因 表达水平 Detection quantitative real-time peripheral blood lung cancer cell gene expression 特异性扩增 管家基因 标准曲线
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荧光实时定量PCR技术及其在水产养殖研究中的应用 被引量:9
2
作者 任伟成 王崇明 李赟 《海洋水产研究》 CSCD 北大核心 2007年第6期97-103,共7页
荧光实时定量PCR技术是近年来快速发展起来的一门新技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)和PCR技术的有机结合。与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化... 荧光实时定量PCR技术是近年来快速发展起来的一门新技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)和PCR技术的有机结合。与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能较准确定量等特点。本文综述了荧光实时定量PCR技术的基本原理及几种广泛应用的荧光化学方法,并概述了荧光实时定量PCR技术在水产养殖研究领域的应用现状,并对荧光实时定量PCR技术的应用前景进行了展望。 展开更多
关键词 荧光实时定量PCR 水产养殖
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荧光实时定量PCR检测前列腺癌抗原3评分方法的建立 被引量:1
3
作者 罗冰 王卫萍 +1 位作者 刘明杰 王艾丽 《医学研究生学报》 CAS 2011年第6期569-572,共4页
目的前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3)基因表达具有前列腺癌特异性,文中建立荧光实时定量PCR(FQ-RT-PCR)检测PCA3评分的方法。方法分别以LNCap和PC-3细胞株为阳性和阴性对照,用TaqMan探针建立检测PCA3和前列腺特异性抗原(... 目的前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3)基因表达具有前列腺癌特异性,文中建立荧光实时定量PCR(FQ-RT-PCR)检测PCA3评分的方法。方法分别以LNCap和PC-3细胞株为阳性和阴性对照,用TaqMan探针建立检测PCA3和前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)mRNA的荧光实时定量PCR方法,评价特异性、重复性和计算扩增效率,建立PCA3评分计算公式。结果检测PCA3和PSA mRNA的批内变异系数分别为1.19%、1.09%、0.84%和0.06%、0.71%、0.79%,批间变异系数分别为1.03%和0.56%;扩增效率分别为0.98和1.00;以2-ΔCt表示PCA3评分。结论荧光实时定量PCR检测PCA3评分方法的特异性好,重复性高。 展开更多
关键词 前列腺癌抗原3 前列腺特异性抗原 前列腺癌 荧光实时定量PCR
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一种牛肉检测的荧光实时定量方法研究 被引量:1
4
作者 马建荣 余永红 +4 位作者 何远财 张雅慧 谭杰峰 崔水龙 许锦涛 《安徽农业科学》 CAS 2022年第3期198-200,共3页
[目的]开发一种用于牛源性成分检测的荧光实时定量检测方法。[方法]通过序列比对后,以牛源性线粒体DNA中cytb基因为模板,设计特异性的引物和探针,并以不同来源的DNA为模板,分析引物和探针的特异性。对牛源性DNA进行梯度稀释后,分析不同... [目的]开发一种用于牛源性成分检测的荧光实时定量检测方法。[方法]通过序列比对后,以牛源性线粒体DNA中cytb基因为模板,设计特异性的引物和探针,并以不同来源的DNA为模板,分析引物和探针的特异性。对牛源性DNA进行梯度稀释后,分析不同浓度下扩增曲线,分析检测方法的灵敏度。以牛源性DNA稀释液为模板,进行10个平行扩增试验,分析检测方法的精密度。[结果]该研究所用的引物和探针对牛源性DNA具有明显的扩增曲线,而对非牛源性(鸡、鸭、猪、人)DNA模板不进行扩增。灵敏度分析结果显示,该检测方法对浓度仅为24.4 pg/μL牛源性DNA模板仍进行阳性扩增。精密度分析显示,10个平行试验扩增曲线相似,Ct值的标准差(SD)仅为0.41,精密度(CV)也仅为1.6%。[结论]该研究开发的牛肉成分检测的荧光实时定量方法特异性高,仅对牛源性DNA发生扩增。同时该方法灵敏度也很好,检出限为24.4 pg/μL,精密度也很高,重复性良好,适用于市场上肉制品中牛源性成分的检测。 展开更多
关键词 牛源性成分 荧光实时定量方法 引物特异性 灵敏度 精密度
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荧光实时定量PCR研究GA负调控因子基因在棉花纤维不同发育时期的表达模式 被引量:1
5
作者 易小平 谢翔 廖文彬 《热带农业科学》 2017年第10期36-40,共5页
