结核分枝杆菌DnaG引物酶与ssDNA模板相互作用的研究

1

作者 陈江 罗昊 +2 位作者 张知明 宋旭 王刚刚 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1920-1934,共15页

目的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引物酶DnaG(MtuDnaG)在其基因组DNA复制中起着至关重要的作用,因而被认为是抗结核药物研发的新靶点。然而MtuDnaG起始引物合成的机制尚不清楚,这阻碍了MtuDnaG抑制剂的筛选。本研究将鉴定M... 目的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引物酶DnaG(MtuDnaG)在其基因组DNA复制中起着至关重要的作用,因而被认为是抗结核药物研发的新靶点。然而MtuDnaG起始引物合成的机制尚不清楚,这阻碍了MtuDnaG抑制剂的筛选。本研究将鉴定MtuDnaG结合模板的特异性识别位点,探讨MtuDnaG与ssDNA模板之间的相互作用。方法本研究以MtuDnaG的双结构域蛋白MtuP49(包含了锌指结合结构域和RNA聚合酶结构域)为研究对象,利用生物化学和生物物理学方法,研究MtuDnaG与含不同三联体的ssDNA模板之间的相互作用,鉴定MtuDnaG的特异性识别位点。结果5'-GCG/C-3'三联体可能是MtuDnaG结合模板ssDNA的特异性识别位点。此外,在结核分枝杆菌基因组的复制起始点附近也存在可以与MtuP49特异结合的5'-GCG/C-3'位点,其3'端侧翼序列显著影响ssDNA与MtuP49的亲和力。突变实验表明,位于锌指结合结构域中的Arg31对MtuP49结合ssDNA的活性具有重要贡献。基于预测的MtuP49结构,推测在MtuP49结合模板ssDNA过程中,锌指结合结构域会发生分子内重排。结论本研究首次鉴定了MtuDnaG结合模板ssDNA的特异性识别位点,揭示了影响MtuDnaG与模板ssDNA相互作用的主要因素。本文的研究结果不但有助于阐明MtuDnaG起始引物合成的机制,也为靶向DnaG的新型抗结核药物开发提供了新的信息。 展开更多

关键词 引物酶dnaG 结核分枝杆菌 特异性识别位点 结构域重排 dna复制

在线阅读 下载PDF 职称材料

与GyrA相互作用的GyrB结构域突变对结核分枝杆菌螺旋酶功能的影响

2

作者 王茂淋 黄友谊 +1 位作者 左怀雨 张吉斌 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期71-75,共5页

DNA螺旋酶中的GyrA与GyrB亚基只有互作重组后才有酶活性。为寻找GyrB亚基和GyrA亚基相互作用的关键区域,构建了不同的GyrB亚基突变体,分析GyrB各突变体与GyrA亚基的相互作用对全酶活性的影响。结果显示:GyrB亚基C端是其与GyrA相互作用... DNA螺旋酶中的GyrA与GyrB亚基只有互作重组后才有酶活性。为寻找GyrB亚基和GyrA亚基相互作用的关键区域,构建了不同的GyrB亚基突变体,分析GyrB各突变体与GyrA亚基的相互作用对全酶活性的影响。结果显示:GyrB亚基C端是其与GyrA相互作用的主要结构域,结合GyrB的二维结构,提出GyrB中第531~550位氨基酸是影响螺旋酶功能的关键区域,并可能是理想的新药设计靶标。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌dna螺旋酶 GyrB缺失突变体 松弛活性 切割活性

