目的分离体外培养的结核分枝杆菌分泌的膜囊泡，检测其形态和粒径分布，初步探索结核分枝杆菌膜囊泡对巨噬细胞中细胞因子释放的作用。方法采用结核分枝杆菌实验室标准菌株H37Rv，通过7H9培养基复苏、扩大培养标准株H37Rv至对数生长期...目的分离体外培养的结核分枝杆菌分泌的膜囊泡，检测其形态和粒径分布，初步探索结核分枝杆菌膜囊泡对巨噬细胞中细胞因子释放的作用。方法采用结核分枝杆菌实验室标准菌株H37Rv，通过7H9培养基复苏、扩大培养标准株H37Rv至对数生长期，菌体全部接种于苏通培养基中继续培养3周，离心取上清，超滤浓缩结合超速离心分离提取结核分枝杆菌H37Rv膜囊泡，通过透射电镜观察膜囊泡的大小、形态，采用纳米颗粒跟踪仪分析膜囊泡的粒径及分布。同时，设置不处理对照组、H37Rv感染组[按照感染复数（multiplicity of infection，MOI）=20：1]和H37Rv膜囊泡处理组（按照膜囊泡：细胞=100：1）处理佛波酯（50ng／ml）诱导贴壁的单核巨噬细胞（THP-1）4h，更换新鲜培养基后0h、4h、8h、24h收集细胞培养上清，采用Milliplex多细胞因子检测试剂盒检测细胞因子的释放情况，通过曼-惠特尼U（Mann-WhitneyU）检验对各时间点H37Rv膜囊泡处理组和不处理对照组之间肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素10（IL-10）释放量进行比较，以P〈0．05为差异有统计学意义。结果按照调整后的提取方法得到的提取物中可检测到H37Rv分泌的膜囊泡，平均粒径为137nm，主要分布在30～510nm之间，〈250nm的膜囊泡数量占总量的96．88％。4h、8h和24h的TNF-α、ID6和IL-1β释放量与不处理对照组[分别为348．19（333．99，360．47）pg／ml、412．38（406．67，418．79）pg／ml、324．44（316．11，331．14）pg／ml；3．01（2．81，3．02）pg／ml、5．40（5．26，5．83）pg／ml、13．22（11．80，13．77）pg／ml；118．92（113．97，122．47）pg／ml、132．33（125．87，137．62）pg／ml、169．31（167．75，172．49）pg／ml]相比，H37Rv膜囊泡处理组[分别为507．33（501．80，513．84）pg／ml、4483．00（4130．75，4522．50）pg／ml、8170．00（8058．25，8206．75）pg／ml；12．88（12．04，13．84）pg／ml、68．51（66．88，69．77）pg／ml、335．44（331．02，340．64）pg／ml；800．57（791．18，809．60）pg／ml、1559．00（1546．00，1566．00）pg／ml、4316．50（4094．75，4389．75）pg／ml]均明显增加，差异均有统计学意义（u值均〈0．001，P值均〈0．01）；但4h、8h和24h的ID-10释放量[不处理对照组分别为1．23（1．21，1．31）pg／ml、1.56（1．31，1．82）pg／ml、5．41（4．99，5．89）pg／ml；H37Rv膜囊泡处理组分别为4．56（4．49，4．82）pg／ml、1．43（1．28，1．89）pg／ml、1．56（1．48，1．68）pg／ml]差异均无统计学意义（U值分别为6．00、17.00、7．00，P值分别为0．065、0．898和0．087）。结论本研究建立了结核分枝杆菌膜囊泡分离提取的技术流程，可以得到纯度较好、形态完整、粒径正常的膜囊泡。同时，结核分枝杆菌膜囊泡可以诱发巨噬细胞中细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放。展开更多
无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis,CFPS)是一种在体外快速合成目标蛋白质的方法,通过构建含有CFPS系统的人造细胞,能够实现蛋白质的高通量表达和功能性膜蛋白的体外重构.本文详细综述了4种CFPS系统(包括大肠杆菌裂解液、...无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis,CFPS)是一种在体外快速合成目标蛋白质的方法,通过构建含有CFPS系统的人造细胞,能够实现蛋白质的高通量表达和功能性膜蛋白的体外重构.本文详细综述了4种CFPS系统(包括大肠杆菌裂解液、兔网织红细胞裂解液、小麦胚芽提取物、酵母提取物)的适用范围和优缺点,总结了基于CFPS系统构建的人造细胞体系内蛋白质合成的研究现状,以及该领域面临的挑战及未来的发展方向.展开更多
