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建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记 被引量:5
1
作者 姚锦爱 张鸿 +2 位作者 黄鹏 陈峰 余德亿 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期70-75,共6页
【目的】开展建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白标记研究,直观观察尖孢镰刀菌在建兰植株上的侵染为害,明确病原菌的致病过程,为开展建兰茎腐病原菌的相关研究提供良好技术手段。【方法】采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖... 【目的】开展建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白标记研究,直观观察尖孢镰刀菌在建兰植株上的侵染为害,明确病原菌的致病过程,为开展建兰茎腐病原菌的相关研究提供良好技术手段。【方法】采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白(GFP)转化,并检测转化子的遗传稳定性。【结果】GFP基因可被成功导入到尖孢镰刀菌F-02中并获得表达,转化子在蓝色光源激发下,菌丝和分生孢子均能稳定散发绿色荧光;转化子10次继代培养后菌落生长良好,菌丝和分生孢子仍可稳定散发出绿色荧光,对寄主植物的致病力也未发生改变,【结论】GFP基因可在建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中稳定存在,并对其致病力没有影响。 展开更多
关键词 建兰 茎腐病 尖孢镰刀菌 绿色荧光蛋白 基因标记
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芒果尖孢炭疽病病原菌的绿色荧光蛋白基因标记 被引量:9
2
作者 张俊 吕延超 +3 位作者 刘晓妹 张欣 张贺 蒲金基 《热带作物学报》 CSCD 2011年第9期1708-1710,共3页
芒果炭疽病是世界性的主要病害之一,引起芒果炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌2种。通过溶壁酶酶解菌丝体成功制备尖孢炭疽菌原生质体,用抗潮霉素基因作为选择标记,采用PEG介导的原生质体转化法,用绿色荧光蛋白表达载体(pCT74-sG... 芒果炭疽病是世界性的主要病害之一,引起芒果炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌2种。通过溶壁酶酶解菌丝体成功制备尖孢炭疽菌原生质体,用抗潮霉素基因作为选择标记,采用PEG介导的原生质体转化法,用绿色荧光蛋白表达载体(pCT74-sGFP)转化原生质体,获得表达GFP尖孢炭疽菌的转化子菌株;转化子菌株在含潮霉素平板上经多次单孢纯化后,在无选择压下连续继代培养仍能发出稳定而强烈的绿色荧光,用GFP特异性引物PCR扩增转化子菌株基因组DNA获得预期大小片段,表明gfp基因已成功导入芒果炭疽病病原菌基因组中,且稳定遗传;GFP标记菌株生长正常,致病性和野生型菌株无明显差别,这为进一步研究该病菌在自然界的生物学及侵染方式奠定了基础。 展开更多
关键词 芒果炭疽病 尖孢炭疽菌 绿色荧光蛋白基因 转化
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苦瓜枯萎病原菌的绿色荧光蛋白基因标记 被引量:2
3
作者 陈燕萍 刘欣 +3 位作者 肖荣凤 朱育菁 林永胜 刘波 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期1228-1233,共6页
【目的】苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momodicae)侵染引起的一种重要土传病害。为有效防控该病害,对其病原菌进行绿色荧光蛋白基因(gfp)标记,为研究病原菌在苦瓜植株体内的侵染特性提供可视化跟踪检测... 【目的】苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momodicae)侵染引起的一种重要土传病害。为有效防控该病害,对其病原菌进行绿色荧光蛋白基因(gfp)标记,为研究病原菌在苦瓜植株体内的侵染特性提供可视化跟踪检测手段。【方法】采用农杆菌介导的遗传转化方法对苦瓜枯萎病原菌强致病性野生型菌株FJAT-3018进行绿色荧光蛋白基因(gfp)标记,通过对转化子的菌落形态观察、生长速率和致病性测定,筛选出遗传稳定的转化子。【结果】野生型菌株FJAT-3018的转化效率约为14.5个转化子/10^6个孢子。经10次继代培养,筛选获得的转化子在菌落形态、生长速率和致病性方面与野生型菌株FJAT-3018无明显差异,gfp基因在转化子的菌丝体和分生孢子中均能强表达;通过激光共聚焦显微镜扫描跟踪发现,转化子能够在苦瓜植株根部和茎部侵染与定殖。【结论】绿色荧光蛋白基因已成功转入到苦瓜野生型菌株FJAT-3018中,其转化子具有良好的遗传稳定性且致病力不受影响。 展开更多
关键词 苦瓜 枯萎病 绿色荧光蛋白 基因标记
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绿色荧光蛋白基因标记芒果畸形病病原菌研究 被引量:4
4
作者 吕延超 蒲金基 +5 位作者 谢艺贤 漆艳香 陆英 张欣 张贺 占魏 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期194-195,共2页
