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结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建 被引量:3
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作者 曾曙光 张积仁 +4 位作者 章锦才 吴世卿 刘启才 艾伟健 薛国初 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期433-436,445,共5页
目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物... 目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列。将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒。将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒。Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Westernblot检测mtHSP70蛋白表达情况。结果酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达。结论含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础。 展开更多
关键词 结核杆菌 休克蛋白70 增强型绿色荧光蛋白 真核表达 免疫治疗 肿瘤
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结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达 被引量:3
2
作者 叶菁 隋延仿 +1 位作者 陈广生 张秀敏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期443-445,共3页
目的 :克隆结核杆菌热休克蛋白 70 (TBhsp70 )基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因 ,并将其克隆到pUC19中 ,进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组表达质粒pGEX TBhs... 目的 :克隆结核杆菌热休克蛋白 70 (TBhsp70 )基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因 ,并将其克隆到pUC19中 ,进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组表达质粒pGEX TBhsp70 ,在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果 :成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实 ,与GenBank公布的序列一致。含pGEX TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,能够表达相对分子质量 (Mr)约为 96 0 0 0的融合蛋白。结论 :获得了TBhsp70基因 ,成功地构建了原核表达质粒pGEX TBhsp70 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为其相关研究奠定了一定的基础。 展开更多
关键词 结核杆菌 休克蛋白 克隆 原核表达
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人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定 被引量:5
3
作者 程继忠 梁驹卿 +2 位作者 肖红 海涛 皇甫永穆 《同济医科大学学报》 CSCD 1997年第5期331-335,共5页
用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70(hsp70)基因的启动子序列和卡介苗(BCG)α基因的启动子和信号肽序列,并比较了它们与大肠杆菌(E.coli)和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆... 用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70(hsp70)基因的启动子序列和卡介苗(BCG)α基因的启动子和信号肽序列,并比较了它们与大肠杆菌(E.coli)和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码(ATG)上游150个脱氧核苷酸,其中在ATG上游—12~—8核苷酸处有核糖体结合位点(SD序列)GGAGG,在RNA聚合酶的结合位点(RNApolymerase-bindingsite,RBS)区含有与E.coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E.coli5'端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT,构成5'端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定,发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别,其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征,在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区,含有能被信号肽酶识别的Ala-X-Ala结构。 展开更多
关键词 结核杆菌 卡介苗 启动子 休克蛋白
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人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达 被引量:1
4
作者 党育平 王刚 +3 位作者 范雪莉 沈柱 樊建勇 刘玉峰 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期208-210,共3页
目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插... 目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒6型 E7蛋白 结核杆菌 休克蛋白70 融合基因 原核表达
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结核杆菌热休克蛋白70刺激表位在融合基因疫苗中的佐剂作用 被引量:2
5
作者 段秀梅 邹亚斌 +4 位作者 马洪喜 李树蕾 王银萍 王超 李玉琴 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期506-511,共6页