棉花纤维发育经历起始期、延伸期、次级细胞壁加厚期、脱水期共4个发育时期。为了了解GA负调控因子基因在整个纤维发育时期的调节作用,采用敏感的实时定量PCR对GA负调控因子基因Gh RGL在棉花纤维不同发育时期中的转录水平进行了定量研究... 棉花纤维发育经历起始期、延伸期、次级细胞壁加厚期、脱水期共4个发育时期。为了了解GA负调控因子基因在整个纤维发育时期的调节作用,采用敏感的实时定量PCR对GA负调控因子基因Gh RGL在棉花纤维不同发育时期中的转录水平进行了定量研究,通过提取来源于不同纤维发育阶段[包括-3~0 DPA(开花后)胚珠,3 DPA胚珠,5 DPA胚珠,10 DPA胚珠,15 DPA纤维,25 DPA纤维]的样品总RNA,探讨不同发育时期Gh RGL基因的表达模式。结果显示,Gh RGL基因在所有被选的样品中都有表达,其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中转录水平较高,在10 DPA胚珠中表达水平最高,在-3~0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纤维、25 DPA纤维中的表达水平较低,表明Gh RGL基因在纤维伸长期表达水平较高,暗示Gh RGL可能对纤维伸长起着重要作用。 展开更多
关键词 荧光实时定量PCR 棉花纤维发育 GA负调控因子基因 表达模式
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荧光实时定量RT-PCR检测DD3mRNA方法的建立 被引量:3
6
作者 毛晓露 陶志华 +6 位作者 陈晓东 陈占国 林晓梅 王瑜敏 朱燕英 温秀姝 余凯远 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期335-337,共3页
目的建立荧光实时定量RT—PCR(FQ—RT—PCR)检测前列腺癌(PCa)特异基因DD3mRNA的方法。方法在DD3基因的外显子1和3之间设计一对引物和一条TaqMan—MGB探针,优化反应体系,建立DD3mRNA的FQ—RT—PCR方法,并进行方法学评价。将PCR... 目的建立荧光实时定量RT—PCR(FQ—RT—PCR)检测前列腺癌(PCa)特异基因DD3mRNA的方法。方法在DD3基因的外显子1和3之间设计一对引物和一条TaqMan—MGB探针,优化反应体系,建立DD3mRNA的FQ—RT—PCR方法,并进行方法学评价。将PCR扩增产物经凝胶电泳纯化后与pBluescript Ⅱ SK载体连接,再将重组质粒转化感受态细胞进行克隆;提取重组质粒在紫外分光光度计上定量,作为定量检测的标准品。结果重组质粒经PCR扩增及序列测定,表明pBluescriptⅡSK—DD3cDNA克隆成功。PCR扩增产物经测序分析证实为DD3 mRNA特异性片段。本法灵敏度为6拷贝/反应,线性范围为6~6×10^8拷贝/反应,相关系数为0.9985,批内、批间变异系数分别为1.0%~2.0%和1、3%~6、6%。结论成功建立了FQ—RT—PCR检测DD3mRNA的方法。为DD3 mRNA作为前列腺癌的诊断指标提供了方法学依据,也为其他肿瘤基因的检测提供了方法学启示。 展开更多
关键词 DD3基因 MRNA 实时荧光定量RT—PCR 前列腺癌
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基于SYBR GreenⅡ的BVDV NS3基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
7
作者 李阳 张世勋 +4 位作者 赫鸣睿 刘珊珊 岳山 刘宇 朱战波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2025年第2期23-31,共9页
为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显... 为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显示,筛选出1对特异性好的引物,CFX96和猪警-2000 qRT-PCR的标准品最小检出值分别为1×10^(1)copies·μL^(-1)和1×10^(2) copies·μL^(-1),特异性和重复性均良好,且临床血清样本的检测结果准确、一致。研究为BVDV检测提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 NS3基因 实时荧光定量PCR SYBR GreenⅡ
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实时荧光定量PCR法在结核分枝杆菌耐药性分析中的应用价值
8
作者 吕萌萌 姜瑜 +1 位作者 孔庆飞 可春梅 《天津药学》 2025年第4期492-495,共4页
目的探讨实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在结核分枝杆菌耐药性分析中的应用价值。方法选取2024年1至12月郑州市第六人民医院收治的115例结核病患者为研究对象,均开展实时荧光定量PCR法检测,并以罗氏药敏比例法为金标准,分析实时荧... 目的探讨实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在结核分枝杆菌耐药性分析中的应用价值。方法选取2024年1至12月郑州市第六人民医院收治的115例结核病患者为研究对象,均开展实时荧光定量PCR法检测,并以罗氏药敏比例法为金标准,分析实时荧光定量PCR法对常规抗菌药物耐药性检测情况及诊断效能;采用kappa检验验证实时荧光定量PCR法检测与金标准的一致性。