芒果畸形病是世界性的芒果重要病害。采用PEG介导的原生质体转化法用绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(pCT74-sGFP)转化芒果畸形病病原菌(Fusarium proliferatum),获得了表达GFP的转化子。转化子经过单孢纯化后连续继代培养仍能发出稳定而强... 芒果畸形病是世界性的芒果重要病害。采用PEG介导的原生质体转化法用绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(pCT74-sGFP)转化芒果畸形病病原菌(Fusarium proliferatum),获得了表达GFP的转化子。转化子经过单孢纯化后连续继代培养仍能发出稳定而强烈的荧光,通过GFP特异性引物PCR扩增转化子基因组获得预期片段,表明GFP基因已成功转入芒果畸形病病原菌基因组中且稳定遗传。GFP标记菌株生长正常,致病性和野生菌丝无差别。获得GFP标记的转化子,为应用发绿色荧光的芒果畸形病病原菌研究病原菌的侵染方式、扩展过程等奠定了基础。 展开更多
关键词 芒果畸形病 层出镰刀菌 绿色荧光蛋白基因 转化
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动物病原大肠杆菌K88的绿色荧光蛋白基因标记及其稳定性研究 被引量:6
5
作者 车建美 刘波 蓝江林 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期198-204,209,共8页
成功地将gfp/luxAB双标记基因整合到K88染色体上,得到绿色荧光蛋白基因标记的大肠杆菌K88∶gfp/lux,其菌体和菌落形态与原始菌株K88完全一致,引入的新质粒不影响菌株的基本形态。从含gfp基因的质粒DNA和K88∶gfp/lux基因组DNA上均可扩... 成功地将gfp/luxAB双标记基因整合到K88染色体上,得到绿色荧光蛋白基因标记的大肠杆菌K88∶gfp/lux,其菌体和菌落形态与原始菌株K88完全一致,引入的新质粒不影响菌株的基本形态。从含gfp基因的质粒DNA和K88∶gfp/lux基因组DNA上均可扩增出大小约700 bp的gfp基因片段。大肠杆菌特异性基因检测结果表明,从大肠杆菌K88和K88∶gfp/lux基因组DNA上均扩增出大小约260 bp的大肠杆菌特异性基因片段,说明gfp基因标记后的菌株均为大肠杆菌。在相同的培养条件下,K88∶gfp/lux和K88的生长曲线的变化趋势基本相同。通过检测肠毒性基因(estA)发现,从大肠杆菌K88和K88∶gfp/lux基因组DNA上均扩增出大小约158 bp的肠毒性基因片段,说明gfp基因标记后的菌株在肠毒性方面未发生变化。在无选择压力条件下将K88∶gfp/lux菌株每隔12 h连续转接10次后,所有菌落均保持着均匀并且强烈的绿色荧光,说明标记基因在K88∶gfp/lux中的表达稳定性很高。K88∶gfp/lux和K88在中性偏酸性的环境中生长较好,当初始pH值偏碱性时,生长较差。 展开更多
关键词 大肠杆菌K88 绿色荧光蛋白 gfp/luxAB基因
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绿色荧光蛋白标记基因在肿瘤研究中的应用 被引量:5
6
作者 于丽莉 陈诗书 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1999年第2期81-82,共2页
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)来源于海洋生物水母,近年来在生物化学和细胞生物学中成为最广泛应用的标记性蛋白质之一.GFP的cDNA约740bp,它编码238个氨基酸残基.在激发光下,GFP肽链内部第65~67位的丝氨酸-酪氨酸-甘氨... 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)来源于海洋生物水母,近年来在生物化学和细胞生物学中成为最广泛应用的标记性蛋白质之一.GFP的cDNA约740bp,它编码238个氨基酸残基.在激发光下,GFP肽链内部第65~67位的丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基团,有效地发射内部荧光且易于观察.这种特性使其具有吸引力而且有很大的应用价值.GFP的晶体结构分析提供了一种很好的机会去了解和使用蛋白质结构和光谱功能之间的关系.由于GFP的克隆基因能在异源组织中表达产生荧光,90年代初提出了GFP作为报告分子可用于生物学研究领域.GFP作为报告基因的特点和优势:①野生型GFP在395nm波长处可吸收一个激发光,在510nm发射一个绿色荧光,只要有足够的表达,在长紫外波长或蓝光照射下,无需引入别的物质,在活体内通过显微镜就能清晰地观察到.而其它一些报告基因如氯霉素乙酰转移酶Ⅱ(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、荧光素酶(Luc) 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 基因 标记 肿瘤转移 肿瘤发生
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hilA基因两端51bp序列对示踪标记性绿色荧光蛋白在禽肠炎沙门氏菌中倍增表达效率的鉴定 被引量:2
7
作者 王高玲 李涛 +3 位作者 史冰田 司微 王斌 刘恒贵 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期409-413,共5页
为构建表达绿色荧光蛋白(GFP)作为示踪标记的重组禽肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)并鉴定其遗传稳定性,本研究通过重叠延伸PCR构建5'端含有T7启动子和核糖体结合位点(RBS),3'端含有T7终止子序列的增强型GFP(e GFP)表达盒,并将e GF... 为构建表达绿色荧光蛋白(GFP)作为示踪标记的重组禽肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)并鉴定其遗传稳定性,本研究通过重叠延伸PCR构建5'端含有T7启动子和核糖体结合位点(RBS),3'端含有T7终止子序列的增强型GFP(e GFP)表达盒,并将e GFP表达盒插入p MD18-T载体中构建p MD-e GFP原核表达重组质粒,将其转化于S.enteritidis。结果显示e GFP能够在S.enteritidis中持续表达。进一步将S.enteritidis hil A基因两端的51 bp序列分别添加到p MD-e GFP中e GFP表达盒的两端,构建p MD-He GFP重组质粒。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析与p MD-e GFP相比,p MD-He GFP转化S.enteritidis后,其e GFP的荧光强度提高约30倍。通过在无抗生素选择压力下连续传20代次,重组S.enteritidis中e GFP仍然能够稳定表达。本研究结果为进一步研究S.enteritidis在动物体内的分布和定植规律等提供了一种具有荧光示踪标记的目标菌,并为其他细菌的同类研究提供了借鉴。 展开更多