目的:探讨结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)的刺激表位在肝细胞癌相关抗原661(HCA661)融合基因疫苗pCI-HCA661-mtHSP70中的佐剂作用,为提高基因疫苗的免疫效果提供依据。方法:18只BALB/c小鼠随机分为pCI-neo组、pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组... 目的:探讨结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)的刺激表位在肝细胞癌相关抗原661(HCA661)融合基因疫苗pCI-HCA661-mtHSP70中的佐剂作用,为提高基因疫苗的免疫效果提供依据。方法:18只BALB/c小鼠随机分为pCI-neo组、pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组,每组6只,分别肌肉注射100μg空质粒pCI-neo、重组质粒pCI-HCA661-mtHSP70C和pCI-HCA661-mtHSP70E,流式细胞术分析小鼠脾T细胞亚群变化;ELISA法检测体外培养脾细胞上清中干扰素γ(IFNγ)的含量及免疫小鼠血清中HCA661特异性抗体的滴度;体外特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤试验观察融合基因疫苗对肿瘤细胞的抑制作用。结果:pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+T淋巴细胞的百分比和CD4+/CD8+比值与pCI-neo组比较差异有统计学意义(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+百分比和CD4+/CD8+比值均高于pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组,差异有统计学意义(P<0.05);在抗原肽刺激下,pCI-HCA661-HSP70E免疫组小鼠脾细胞培养上清中IFNγ含量较pCI-mtHCA661-HSP70C免疫组明显提高(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组IFNγ含量均高于pCI-neo组(P<0.05)。pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组诱导的HCA661特异性抗体水平较pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组显著增高(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组可以产生更强的CTL抗肿瘤效应。结论:mtHSP70刺激表位可以诱导机体对HCA661融合基因疫苗的特异性免疫应答,发挥更强的佐剂作用。 展开更多
关键词 融合基因疫苗 肝细胞癌相关抗原661 结核分枝杆菌休克蛋白70 基因佐剂
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结核杆菌热休克蛋白70剂量相关的免疫调节作用
6
作者 高志玲 孙丽媛 戴琎 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期697-699,705,共4页
目的:验证HSP70的免疫调节作用是否和剂量相关。方法:不同剂量的结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)体外刺激未成熟的树突状细胞(DC),检测其对DC表面分子CD86以及IL-10表达量的影响。结果:0~50μg/ml浓度范围内的HSP70在体外可以促进DC表达C... 目的:验证HSP70的免疫调节作用是否和剂量相关。方法:不同剂量的结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)体外刺激未成熟的树突状细胞(DC),检测其对DC表面分子CD86以及IL-10表达量的影响。结果:0~50μg/ml浓度范围内的HSP70在体外可以促进DC表达CD86并呈现剂量依赖性,但是当浓度在50~200μg/ml范围时,HSP70抑制DC表达CD86。此外HSP70在体外也可以促进DC产生IL-10,并呈一定剂量相关性。大剂量的HSP70可以抑制NOD小鼠糖尿病的发生率并显著促进Treg的产生。结论:小剂量的HSP70在体外可以促进DC的成熟,大剂量的HSP70反而可以抑制DC的成熟并抑制NOD小鼠糖尿病的发生,这种抑制作用可能是通过产生IL-10和Treg引起的。 展开更多
关键词 休克蛋白70 剂量 免疫调节 树突状细胞
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人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定 被引量:1
7
作者 高红 戴五星 +4 位作者 黄海浪 陈智浩 梁靓 程继忠 皇甫永穆 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期243-246,251,共5页
目的 构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法 用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 p... 目的 构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法 用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果 酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论 成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。 展开更多
关键词 HSP65 BCG 结核杆菌 休克蛋白 高效表达 重组卡介苗 质粒 信号肽 重组体 基因
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共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响(R68) 被引量:1
8
作者 张元豫 刘霞 +2 位作者 李坤 郭永荣 白靖平 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期755-760,788,共7页
目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/... 目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为7.410±1.738、8.844±1.981、22.4272±2.058、2.445±0.2517(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。 展开更多
关键词 重组结核杆菌休克蛋白10 破骨细胞生成 共培养 核因子KB受体活化因子配体 活化T细胞核因子1蛋白 护骨素 C-Fos
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乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达 被引量:1
9
作者 葛菲菲 邱亚峰 +2 位作者 杨耀武 高小飞 陈溥言 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第12期1081-1085,共5页
