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利用绿色荧光蛋白优化辣椒遗传转化体系 被引量：3
1
作者 董依萍 刘画 +3 位作者 刘丹 周迎佳 李峰 邓颖天 《广东农业科学》 CAS 2024年第3期103-113,共11页
【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘... 【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘8214’和‘L55’)中3种不同外植体(子叶、下胚轴和Flamingo-bill外植体)的不定芽分化率、不定根分化率与荧光阳性率,探究农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等因素对不定芽、不定根分化率及荧光阳性率的影响。【结果】3个辣椒品种的Flamingo-bill外植体不定芽分化率均显著高于下胚轴与子叶外植体,其中‘L55’Flamingo-bill外植体的不定芽分化率最高、达77.59%,故选用‘L55’Flamingo-bill外植体进行后续研究。4种农杆菌不同侵染浓度和时间组合下,‘L55’Flamingo-bill外植体均可产生不定芽、不定根及表达GFP的愈伤组织,当农杆菌侵染浓度为OD_(600)=0.05,侵染时间为30 min时,不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.39%、4.84%。在6种不同预培养与共培养时间组合处理下,Flamingo-bill外植体也均产生不定芽和不定根,预培养1 d、共培养1~2 d处理下的不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.44%、12.50%。最后对表达GFP荧光的不定根与愈伤组织进行PCR检测,结果显示GFP、Kan和Cas9基因在荧光阳性的组织中均被检测到,表明农杆菌介导的T-DNA插入成功且转化稳定。【结论】辣椒的外植体类型、农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养和共培养时间均对辣椒遗传转化效率有影响。以GFP为报告基因,筛选合适的转化条件可提高农杆菌介导的辣椒遗传转化效率。 展开更多
关键词 辣椒 Flamingo-bill外植体 绿色荧光蛋白 遗传转化 农杆菌 组织培养
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表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化 被引量：1
2
作者 郭禹 程晶 +2 位作者 左玉柱 范京惠 姜海军 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2091-2100,共10页
【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protei... 【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而CMV和T7作为aMPV/C RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/C RGS的构建,本研究为aMPV/C RGS的构建提供了多种方法。 展开更多
关键词 C型禽偏肺病毒 迷你基因组 反向遗传系统 CMV启动子 增强绿色荧光蛋白 T7启动子
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表达绿色荧光蛋白的坦布苏病毒的构建与鉴定
3
作者 章丽娇 田宇杰 +9 位作者 张兰香 赵冬敏 韩凯凯 黄欣梅 杨婧 吴凤瑶 刘青涛 刘宇卓 张小飞 李银 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期44-50,共7页
报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′... 报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′UTR间引入外源基因EGFP,通过融合PCR获得全长cDNA PCR产物,体外转录生成mRNA,转染至BHK-21拯救重组病毒并研究其生长特性。结果显示,利用5′UTR-C位点构建的报告病毒mRNA转染BHK-21细胞后能观察到明显的绿色荧光;报告病毒P0接种DEF细胞后可高强度表达绿色荧光蛋白,在BHK-21和DEF细胞上增殖速度略微低于亲本毒株,但差异不显著。结果表明,成功构建了1株坦布苏绿色荧光报告病毒rJXSP-5′EGFP,在BHK-21和DEF细胞上均能有效增殖。 展开更多
关键词 坦布苏病毒 绿色荧光蛋白 报告病毒
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一种诱导表达绿色荧光蛋白穿梭质粒的构建及其在荧光示踪中的应用
4
作者 左东 李子晨 +5 位作者 尹伊 胡海 王少辉 祁晶晶 田明星 于圣青 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第4期25-31,共7页
细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究... 细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究构建了一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒pBT-iEGFP,该质粒可通过添加无水四环素诱导表达绿色荧光蛋白。诱导表达和传代稳定性试验表明,pBT-iEGFP质粒可在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中成功诱导表达绿色荧光蛋白,在五代盲传中该质粒能在细菌中稳定遗传。胞内布鲁菌诱导表达试验证实,pBT-iEGFP质粒可成功示踪细胞感染过程中活的布鲁菌。总之,本研究构建的pBT-iEGFP质粒可作为细菌的荧光示踪研究工具,应用于多种实验研究。 展开更多