结果115例结核病患者开展耐药性检测,其中金标准检出利福平耐药45例、敏感70例,异烟肼耐药50例、敏感65例,链霉素耐药38例、敏感77例,乙胺丁醇耐药32例、敏感83例,氟喹诺酮耐药22例、敏感93例;实时荧光定量PCR法检出利福平耐药44例、敏感71例,异烟肼耐药49例、敏感66例,链霉素耐药37例、敏感78例,乙胺丁醇耐药30例、敏感85例,氟喹诺酮耐药20例、敏感95例。实时荧光定量PCR法检测利福平的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值分别为95.56%、98.57%、97.39%、97.73%、97.18%;检测异烟肼的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值分别为94.00%、96.92%、95.65%、95.92%、95.45%;检测链霉素的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值分别为94.74%、98.70%、97.39%、97.30%、97.44%;检测乙胺丁醇的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值分别为84.38%、96.39%、93.04%、90.00%、94.12%;检测氟喹诺酮的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值分别为81.82%、97.85%、94.78%、90.00%、95.79%;kappa检验显示,实时荧光定量PCR法检测利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氟喹诺酮与金标准kappa值分别为0.945、0.911、0.941、0.823、0.825,均具有较高的一致性。结论实时荧光定量PCR法在结核分枝杆菌耐药性分析中具有较高应用价值,且操作简便、出结果快,适用于早期检测工作,辅助临床制定治疗方案。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 耐药性检测 实时荧光定量PCR法 罗氏药敏比例法 诊断价值
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唇形后口虫SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用
9
作者 郝文悦 王锦锦 +9 位作者 葛建龙 李彬 王印庚 廖梅杰 荣小军 赵宏晶 江敏棋 赵文广 牛立成 潘娇 《渔业科学进展》 北大核心 2025年第3期183-193,共11页
后口虫病是近年来影响刺参(Apostichopus japonicus)养殖效益的重要病害种类之一。唇形后口虫(Boveria labialis)是刺参后口虫病的病原。由于缺乏针对该物种的快速、准确的检测方法,研究人员难以系统解析该病原体的传播途径。本研究以... 后口虫病是近年来影响刺参(Apostichopus japonicus)养殖效益的重要病害种类之一。唇形后口虫(Boveria labialis)是刺参后口虫病的病原。由于缺乏针对该物种的快速、准确的检测方法,研究人员难以系统解析该病原体的传播途径。本研究以测序获得的唇形后口虫部分线粒体基因组序列为基础,根据nad10基因序列设计唇形后口虫引物,建立其SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并对刺参不同养殖区和不同养殖模式下养殖系统中唇形后口虫载量进行检测分析。结果显示,设计的唇形后口虫引物在质粒标准品4.05×10^(1)~4.05×10^(9) copies/μL范围内建立的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数R^(2)=0.997,熔解曲线呈现单一峰,无引物二聚体或非特异性扩增;灵敏度实验最低检测限为40.5 copies/μL;所设计的引物仅对唇形后口虫出现特异性扩增,对海洋尾丝虫(Uronema marinum)、贪食纤口虫(Chaenea vorax)、僧帽肾形虫(Colpoda cucullus)和多小核草履虫(Paramecium multi-micronuleatum)无交叉反应;重复性实验中各浓度的批内和批间Ct值均一性较高,批内实验变异系数(CV)值为0.32%~0.82%,批间实验CV值为0.40%~0.88%,稳定性较好。利用本方法对4种刺参养殖模式不同养殖区的环境样品和饲料进行检测,结合镜检结果对比分析发现,海水中唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈中度正相关(R=0.563),底泥、附着物样品中的唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈高度正相关(R=0.931)。推测,鲜海泥是唇形后口虫传播的重要载体之一。本研究结果可为唇形后口虫的快速检测、传播途径解析和防控提供参考。 展开更多
关键词 刺参 寄生性疾病 唇形后口虫 实时荧光定量PCR检测 传播途径
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辣椒种子炭疽菌和疫霉菌实时荧光定量检测技术建立及应用
10
作者 兰嘉仪 谢芳玲 +7 位作者 李诗 杨廷 张正 袁思怡 吴婷 朱宏建 刘峰 戴雄泽 《中国蔬菜》 北大核心 2025年第3期55-65,共11页