目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosisheat shock protein70,Mt.hsp70)基因融合表达载体,并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况,为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZ... 目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosisheat shock protein70,Mt.hsp70)基因融合表达载体,并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况,为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZα-A为基本单位构建E蛋白基因主要抗原片段与hsp70的融合表达载体,融合基因以酶切位点BamHⅠ连接,用电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果E蛋白基因与hsp70的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为114kD,与实际大小相符,经凝胶薄层扫描分析,表达量为33mg/L,经Western印迹验证,有良好的抗原性。结论E-hsp70融合蛋白在酵母中的表达为下一步研究hsp70是否能作为E蛋白免疫时的理想佐剂作准备。 展开更多
关键词 乙型脑炎E蛋白主要抗原片段 结核杆菌热休克蛋白70 融合 巴斯德毕赤酵母 抗原性
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结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的高效自发再折叠和再组装 被引量:5
10
作者 毛启龙 冯修光 昌增益 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第1期87-90,共4页
来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3以九聚体的形式存在 .用三种不同的强变性条件 (10 0℃加热15min ,12mol/L脲或 8mol/L盐酸胍处理 4h)将Hsp16 3变性 ,然后通过冷却或透析使之复性 ,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色... 来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3以九聚体的形式存在 .用三种不同的强变性条件 (10 0℃加热15min ,12mol/L脲或 8mol/L盐酸胍处理 4h)将Hsp16 3变性 ,然后通过冷却或透析使之复性 ,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色性光谱比较了变性 复性前后Hsp16 3的各个层次高级结构 .结果显示 ,变性的Hsp16 3几乎可以完全恢复至天然构象 ,这表明小分子热休克蛋白Hsp16 3具有很强的自发折叠和组装能力 . 展开更多
关键词 休克蛋白 变性 复性 再折叠 再组装 结核杆菌 HSP16.3 小分子
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双歧杆菌对实验性大鼠结肠炎中热休克蛋白70的影响 被引量:1
11
作者 丁洁 吴正祥 +2 位作者 杨九华 吴强 杨枫 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2011年第5期431-435,共5页
目的观察实验性结肠炎热休克蛋白(HSP70)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达变化并研究双歧杆菌对其表达的影响。方法 40只SD大鼠随机均分为正常组、模型组、5-ASA组及双歧杆菌组。2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇制备大... 目的观察实验性结肠炎热休克蛋白(HSP70)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达变化并研究双歧杆菌对其表达的影响。方法 40只SD大鼠随机均分为正常组、模型组、5-ASA组及双歧杆菌组。2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇制备大鼠结肠炎模型。5-ASA组给予奥沙拉秦钠胶囊100 mg/(kg·d),双歧杆菌组给予双歧杆菌0.1 ml/d(108cfu/ml),正常组与模型组给予生理盐水2ml/d;连续灌胃14 d。每天观察各组大鼠结肠炎疾病活动指数(DAI),评价结肠大体形态损伤指数(CMDI)和组织学损伤指数(TDI),免疫组化法检测结肠组织HSP70的表达,ELISA法检测血清HSP70、IL-10和TNF-α含量。结果与正常组相比,模型组DAI、CMDI、TDI、血清TNF-α显著升高(P<0.01),IL-10水平下降,血清及结肠组织HSP70表达减少(P<0.01)。5-ASA组和双歧杆菌组DAI、CMDI和TDI、血清TNF-α明显低于模型组(P<0.01);血清IL-10、HSP70及结肠组织HSP70明显高于模型组(P<0.01)。5-ASA组和双歧杆菌组之间差异无统计学意义。结论 HSP70表达减少参与了实验性结肠炎的发病;双歧杆菌可能通过提高保护性蛋白水平,调节促炎因子与抗炎因子之间平衡对实验性结肠炎发挥治疗作用。 展开更多
关键词 二裂菌属 结肠炎 HSP70休克蛋白质类
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人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定
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作者 宁晓暄 吴开春 +2 位作者 李源 时永全 樊代明 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第11期973-975,共3页
为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白 70 (HSP70 )的基因 ,以质粒为模板 ,采用PCR方法进行扩增 ,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,回收大小约 1 96kb的片段 ;回收片段经T A克隆法克隆到pUCm T载体上 ,并进行DNA测序 ;将目的基因片段从pUC... 为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白 70 (HSP70 )的基因 ,以质粒为模板 ,采用PCR方法进行扩增 ,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,回收大小约 1 96kb的片段 ;回收片段经T A克隆法克隆到pUCm T载体上 ,并进行DNA测序 ;将目的基因片段从pUCm T载体上酶切后 ,亚克隆到表达载体pET 2 1a(+)上 ;将重组质粒pET 2 1a(+) /HSP转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导后 ,收集细菌 ,菌体裂解后进行SDS PAGE及Westernblot检测。结果表明 ,应用PCR方法扩增出约 1 96kb的目的片段 ,序列测定结果证实 ,扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70cDNA序列一致 ;经EcoRⅠ+XhoⅠ酶切及PCR鉴定证实 ,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET 2 1a(+)上 ;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,进行SDS PAGE ,发现在分子量为 72 0 0 0处有表达量明显增多的蛋白条带 ,Westernblot证实其为目的条带。 展开更多