关键词 诱导表达质粒 绿色荧光蛋白 大肠杆菌 沙门菌 布鲁菌
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脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建
5
作者 徐超 杨晓炼 朱书 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期218-224,共7页
携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感... 携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID50)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP基因的插入对EMCV病毒粒子的组装释放具有不良影响,并在传代过程中逐渐累积导致EGFP功能丧失的缺失和突变。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 增强绿色荧光蛋白 嵌合病毒
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用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选有效的siRNA 被引量：12
6
作者 单志新 林秋雄 +3 位作者 符永恒 邓春玉 李晓红 余细勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期231-235,共5页
建立一种利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选能有效抑制目的基因表达的siRNA的方法.以巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因为研究对象,筛选能有效沉默MIF表达的质粒载体介导的siRNA.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子AT... 建立一种利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选能有效抑制目的基因表达的siRNA的方法.以巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因为研究对象,筛选能有效沉默MIF表达的质粒载体介导的siRNA.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的MIF-GFP融合表达载体pEGFP-MIF.分别将3个靶向MIF的siRNA表达质粒与pEGFP-MIF共转化HEK293细胞,在荧光显微镜下观察HEK293细胞中GFP的表达,并用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.同时,将MIFsiRNA表达质粒分别与MIF表达载体共转化HEK293细胞,用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.定量PCR结果显示,GFP表达低的细胞中,MIF mRNA的表达也明显降低;利用pEGFP-MIF和MIF表达载体筛选到的有效MIFsiRNA的结果一致.因此,建立了目的基因与GFP融合表达,以GFP作为报告分子来筛选抑制目的基因表达siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案. 展开更多
关键词 RNA干扰 荧光定量PCR 绿色荧光蛋白 载体
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根癌农杆菌介导苎麻转绿色荧光蛋白(GFP)基因植株再生 被引量：17
7
作者 汪波 彭定祥 +2 位作者 孙珍夏 张娜 邢秀龙 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1606-1610,共5页
以苎麻优良品系"5041-3"子叶作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因的遗传转化研究,农杆菌菌株为EHA105,重组质粒为pBINm-GFP5-ER。经农杆菌浸染后的子叶外植体经过共培养、选择培养、伸长培养和生根培养后再... 以苎麻优良品系"5041-3"子叶作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因的遗传转化研究,农杆菌菌株为EHA105,重组质粒为pBINm-GFP5-ER。经农杆菌浸染后的子叶外植体经过共培养、选择培养、伸长培养和生根培养后再生出抗性植株,对抗性植株的再生过程进行了GFP荧光检测,结果表明,GFP基因能在苎麻中强烈表达,证明GFP基因能够在苎麻遗传转化中得到应用。对抗性植株的Southern杂交检测证实外源基因已整合到苎麻基因组中。 展开更多
关键词 苎麻 根癌农杆菌 遗传转化 绿色荧光蛋白
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低能氩离子束介导将绿色荧光蛋白基因导入小麦的研究 被引量：21
8
作者 吴丽芳 李红 +2 位作者 宋道军 吴李君 余增亮 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期17-20,共4页
用低能氩离子束介导将改良的绿色荧光蛋白基因 (mGFP4)导入小麦栽培品种皖 92 10和皖麦 32号的成熟胚细胞。在含有 10 0～ 140mg/L巴龙霉素培养基上继代培养后 ,获得了一批抗性愈伤组织。经过分化培养 ,皖 92 10获得 5株再生苗 ,皖麦 3... 用低能氩离子束介导将改良的绿色荧光蛋白基因 (mGFP4)导入小麦栽培品种皖 92 10和皖麦 32号的成熟胚细胞。在含有 10 0～ 140mg/L巴龙霉素培养基上继代培养后 ,获得了一批抗性愈伤组织。经过分化培养 ,皖 92 10获得 5株再生苗 ,皖麦 32号获得 32株绿苗 ,对照的 2 0 0枚成熟胚未获得再生苗。对再生苗进行PCR检测 ,均扩增出 6 0 0bp的nptⅡ基因片段。取 4株长势好的绿苗进行Southern杂交分析 ,结果表明这 4株绿苗皆为转基因植株。根据PCR分析结果统计 ,皖 92 10和皖麦 32号的平均植株转化率分别是 1 3 %和 4 1% 展开更多