关键词 肠炎沙门氏菌 绿色荧光蛋白 荧光标记 hilA基因
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转绿色荧光蛋白标记基因猪整合检测的研究
8
作者 华文君 乔宪凤 +3 位作者 郑新民 王亚刚 李莉 肖红卫 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第25期10796-10797,共2页
[目的]为转基因猪生产的整合效率、外源目的基因表达水平、目的基因在猪体内组织特异性表达分布等相关领域的进一步研究奠定基础。[方法]用显微注射法将GFP标记的转基因猪表达载体PM1导入湖北白猪和通湖猪1-细胞、2-细胞胚胎中,胚胎移... [目的]为转基因猪生产的整合效率、外源目的基因表达水平、目的基因在猪体内组织特异性表达分布等相关领域的进一步研究奠定基础。[方法]用显微注射法将GFP标记的转基因猪表达载体PM1导入湖北白猪和通湖猪1-细胞、2-细胞胚胎中,胚胎移植妊娠后生产仔猪,取耳或尾组织样提取基因组总DNA,用PCR法检测PM1在猪基因组中的整合情况。[结果]在所有生产的78头仔猪中,有6头猪用PCR检测为转PM1基因阳性猪,这6头猪在3次PCR扩增反应中都得到650 bp目的扩增片段。其他样品没有得到目的扩增片段的为阴性猪。[结论]载体PM1可以用于携带外源基因进行转基因猪生产。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 基因 整合
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绿色荧光蛋白基因对枯草芽胞杆菌的标记 被引量:1
9
作者 刘芳 梁运祥 《湖南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期543-545,共3页
以质粒pAD123为模板扩增出绿色荧光蛋白基因(gfp)序列,扩增产物连接到经酶切的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)整合载体pAXc,构建重组质粒pAXc-gfp.pAXc-gfp线性化后转入野生型枯草芽胞杆菌B411,gfp编码序列通过同源重组整合到B.subtil... 以质粒pAD123为模板扩增出绿色荧光蛋白基因(gfp)序列,扩增产物连接到经酶切的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)整合载体pAXc,构建重组质粒pAXc-gfp.pAXc-gfp线性化后转入野生型枯草芽胞杆菌B411,gfp编码序列通过同源重组整合到B.subtilis B411染色体上,获得在无抗性选择压力下稳定表达绿色荧光蛋白的重组子B412. 展开更多
关键词 绿色荧光蛋自 枯草芽胞杆菌 基因标记
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用于基因表达调控及蛋白定位研究中的新型标记——绿色荧光蛋白
10
作者 相渊 张培军 《海洋科学》 CAS CSCD 北大核心 1997年第1期15-17,共3页
关键词 绿色荧光蛋白 标记 蛋白定位 水母 基因表达调控
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低能氩离子束介导将绿色荧光蛋白基因导入小麦的研究 被引量:21
11
作者 吴丽芳 李红 +2 位作者 宋道军 吴李君 余增亮 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期17-20,共4页
用低能氩离子束介导将改良的绿色荧光蛋白基因 (mGFP4)导入小麦栽培品种皖 92 10和皖麦 32号的成熟胚细胞。在含有 10 0~ 140mg/L巴龙霉素培养基上继代培养后 ,获得了一批抗性愈伤组织。经过分化培养 ,皖 92 10获得 5株再生苗 ,皖麦 3... 用低能氩离子束介导将改良的绿色荧光蛋白基因 (mGFP4)导入小麦栽培品种皖 92 10和皖麦 32号的成熟胚细胞。在含有 10 0~ 140mg/L巴龙霉素培养基上继代培养后 ,获得了一批抗性愈伤组织。经过分化培养 ,皖 92 10获得 5株再生苗 ,皖麦 32号获得 32株绿苗 ,对照的 2 0 0枚成熟胚未获得再生苗。对再生苗进行PCR检测 ,均扩增出 6 0 0bp的nptⅡ基因片段。取 4株长势好的绿苗进行Southern杂交分析 ,结果表明这 4株绿苗皆为转基因植株。根据PCR分析结果统计 ,皖 92 10和皖麦 32号的平均植株转化率分别是 1 3 %和 4 1% 展开更多
关键词 离子束 成熟胚 绿色荧光蛋白基因
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用绿色荧光蛋白进行转基因蚕研究 被引量:12
12
作者 赵昀 张峰 +4 位作者 陈秀 徐安英 冯晓黎 黄君霆 陆长德 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 1999年第6期16-19,共4页
绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)基因用基因枪和压力渗透法导入蚕卵,它的表达由家蚕核多角体病毒(BmNPV)的即刻早期(immediatelyearlystage,IE)蛋白基因启... 绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)基因用基因枪和压力渗透法导入蚕卵,它的表达由家蚕核多角体病毒(BmNPV)的即刻早期(immediatelyearlystage,IE)蛋白基因启动子控制。在紫外灯下能观察到少数5龄幼虫身上显示绿色荧光斑点,PCR实验证实部分蚕染色体DNA中含有GFP基因。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 基因 基因 压力渗透法
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携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究 被引量:15
13
作者 陈香梅 徐开林 +3 位作者 潘秀英 李振宇 鹿群先 李德鹏 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2005年第4期641-644,共4页
为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN... 为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞,G418筛选出抗性克隆,收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞,在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明;重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后,含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论:逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白基因 T细胞 基因转移
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利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究 被引量:10
14
作者 宋军 王振坤 +7 位作者 孔庆然 赵祥杰 刘丽清 田江天 郑重 孙爽 尹智 刘忠华 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 2008年第3期64-69,共6页
试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表... 试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。 展开更多
关键词 基因 绿色荧光蛋白 核移植 脂质体
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卵黄蛋白原1(vtg1)启动子调控绿色荧光蛋白表达的转基因斑马鱼的构建 被引量:12
15
作者 陈浩 杨健 +3 位作者 王跃祥 蒋璆 徐绘 宋后燕 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第10期965-970,共6页
环境雌激素严重危害人类的健康.为了简便直观地检测水环境中的雌激素污染,构建了一种转基因斑马鱼,在这种鱼的体内,利用卵黄蛋白原1(vitellogenin1,vtg1)的启动子调控报告基因绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的表达... 环境雌激素严重危害人类的健康.为了简便直观地检测水环境中的雌激素污染,构建了一种转基因斑马鱼,在这种鱼的体内,利用卵黄蛋白原1(vitellogenin1,vtg1)的启动子调控报告基因绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的表达.用1ng/L的17!-炔雌醇(17'-ethynylestradiol,EE2)诱导4天后,仔鱼肝脏中出现绿色荧光.RT-PCR和整体原位杂交实验证实,仔鱼体内EGFP和vtg1的时空表达模式相同.通过在显微镜下观察转基因鱼的绿色荧光,可以直观判断水环境中是否含有雌激素活性物质.该研究为环境雌激素的监测提供了一种简便直观的新型工具. 展开更多
关键词 基因斑马鱼 绿色荧光蛋白 卵黄蛋白 启动子 环境雌激素
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绿色荧光蛋白标记的芽孢杆菌在幼龄畜禽体内的动态分布 被引量:7
16
作者 邝哲师 张玲华 +2 位作者 田兴山 周风珍 陈薇 《华南师范大学学报(自然科学版)》 CAS 2005年第2期23-26,共4页
应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组芽孢杆菌(Baci1010).以GFP为标记研究该工程菌在仔猪和小鸡体内的动态分布.试验结果表明:投喂含质量分数为0.1%工程菌(Baci1010)菌液的全价配合饲料12h后,在仔猪和小鸡的肠道内可检测... 应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组芽孢杆菌(Baci1010).以GFP为标记研究该工程菌在仔猪和小鸡体内的动态分布.试验结果表明:投喂含质量分数为0.1%工程菌(Baci1010)菌液的全价配合饲料12h后,在仔猪和小鸡的肠道内可检测到该工程菌的存在,36h后在小鸡盲肠内该工程菌的数量达到(155±33)×105个/g,48h后在仔猪盲肠内该工程菌的数量达到(133±35)×105个/g,在仔猪和小鸡体内,该工程菌都能在肠道内迅速复活并繁殖成为有益菌. 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白标记 动态分布 芽孢杆菌 体内 绿色荧光蛋白(GFP) DNA重组技术 畜禽 幼龄 全价配合饲料 工程菌 质量分数 试验结果 小鸡 仔猪 有益菌 肠道 盲肠 投喂