关键词 大肠杆菌 休克蛋白70 基因克隆 基因表达 质粒 聚合酶链反应 肿瘤免疫学
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人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化
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作者 李航宇 傅庆国 +5 位作者 孔凡民 隋春阳 翟振华 孙宏治 刘金钢 郭仁宣 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期564-565,568,共3页
目的:构建人热休克蛋白70(HSP 70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化。方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T S imp le质粒并测序。利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-... 目的:构建人热休克蛋白70(HSP 70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化。方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T S imp le质粒并测序。利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白。应用G lutath ione-Sepharose 4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行W setern b lot鉴定。结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;W estern b lot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP 70单克隆抗体特异性结合。结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达。 展开更多
关键词 休克蛋白70 原核表达
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奶牛诱导型热休克蛋白70基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达
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作者 田中杰 田文儒 +3 位作者 姜同泉 任登良 王明志 屈平平 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2008年第11期16-18,共3页
关键词 休克蛋白70 诱导型 大肠杆菌 基因片段 Hsp70 克隆 奶牛 细胞周期调控
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短指软珊瑚(Sinularia acuta)热休克蛋白HSP70家族特征及进化分析
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作者 李子若 罗晏杰 +2 位作者 曹政 Chin yaoxian 王沛政 《热带海洋学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期123-136,共14页
热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)在生物细胞或组织免受热或氧化应激等方面起着关键作用,是已知高度保守的蛋白质之一。由于全球环境持续升温,珊瑚大面积白化、死亡,珊瑚如何应对持续升温的抗逆机制是科学研究热点。本研究... 热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)在生物细胞或组织免受热或氧化应激等方面起着关键作用,是已知高度保守的蛋白质之一。由于全球环境持续升温,珊瑚大面积白化、死亡,珊瑚如何应对持续升温的抗逆机制是科学研究热点。本研究从高温胁迫短指软珊瑚测序蛋白序列数据库分析鉴定出了28个HSP70蛋白家族成员,均为酸性亲水蛋白,大部分蛋白质结构较为稳定。亚细胞定位表明HSP70蛋白主要分布在珊瑚细胞核、细胞质中,在线粒体、内质网上也有少量分布。信号肽预测表明, 28个HSP70蛋白成员中26个没有信号肽,大部分不属于分泌蛋白,不存在跨膜结构。系统进化树结果表明短指软珊瑚HSP70蛋白家族成员聚成5大类。短指软珊瑚HSP70蛋白家族结构和保守基序分析中预测到了10条保守基序motif分为5个亚族。短指软珊瑚HSP70蛋白家族二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,α-螺旋的含量占比大。28个HSP70家族蛋白中有25个预测到了N-糖基化位点,且位点个数在1~9范围内。28个HSP70家族蛋白均预测到磷酸化位点和O-糖基化位点,总个数分别在41~96和1~23范围内。本研究HSP70家族蛋白结果为今后珊瑚在应对全球升温胁迫中的适应机制等方面研究奠定了基础。 展开更多
关键词 短指软珊瑚 休克蛋白 HSP70家族 进化
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肺结核患者血浆中热休克蛋白70的表达及意义 被引量:3
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作者 李张 炎林 张和武 《中国防痨杂志》 CAS 2006年第6期388-389,共2页
目的通过检测肺结核患者外周血中热休克蛋白70(HSP70)的表达情况,旨在探讨HSP70与肺结核的关系。方法采用双抗体夹心ELISA法检测32例活动性肺结核组患者外周血中HSP70蛋白的表达情况,并与25例稳定性肺结核组及30例健康对照组进行对照分... 目的通过检测肺结核患者外周血中热休克蛋白70(HSP70)的表达情况,旨在探讨HSP70与肺结核的关系。方法采用双抗体夹心ELISA法检测32例活动性肺结核组患者外周血中HSP70蛋白的表达情况,并与25例稳定性肺结核组及30例健康对照组进行对照分析。结果活动性肺结核患者血浆中HSP70蛋白表达水平为(7.5±1.3)ng/ml,显著高于稳定性肺结核组(5.5±1.7)ng/ml及健康对照组(5.3±0.8)ng/m(P<0.01);稳定性肺结核组与健康对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论活动性肺结核患者存在HSP70的过度表达,提示HSP70可能通过某些未明机制参与活动性肺结核的发病,并可辅助肺结核活动性的判断。 展开更多
关键词 结核 肺/血液 休克蛋白70
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二化螟热休克蛋白70基因的克隆及热胁迫下的表达分析 被引量:21
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作者 崔亚东 陆明星 杜予州 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期841-848,共8页