关键词 离子束 成熟胚 绿色荧光蛋白基因
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绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞培养及鉴定 被引量：17
9
作者 刘慧娟 胡若愚 +3 位作者 戴王娟 刘元果 闵波 蒋犁 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期9-15,共7页
目的体外分离、培养和鉴定增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法取EGFP转基因大鼠胫、股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪分析细胞表型;CCK-8法绘制细胞生长曲... 目的体外分离、培养和鉴定增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法取EGFP转基因大鼠胫、股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪分析细胞表型;CCK-8法绘制细胞生长曲线并与野生型BMSCs增殖情况相比较;分别向成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定;将细胞经鼠尾静脉移植入大鼠体内,观察其在体内定植情况。结果获得稳定表达EGFP的BMSCs,以长梭形为主,融合后呈漩涡状排列;生长曲线示EGFP-BMSCs增殖能力旺盛,与野生型BMSCs相比差异无统计学意义(t=-0.023,P=0.982);细胞CD29、CD90、CD34、CD49d、CD45表达率分别为99.4%、96.4%、0.171%、0.049%、0.038%;成脂、成骨、成软骨诱导后,分别给予油红O、茜素红、甲苯胺蓝染色,结果均呈阳性;在肺组织内可检测到稳定的绿色荧光。结论成功获得高纯度、稳定表达EGFP的BMSCs,干细胞特性不受EGFP影响。细胞定植后,示踪效果良好,可用于后续实验研究。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 绿色荧光蛋白 诱导分化
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利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究 被引量：10
10
作者 宋军 王振坤 +7 位作者 孔庆然 赵祥杰 刘丽清 田江天 郑重 孙爽 尹智 刘忠华 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 2008年第3期64-69,共6页
试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表... 试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。 展开更多
关键词 转基因 绿色荧光蛋白 核移植 脂质体 猪
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卵黄蛋白原1(vtg1)启动子调控绿色荧光蛋白表达的转基因斑马鱼的构建 被引量：12
11
作者 陈浩 杨健 +3 位作者 王跃祥 蒋璆 徐绘 宋后燕 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第10期965-970,共6页
环境雌激素严重危害人类的健康.为了简便直观地检测水环境中的雌激素污染,构建了一种转基因斑马鱼,在这种鱼的体内,利用卵黄蛋白原1(vitellogenin1,vtg1)的启动子调控报告基因绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的表达... 环境雌激素严重危害人类的健康.为了简便直观地检测水环境中的雌激素污染,构建了一种转基因斑马鱼,在这种鱼的体内,利用卵黄蛋白原1(vitellogenin1,vtg1)的启动子调控报告基因绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的表达.用1ng/L的17!-炔雌醇(17'-ethynylestradiol,EE2)诱导4天后,仔鱼肝脏中出现绿色荧光.RT-PCR和整体原位杂交实验证实,仔鱼体内EGFP和vtg1的时空表达模式相同.通过在显微镜下观察转基因鱼的绿色荧光,可以直观判断水环境中是否含有雌激素活性物质.该研究为环境雌激素的监测提供了一种简便直观的新型工具. 展开更多
关键词 转基因斑马鱼 绿色荧光蛋白 卵黄蛋白原 启动子 环境雌激素
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用绿色荧光蛋白进行转基因蚕研究 被引量：12
12
作者 赵昀 张峰 +4 位作者 陈秀 徐安英 冯晓黎 黄君霆 陆长德 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 1999年第6期16-19,共4页
绿色荧光蛋白（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因用基因枪和压力渗透法导入蚕卵，它的表达由家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）的即刻早期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙｅａｒｌｙｓｔａｇｅ，ＩＥ）蛋白基因启... 绿色荧光蛋白（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因用基因枪和压力渗透法导入蚕卵，它的表达由家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）的即刻早期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙｅａｒｌｙｓｔａｇｅ，ＩＥ）蛋白基因启动子控制。在紫外灯下能观察到少数５龄幼虫身上显示绿色荧光斑点，ＰＣＲ实验证实部分蚕染色体ＤＮＡ中含有ＧＦＰ基因。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 转基因蚕 基因枪 压力渗透法