文摘目的分离体外培养的结核分枝杆菌分泌的膜囊泡，检测其形态和粒径分布，初步探索结核分枝杆菌膜囊泡对巨噬细胞中细胞因子释放的作用。方法采用结核分枝杆菌实验室标准菌株H37Rv，通过7H9培养基复苏、扩大培养标准株H37Rv至对数生长期，菌体全部接种于苏通培养基中继续培养3周，离心取上清，超滤浓缩结合超速离心分离提取结核分枝杆菌H37Rv膜囊泡，通过透射电镜观察膜囊泡的大小、形态，采用纳米颗粒跟踪仪分析膜囊泡的粒径及分布。同时，设置不处理对照组、H37Rv感染组[按照感染复数（multiplicity of infection，MOI）=20：1]和H37Rv膜囊泡处理组（按照膜囊泡：细胞=100：1）处理佛波酯（50ng／ml）诱导贴壁的单核巨噬细胞（THP-1）4h，更换新鲜培养基后0h、4h、8h、24h收集细胞培养上清，采用Milliplex多细胞因子检测试剂盒检测细胞因子的释放情况，通过曼-惠特尼U（Mann-WhitneyU）检验对各时间点H37Rv膜囊泡处理组和不处理对照组之间肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素10（IL-10）释放量进行比较，以P〈0．05为差异有统计学意义。结果按照调整后的提取方法得到的提取物中可检测到H37Rv分泌的膜囊泡，平均粒径为137nm，主要分布在30～510nm之间，〈250nm的膜囊泡数量占总量的96．88％。4h、8h和24h的TNF-α、ID6和IL-1β释放量与不处理对照组[分别为348．19（333．99，360．47）pg／ml、412．38（406．67，418．79）pg／ml、324．44（316．11，331．14）pg／ml；3．01（2．81，3．02）pg／ml、5．40（5．26，5．83）pg／ml、13．22（11．80，13．77）pg／ml；118．92（113．97，122．47）pg／ml、132．33（125．87，137．62）pg／ml、169．31（167．75，172．49）pg／ml]相比，H37Rv膜囊泡处理组[分别为507．33（501．80，513．84）pg／ml、4483．00（4130．75，4522．50）pg／ml、8170．00（8058．25，8206．75）pg／ml；12．88（12．04，13．84）pg／ml、68．51（66．88，69．77）pg／ml、335．44（331．02，340．64）pg／ml；800．57（791．18，809．60）pg／ml、1559．00（1546．00，1566．00）pg／ml、4316．50（4094．75，4389．75）pg／ml]均明显增加，差异均有统计学意义（u值均〈0．001，P值均〈0．01）；但4h、8h和24h的ID-10释放量[不处理对照组分别为1．23（1．21，1．31）pg／ml、1.56（1．31，1．82）pg／ml、5．41（4．99，5．89）pg／ml；H37Rv膜囊泡处理组分别为4．56（4．49，4．82）pg／ml、1．43（1．28，1．89）pg／ml、1．56（1．48，1．68）pg／ml]差异均无统计学意义（U值分别为6．00、17.00、7．00，P值分别为0．065、0．898和0．087）。结论本研究建立了结核分枝杆菌膜囊泡分离提取的技术流程，可以得到纯度较好、形态完整、粒径正常的膜囊泡。同时，结核分枝杆菌膜囊泡可以诱发巨噬细胞中细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放。
文摘无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis,CFPS)是一种在体外快速合成目标蛋白质的方法,通过构建含有CFPS系统的人造细胞,能够实现蛋白质的高通量表达和功能性膜蛋白的体外重构.本文详细综述了4种CFPS系统(包括大肠杆菌裂解液、兔网织红细胞裂解液、小麦胚芽提取物、酵母提取物)的适用范围和优缺点,总结了基于CFPS系统构建的人造细胞体系内蛋白质合成的研究现状,以及该领域面临的挑战及未来的发展方向.