热休克蛋白70是已知热休克蛋白家族中最重要的一种,它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力,提高对环境胁迫的耐受性。为探讨热胁迫对二化螟Chilo suppressa lis幼虫热休克蛋白70表达的影响,采用RT-PCR及RACE技术从二化螟血淋... 热休克蛋白70是已知热休克蛋白家族中最重要的一种,它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力,提高对环境胁迫的耐受性。为探讨热胁迫对二化螟Chilo suppressa lis幼虫热休克蛋白70表达的影响,采用RT-PCR及RACE技术从二化螟血淋巴细胞中克隆了热休克蛋白70基因全长cDNA序列。该基因全长2102bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1959bp,编码652个氨基酸;5′非编码区(untranslated region,UTR)为81bp,3′UTR为62bp。从该基因推导的氨基酸序列与其他昆虫的同源序列比较有很高的相似性(73%~97%)。实时定量PCR显示二化螟HSP70基因能被热胁迫诱导表达,幼虫血淋巴细胞的HSP70基因在36℃时表达量最高。流式细胞术研究发现HSP70在蛋白质水平上的表达变化与在mRNA水平上高度一致,说明二化螟HSP70基因在转录及翻译水平上受到热应激的调节。 展开更多
关键词 二化螟 休克蛋白 HSP70 RACE 表达 胁迫
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猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70(Dnak)的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析 被引量:15
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作者 李媛 张建华 +2 位作者 王亮 乔祖建 辛九庆 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期169-173,共5页
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK... 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK基因即Hsp70基因全长1 803 bp,编码600 aa,第631~633位TGA在支原体编码色氨酸而不是作为终止密码子。将该序列与多种致病支原体DnaK基因进行分析比较,发现Yin-1株与232株、J株、7 448株等MHP菌株的DNA同源性为99.3%~99.4%,氨基酸同源性为99.2%~99.3%,而与非同种支原体的DNA和氨基酸同源性仅为64.5%~74.4%和59.3%~77%。这表明DnaK基因在种内高度保守,种间差异较大。以pET28a为载体构建重组质粒,原核表达DnaK C末端大小为1 kb左右的基因,对表达的蛋白进行纯化后,通过Western blot检测它的免疫活性。原核表达得到大小为41 ku的目的蛋白,经Western blot证实,纯化蛋白可与MHP阳性猪血清反应,具有免疫活性。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪喘气病 伴侣蛋白DnaK 休克蛋白70
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原肌球蛋白、波形纤维蛋白和热休克蛋白70在肝癌转移亚细胞中表达上调 被引量:14
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作者 叶丽虹 秦宵然 +5 位作者 张晓东 齐众 钱令嘉 侯志波 王洪辉 徐少峰 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期244-249,共6页
建立并应用人H74 0 2肝癌细胞SCID鼠肿瘤转移模型 ,从转移肺组织经原代细胞培养 ,筛选并建立转移亚细胞系M H74 0 2 ,进而运用蛋白质组学技术筛选肿瘤转移相关蛋白 .通过二维电泳技术检测 ,比较M H74 0 2细胞和亲本H74 0 2细胞的总蛋白 ... 建立并应用人H74 0 2肝癌细胞SCID鼠肿瘤转移模型 ,从转移肺组织经原代细胞培养 ,筛选并建立转移亚细胞系M H74 0 2 ,进而运用蛋白质组学技术筛选肿瘤转移相关蛋白 .通过二维电泳技术检测 ,比较M H74 0 2细胞和亲本H74 0 2细胞的总蛋白 ,从多个差异蛋白质点中选择出 3个在M H74 0 2细胞中表达明显上调的蛋白质点进行ESI QUAD TOF质谱分析 ,并在MSDB公共蛋白数据库中进行同源比较和分析鉴定 .初步确定这 3个蛋白质分别为原肌球蛋白 (tropomyosin) ,波形纤维蛋白 (vimentin)和热休克蛋白 70 (heatshock 70protein ,HSP70 ) .这些蛋白质参与细胞骨架构成、蛋白质折叠和蛋白质相互作用等许多正常生理活动 ,并有报道原肌球蛋白和波形纤维蛋白与肿瘤转移有关 .利用蛋白质组学方法发现 ,在肝癌转移亚细胞M H74 0 2中 ,原肌球蛋白、波形纤维蛋白和热休克蛋白 70表达明显上调 ,进一步揭示它们在肿瘤转移中具有重要的作用 . 展开更多
关键词 肝癌 蛋白质组学 肿瘤转移相关蛋白 原肌球蛋白 波形纤维蛋白 休克蛋白70
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企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析 被引量:13
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作者 黄桂菊 喻达辉 +4 位作者 曲妮妮 郭奕慧 李莉好 杜博 童馨 《热带海洋学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期46-51,共6页
采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列。cDNA全长2 308 bp,3’非编码区域(UTR)为234 bp,5’UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论... 采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列。cDNA全长2 308 bp,3’非编码区域(UTR)为234 bp,5’UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EE-VD。结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列。与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失。两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个。系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起。该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义。 展开更多
关键词 企鹅珍珠贝Pteria PENGUIN 休克蛋白70基因 CDNA克隆 序列比较
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