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内含肽介导的绿色荧光蛋白纯化 被引量：8
13
作者 赵仲麟 顿文涛 +4 位作者 李燕 金显春 杨国玉 苏同福 袁超 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期581-584,共4页
利用来源于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的DnaB内含肽的剪切特性,纯化绿色荧光蛋白.在大肠杆菌中将内含肽与绿色荧光蛋白融合表达,绿色荧光蛋白融合于DnaB内含肽的C端,在20℃,pH 7.0的条件下诱导DnaB内含肽的自剪切发生,利用几丁质... 利用来源于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的DnaB内含肽的剪切特性,纯化绿色荧光蛋白.在大肠杆菌中将内含肽与绿色荧光蛋白融合表达,绿色荧光蛋白融合于DnaB内含肽的C端,在20℃,pH 7.0的条件下诱导DnaB内含肽的自剪切发生,利用几丁质亲和柱纯化到无亲和标签的绿色荧光蛋白,得到蛋白有较高的纯度和较好的活性. 展开更多
关键词 内含肽 蛋白质剪接 绿色荧光蛋白 纯化
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携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究 被引量：15
14
作者 陈香梅 徐开林 +3 位作者 潘秀英 李振宇 鹿群先 李德鹏 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2005年第4期641-644,共4页
为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN... 为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞,G418筛选出抗性克隆,收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞,在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明;重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后,含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论:逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白基因 T细胞 基因转移
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基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法 被引量：16
15
作者 于一帆 朱小彬 +1 位作者 葛会敏 陈云 《江苏农业科学》 北大核心 2014年第12期58-61,共4页
细胞是生命活动的基本单位,各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报... 细胞是生命活动的基本单位,各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法,其中绿色荧光蛋白应用最为广泛。综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法,包括拟南芥原生质体瞬时表达、烟草叶片瞬时表达、洋葱表皮细胞瞬时表达等,同时对上述几种方法进行了比较分析。 展开更多
关键词 蛋白质 亚细胞定位 绿色荧光蛋白 瞬时表达
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增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达 被引量：9
16
作者 傅建新 王玮 +2 位作者 卢大儒 岑建农 陈子兴 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期261-265,共5页
逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交... 逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞 ,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性。流式细胞术和荧光显微镜检测发现 ,EGFP病毒转录的GP +envAm12细胞和K5 62细胞均可发出稳定的绿色荧光信号 ,阳性率可分别达 97%和 86% ;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合。上述结果提示 ,作为新一代选择性标志 ,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因 。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 逆转录病毒载体 基因表达 构建
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杨树炭疽病菌原生质体遗传转化的建立及绿色荧光蛋白的表达 被引量：11
17
作者 李思蒙 王永林 +1 位作者 黄冬辉 田呈明 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第5期121-127,共7页
