目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行...目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行荧光检测EGFP的表达,采用激光共聚焦显微镜观测器检测荧光特性。结果PCR和DNA测序证实pEGFP质粒结构正确;在倒置荧光显微镜下,转染24h后,部分Hela细胞可见绿色荧光,转染72h时,大约80%Hela细胞内均可见绿色荧光。加入含G418的选择性培养基进行选择性培养,选择荧光较强的Hela细胞经有限稀释,持续筛选及克隆化培养,获得稳定表达绿色荧光的Hela细胞克隆,扩大培养并传至10代以上,将此细胞株命名为Hela-EGFP。激光共聚焦显微镜观察发现:在蓝光(-395nm)激发时,Hela-EGFP细胞绿色荧光激发波长为395nm,最大发射峰为509nm。结论Hela-EGFP细胞株具备稳定表达EGFP的能力,为实时可视化进行宫颈癌侵袭转移机制的研究奠定了基础。展开更多
文摘目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行荧光检测EGFP的表达,采用激光共聚焦显微镜观测器检测荧光特性。结果PCR和DNA测序证实pEGFP质粒结构正确;在倒置荧光显微镜下,转染24h后,部分Hela细胞可见绿色荧光,转染72h时,大约80%Hela细胞内均可见绿色荧光。加入含G418的选择性培养基进行选择性培养,选择荧光较强的Hela细胞经有限稀释,持续筛选及克隆化培养,获得稳定表达绿色荧光的Hela细胞克隆,扩大培养并传至10代以上,将此细胞株命名为Hela-EGFP。激光共聚焦显微镜观察发现:在蓝光(-395nm)激发时,Hela-EGFP细胞绿色荧光激发波长为395nm,最大发射峰为509nm。结论Hela-EGFP细胞株具备稳定表达EGFP的能力,为实时可视化进行宫颈癌侵袭转移机制的研究奠定了基础。