疫病和炭疽病是辣椒生产上的主要病害,不仅降低产量,还会影响辣椒的外观品质,种子带菌是辣椒生产中病害发生的原因之一。从山西、海南、安徽辣椒杂交种子生产基地发生疫病和炭疽病的辣椒果实和植株上分离到菌株SX22、SX26、SX45,通过病... 疫病和炭疽病是辣椒生产上的主要病害,不仅降低产量,还会影响辣椒的外观品质,种子带菌是辣椒生产中病害发生的原因之一。从山西、海南、安徽辣椒杂交种子生产基地发生疫病和炭疽病的辣椒果实和植株上分离到菌株SX22、SX26、SX45,通过病原菌形态学鉴定和分子生物学鉴定,确定为疫霉菌(Phytophthora capsici)、平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)、斯高威尔炭疽菌(Colletotrichum scovillei)。针对疫霉菌、平头炭疽菌分别设计了特异性引物PC-F/PC-R和ITS1/CT-R,针对斯高威尔炭疽菌筛选了特异性引物CS-F/CS-R,建立了辣椒种子平头炭疽菌、斯高威尔炭疽菌和疫霉菌实时荧光定量PCR检测体系。2023年对山西、海南、安徽3个生产基地的辣椒杂交种子70份样品进行了检测,疫霉菌和斯高威尔炭疽菌种子带菌率分别为70.0%和72.9%。该体系为种子质检和辣椒病害的早期预防提供了重要技术支持。 展开更多
关键词 种子带菌 辣椒 实时荧光定量PCR 病原鉴定
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实时荧光定量PCR法检测左旋多巴中大肠埃希菌宿主细胞DNA残留量
11
作者 许冰瑜 刘妍 +2 位作者 郭心瑶 严方 孙桂斌 《中国药科大学学报》 北大核心 2025年第2期176-182,共7页
采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引... 采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引物,通过PCR进行特异性扩增获得目的片段。将目的片段重组至pLENTI-BSD-CON载体构建重组质粒命名为pLENTI-BSD-CON-E.coli-16S,以其为标准品,结合磁珠法提取纯化DNA,建立定量PCR检测方法(SYBR-Green法)。对建立的方法进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限及耐用性的方法学验证,应用于左旋多巴原料药的检测,并与试剂盒检测方法(Taqman探针法)进行比较。建立的定量PCR检测方法(SYBR-Green法)正向引物序列:5'-TTCGATGCAACGCGAAGAAC-3';反向引物序列:5'-GTGTAGCCCTGGTCGTAAGG-3'。以重组质粒作为标准品,DNA质量浓度在10fg/μL~3 ng/μL范围内线性关系良好(R^(2)≥0.98),定量限为10 fg/μL,加标溶液回收率在59.7%~80.7%范围内,RSD均小于30%。应用该法对3批左旋多巴原料药进行检测,DNA残留量均在限度以下。结果表明,建立的检测方法可用于定量检测左旋多巴等由大肠埃希菌作为宿主细胞生产的生物制品的DNA残留量,并且其灵敏度优于试剂盒检测方法。 展开更多
关键词 大肠埃希菌 左旋多巴 构建质粒 实时荧光定量PCR 外源性DNA残留 帕金森病
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基于LNA-TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术的天山雪莲掺伪研究
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作者 王多梅 杨建波 +6 位作者 杨乐 于新兰 李海芳 胡冲 陈灵丽 蒲婧哲 张亚中 《中国现代中药》 2025年第2期202-209,共8页
目的:采用锁核酸(LNA)-TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术建立一种高效、快速鉴定天山雪莲中掺伪水母雪兔子、绵头雪兔子的方法。方法:基于LNA-TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,利用天山雪莲及其常见易混伪品水母雪兔子、绵头... 目的:采用锁核酸(LNA)-TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术建立一种高效、快速鉴定天山雪莲中掺伪水母雪兔子、绵头雪兔子的方法。方法:基于LNA-TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,利用天山雪莲及其常见易混伪品水母雪兔子、绵头雪兔子的叶绿体基因组序列差异,根据伪品水母雪兔子、绵头雪兔子与天山雪莲的特异性差异位点设计筛选探针引物,并对引物及LNA-TaqMan探针的特异性进行验证,根据扩增曲线临界循环数(C)t值的差值计算掺伪比例。结果:基于LNA-TaqMan探针检测方法,通过出现特异性扩增曲线判定检测出水母雪兔子和绵头雪兔子,根据扩增曲线Ct值的差值能有效确定掺伪比例,且在掺伪1%时仍可稳定检出。结论:该方法用于天山雪莲中掺伪水母雪兔子和绵头雪兔子检测灵敏度高、特异性强,可有效解决天山雪莲混伪品难以鉴别的问题,为天山雪莲药材质量控制提供技术支持。 展开更多
关键词 天山雪莲 水母雪兔子 绵头雪兔子 锁核酸-TaqMan探针 实时荧光定量聚合酶链式反应 掺伪