以杨树炭疽病菌菌株C1-5-2作为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B(hph)和GFP表达基因的质粒gGFP转入杨树炭疽病菌菌丝的原生质体中。幼嫩菌丝在0.7mol·L-1NaCl溶解的1% Lysing enzyme酶解液的作用下酶解210min可以得... 以杨树炭疽病菌菌株C1-5-2作为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B(hph)和GFP表达基因的质粒gGFP转入杨树炭疽病菌菌丝的原生质体中。幼嫩菌丝在0.7mol·L-1NaCl溶解的1% Lysing enzyme酶解液的作用下酶解210min可以得到108·mL-1的原生质体;在PEG介导下,通过含有潮霉素浓度为300μg·mL-1的PDA选择培养基筛选转化子,每微克DNA获得41个转化子的平均转化效率。对转化子进行PCR鉴定表明:hph基因和GFP基因已经整合到杨树炭疽病菌转化子基因组中,通过荧光显微镜观察到转化子可以发出清晰的绿色荧光,且转化子的潮霉素抗性和GFP表达性状可以稳定遗传。 展开更多
关键词 杨树 炭疽菌 遗传转化 原生质体 绿色荧光蛋白
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绿色荧光蛋白标记的芽孢杆菌在幼龄畜禽体内的动态分布 被引量：7
18
作者 邝哲师 张玲华 +2 位作者 田兴山 周风珍 陈薇 《华南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2005年第2期23-26,共4页
应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组芽孢杆菌(Baci1010).以GFP为标记研究该工程菌在仔猪和小鸡体内的动态分布.试验结果表明:投喂含质量分数为0.1%工程菌(Baci1010)菌液的全价配合饲料12h后,在仔猪和小鸡的肠道内可检测... 应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组芽孢杆菌(Baci1010).以GFP为标记研究该工程菌在仔猪和小鸡体内的动态分布.试验结果表明:投喂含质量分数为0.1%工程菌(Baci1010)菌液的全价配合饲料12h后,在仔猪和小鸡的肠道内可检测到该工程菌的存在,36h后在小鸡盲肠内该工程菌的数量达到(155±33)×105个/g,48h后在仔猪盲肠内该工程菌的数量达到(133±35)×105个/g,在仔猪和小鸡体内,该工程菌都能在肠道内迅速复活并繁殖成为有益菌. 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白标记 动态分布 芽孢杆菌 体内 绿色荧光蛋白(GFP) DNA重组技术 畜禽 幼龄 全价配合饲料 工程菌 质量分数 试验结果 小鸡 仔猪 有益菌 肠道 盲肠 投喂
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绿色荧光蛋白标记的人卵巢癌裸鼠原位移植模型的建立 被引量：5
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作者 尹爱兰 钟梅 +2 位作者 孙桂芹 汪丽萍 赵杉珊 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期484-486,490,共4页
目的应用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记人卵巢癌细胞株HO8910,建立新型裸鼠原位移植瘤模型。方法将处于对数生长期的人卵巢癌细胞株HO8910/GFP2×106个细胞注射于裸鼠腋下,收集瘤块后接种于左侧卵巢包膜下,共6只,术后利用荧光体视显微... 目的应用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记人卵巢癌细胞株HO8910,建立新型裸鼠原位移植瘤模型。方法将处于对数生长期的人卵巢癌细胞株HO8910/GFP2×106个细胞注射于裸鼠腋下,收集瘤块后接种于左侧卵巢包膜下,共6只,术后利用荧光体视显微镜连续观察肿瘤生长情况,4周后处死荷瘤鼠,观察肿瘤生长及转移情况。结果种植的原位移植瘤成瘤率100%,移植后2周可观察到左侧肋脊角处绿色荧光团,并逐渐增大,4周后,可见肿瘤侵及腹膜、网膜、肠管、脾脏、肝脏、子宫、盆腔淋巴结,转移率达66.7%。结论成功建立新型裸鼠原位人卵巢癌的动物模型。 展开更多
关键词 卵巢肿瘤 原位移植 裸鼠 绿色荧光蛋白
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表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒印第安纳株的构建 被引量：13
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作者 温志远 葛金英 +2 位作者 胡森 王永 步志高 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期905-911,共7页
通过负链RNA病毒反向遗传操作技术,成功救获了表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组印地安纳株水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus Indiana serotype)、救获的重组病毒保持了野生型VSV高滴度... 通过负链RNA病毒反向遗传操作技术,成功救获了表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组印地安纳株水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus Indiana serotype)、救获的重组病毒保持了野生型VSV高滴度生长特性,细胞连续传代10次仍保持GFP的稳定表达及生物学特性不变。本研究为VSV作为新型重组活病毒载体疫苗和肿瘤治疗载体研制及基础病毒学相关研究提供了理想的技术平台。 展开更多
关键词 重组水疱性口炎病毒 增强绿色荧光蛋白 反向遗传操作
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