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用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠 被引量:26
17
作者 沈新明 乔贵林 +3 位作者 张玲 江培洲 黄华 姚开泰 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第3期250-253,共4页
目的研究曲细精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(pCMV-EGFP)表达载体,应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质粒DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射... 目的研究曲细精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(pCMV-EGFP)表达载体,应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质粒DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右,雄鼠与雌鼠合笼交配;分娩后3周,剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southernblotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠,荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果共注射41只雄性小鼠,存活34只,其中32只具有交配、受精能力,获得仔鼠382只。仔鼠经检测,PCR阳性133只,Southernblotting阳性15只。小鼠的年龄、注射剂量与EGFP的整合率没有明显关系,荧光显微镜观察下没有观察到组织冰冻切片中EGFP明显表达。结论曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。 展开更多
关键词 曲细精管微注射 绿色荧光蛋白 基因小鼠
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慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达 被引量:10
18
作者 李振宇 徐开林 +5 位作者 潘秀英 孙海英 高飞 鹿群先 李德鹏 何徐彭 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2007年第1期125-128,共4页
本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉... 本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。 展开更多
关键词 慢病毒载体 T淋巴细胞 绿色荧光蛋白基因
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绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测 被引量:6
19
作者 蒋欣泉 张志愿 +4 位作者 曹俊 陈传俊 王明国 周晓健 陈万涛 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期89-91,共3页
目的 检测绿色荧光蛋白基因 (EGFP)的表达载体pEGFP对MSCs的转染效率及瞬时表达 ,为利用pEGFP构建骨形成蛋白 (BMP)表达载体并转染骨髓基质干细胞 (MSCs)提供依据。方法 在体外扩增并酶切鉴定pEGFP质粒 ;抽取兔骨髓 ,应用贴壁法培养MS... 目的 检测绿色荧光蛋白基因 (EGFP)的表达载体pEGFP对MSCs的转染效率及瞬时表达 ,为利用pEGFP构建骨形成蛋白 (BMP)表达载体并转染骨髓基质干细胞 (MSCs)提供依据。方法 在体外扩增并酶切鉴定pEGFP质粒 ;抽取兔骨髓 ,应用贴壁法培养MSCs;质粒与脂质体按照不同的比例混合 ,以脂质体介导法转染pEGFP ,应用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况。结果 转染效率与脂质体和质粒的比例有关 ,绿色荧光蛋白在基因转染 2 4h后开始表达 ,4 8~ 72h最高 ,1周后表达逐渐减弱 ,但 3~ 4周后仍有少量表达。结论 按照合适的质粒和脂质体比例 ,pEGFP转染MSCs的效率可达到 30 % ,并能持续表达 3周以上 ,是转染MSCs较为理想的瞬时表达载体。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白基因 骨髓基质干细胞 瞬时表达 基因转染 脂质体
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逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达 被引量:9
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作者 李炯 刘艳红 +4 位作者 安芳兰 刘俊林 刘湘涛 尚佑军 殷宏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期376-382,共7页
为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病... 为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞(BHK-21)。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 口蹄疫病毒 衣壳前体基因 绿色荧光蛋白基因 BHK-21细胞
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