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实时荧光定量PCR快速检测药品中大肠埃希菌
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作者 李杰 张华 +3 位作者 林鹏 王家芳 肖艳霞 钱云开 《食品与药品》 2025年第2期126-131,共6页
目的 建立一种药品中大肠埃希菌的实时荧光定量PCR快速检测方法。方法 根据大肠埃希菌malB基因序列,设计通用引物和探针,优化扩增反应体系,进行实时荧光定量PCR扩增,当出现C_t值时,说明供试品中检出大肠埃希菌。结果 大肠埃希菌基因组DN... 目的 建立一种药品中大肠埃希菌的实时荧光定量PCR快速检测方法。方法 根据大肠埃希菌malB基因序列,设计通用引物和探针,优化扩增反应体系,进行实时荧光定量PCR扩增,当出现C_t值时,说明供试品中检出大肠埃希菌。结果 大肠埃希菌基因组DNA检测限可达10^(-3 )ng,药品中大肠埃希菌检测限达3 cfu/g(ml),仅需24 h即可完成检测,采用该方法检测20批药品,结果与药典方法一致。结论 方法检测特异性强、所需时间短、灵敏度高,可作为《中国药典》大肠埃希菌检查法的补充方法。 展开更多
关键词 中国药典 药品 大肠埃希菌 实时荧光定量PCR 检测
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实时荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌的研究
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作者 刘占生 张莉 王嫘 《中国食品工业》 2025年第5期97-99,共3页
目的:构建快速检测食品中沙门氏菌的实时荧光定量PCR法。方法:以沙门氏菌核酸DNA提取物为模板开展荧光检测实验,建立快速检测手段,用于阳性培养液及食品中沙门氏菌检测分析。结果:该方案能在30批食品样本中成功扩增出沙门氏菌特异性片段... 目的:构建快速检测食品中沙门氏菌的实时荧光定量PCR法。方法:以沙门氏菌核酸DNA提取物为模板开展荧光检测实验,建立快速检测手段,用于阳性培养液及食品中沙门氏菌检测分析。结果:该方案能在30批食品样本中成功扩增出沙门氏菌特异性片段,最低检出浓度15CFU/mL,检测时长<24h。结论:本研究提出的实时荧光定量PCR法具有高效、快速、灵敏、精准的特点,可广泛应用于食品中沙门氏菌的快速筛查与检测,为食品安全监控提供强有力的技术支持。 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR 沙门氏菌 快速检测
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姜荷花苞片实时荧光定量PCR内参基因筛选
15
作者 谭健俊 黄李珊 +2 位作者 周熠玮 徐晔春 叶远俊 《广东农业科学》 2025年第2期108-116,共9页
[目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S... [目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、泛素蛋白(UBQ)、苹果酸脱氢酶(MDH)、肌动蛋白(Actin)、微管蛋白(TUB)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)8个看家基因,使用ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper 4种分析方法评估基因表达的稳定性,通过RefFinder程序综合评价以筛选出姜荷花苞片组织的最佳内参基因。[结果]8个内参基因均扩增出单一主峰,引物标准曲线相关系数R^(2)≥0.98,扩增效率为99.5%~125.0%,PCR产物经1%琼脂糖电泳检测显示条带清晰单一,表明引物设计特异性好。4种不同的算法分析获得的结果排名有差异,其中MDH在ΔCt、geNorm和NormFinder分析中为表达最稳定的内参基因,18S rRNA在BestKeeper分析中为表达最稳定的内参基因。利用RefFinder程序综合评价得出候选内参基因稳定性综合排名,排序依次为MDH>Actin>TUB>18S rRNA>PP2A>GAPDH>UBQ>PAL,表明不同品种姜荷花苞片最佳内参基因是MDH,其次为Actin和TUB,PAL稳定性最差、不适合作为姜荷花苞片组织的内参基因。[结论]MDH可作为不同品种姜荷花苞片组织的稳定内参基因,为后续深入开展姜荷花苞片颜色合成相关基因的表达模式分析提供参考。 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR 姜荷花 内参基因 苞片颜色 MDH 基因表达模式
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调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌叠氮溴化丙锭-实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 宋帆 《现代食品》 2025年第7期209-214,共6页
为缩短检测周期,排除死菌DNA的干扰,采用实时荧光定量PCR对调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测。方法:采用叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)鉴别死活菌,检测目标菌中的特异性基因片段,构建利用PMA预处理结合实时荧光定量... 为缩短检测周期,排除死菌DNA的干扰,采用实时荧光定量PCR对调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测。方法:采用叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)鉴别死活菌,检测目标菌中的特异性基因片段,构建利用PMA预处理结合实时荧光定量PCR的特异性检测方案。结果:在PMA工作浓度为40μg·mL^(-1)、暗孵育时间为10 min、曝光时间为20 min的最佳方案下处理,可在不影响目标活菌正常扩增的同时抑制死菌的干扰。本方法快速准确,检验周期可缩短到48 h,在1.2×10^(3) CFU·mL^(-1)菌量下仍能有效检出目标菌。结论:本方法特异性强、灵敏度高,适用于突发事件中检测调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌。 展开更多
关键词 调理肉制品 小肠结肠炎耶尔森氏菌 叠氮溴化丙锭-实时荧光定量PCR
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马铃薯病毒病实时荧光定量PCR检测技术
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作者 杨茹薇 刘易 +2 位作者 古丽米拉·热合木土拉 孙慧 江应红 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期2484-2490,共7页
【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV... 【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)的检测引物,完成引物浓度及系统优化。【结果】建立3种马铃薯病毒病的实时荧光定量PCR检测技术体系(real-time fluorescent quantitative RT-PCR,RT-qPCR),其标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为99.42%以上,扩增效率均为84.48%以上,可快速、准确检测出3种马铃薯病毒。【结论】实时荧光定量PCR检测技术是一种高灵敏度、特异性强的检测方法,可实时监测马铃薯生产中病毒病的感染情况。 展开更多
关键词 马铃薯 病毒病 实时荧光定量PCR
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鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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作者 张玉霞 董雯雯 +2 位作者 袁小远 孟凯 徐怀英 《山东农业科学》 北大核心 2024年第6期128-132,共5页
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基... 鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 鸡喉气管炎病毒 TK基因 实时荧光定量PCR 特异性 敏感性 重复性
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低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价
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作者 林珲 裘波音 +1 位作者 朱海生 温庆放 《福建农业科技》 CAS 2024年第8期1-15,共15页
为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差... 为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。 展开更多
关键词 茄子 内参基因 实时荧光定量PCR 标准化 基因表达
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猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用 被引量:4
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作者 刘莹 李峰 +3 位作者 殷宗俊 王敬茹 李书光 郑先瑞 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期34-38,共5页
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方... 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 Taq Man探针 实时荧光定量PCR
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