在线阅读 下载PDF 职称材料

结核分枝杆菌DNA促旋酶基因突变与耐氟喹诺酮类药物的相关性研究 被引量：8

3

作者 卢峰岳 俞日霞 +2 位作者 胡族琼 蔡杏珊 谭耀驹 《中国防痨杂志》 CAS 2014年第6期429-433,共5页

目的 分析MDR TB结核分枝杆菌临床分离株的DNA促旋酶（gyr）基因突变特点,初步探究MDR-TB对氟喹诺酮类药物耐药与gyr基因突变的相关性.方法 采用最低抑菌浓度（MIC）法筛选MDR-TB,对17株临床MDRTB菌株应用DNA直接测序法检测gyr基因的突... 目的 分析MDR TB结核分枝杆菌临床分离株的DNA促旋酶（gyr）基因突变特点,初步探究MDR-TB对氟喹诺酮类药物耐药与gyr基因突变的相关性.方法 采用最低抑菌浓度（MIC）法筛选MDR-TB,对17株临床MDRTB菌株应用DNA直接测序法检测gyr基因的突变情况,分析细菌基因突变与耐药产生的相关性.结果 Mtb 1株标准菌株（H37Rv）未见gyr A亚单位基因（gyrA）和gyr B亚单位基因（gyrB）基因突变,所有17株临床菌株gyrA均存在95位AGC→ACC.12株耐环丙沙星和左氧氟沙星菌株中,10株gyrA产生了错义突变,突变率为83.3％;突变位点位于89位、90位、91位和94位;1株发生了gyrB突变,突变位点位于500位.耐莫西沙星的9株耐药株中,8株gyrA发生突变,占88.9％.结论 gyrA基因突变是Mtb对氟喹诺酮类药物产生耐药的机制之一;gyrA的错义突变主要发生在第89位、90位、91位、94位密码子上. 展开更多

关键词 抗药性 多种 细菌 分枝杆菌 结核 dna促旋酶 荧光喹诺酮类 突变

在线阅读 下载PDF 职称材料

结核分枝杆菌聚合酶螺旋反应检测方法的建立及效果评价 被引量：2

4

作者 马晓光 石洁 +6 位作者 徐行勇 朱岩昆 王少华 郑丹薇 孙国清 孙定勇 苏茹月 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2020年第10期1121-1127,共7页

目的建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果。方法针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测。提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入Bst DNA聚合酶的RM2X反应液中,在荧光定量PCR仪... 目的建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果。方法针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测。提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入Bst DNA聚合酶的RM2X反应液中,在荧光定量PCR仪上于63℃反应45 min,通过荧光信号进行检测。通过对引物序列进行优化,筛选出最佳引物序列,并对其检测特异性和最低检出限进行评估。于2019年5—8月间从郑州市第六人民医院连续收集200例肺结核患者痰液样本(同一患者收集3份),对痰标本进行痰涂片、固体痰培养和PSR检测。以痰培养结果为参照,评价PSR对结核病患者的检测效能。结果通过引物序列优化,筛选出一套对结核分枝杆菌检测的PSR引物,使用该引物进行PSR的最低检出限可达到10~3菌落形成单位(CFU)/ml;检测特异性实验表明该方法与15株非结核分枝杆菌无交叉反应。200例肺结核患者中,痰涂片检测阳性48例,阳性检出率为24.0%(48/200);痰培养检测阳性83例,阳性检出率为41.5%(83/200);PSR方法检测阳性87例,阳性检出率为43.5%(87/200)。以痰培养结果为标准,PSR检测结核病的敏感度和特异度分别为96.4%(80/83)、94.0%(110/117),阳性预测值为92.0%(80/87),阴性预测值为97.3%(110/113),与痰培养检测方法基本一致(Kappa值为0.898)。结论PSR检测适用于结核分枝杆菌的快速筛查。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 痰 聚合酶螺旋反应 诊断 实验室技术和方法

在线阅读 下载PDF 职称材料

结核分枝杆菌DNA疫苗的免疫原性和保护效率的比较研究 被引量：1

5

作者 顾田园 蔡宏 +2 位作者 田霞 余大海 朱玉贤 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期79-83,共5页

对结核分枝杆菌两种DNA单价疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价和比较.将结核分枝杆菌抗原蛋白MPT70(22kDa)和PstS-3(40kDa)克隆到原核表达载体pET22b中,酶切和测序鉴定正确后转化入E.coli BL21(DE3)PLysS宿主菌株内中,通过诱导表达纯... 对结核分枝杆菌两种DNA单价疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价和比较.将结核分枝杆菌抗原蛋白MPT70(22kDa)和PstS-3(40kDa)克隆到原核表达载体pET22b中,酶切和测序鉴定正确后转化入E.coli BL21(DE3)PLysS宿主菌株内中,通过诱导表达纯化获得目的蛋白用于DNA疫苗效价鉴定.用真核表达载体pJW4303构建了MPT70,PstS-3(包括信号肽的全基因)两种重组真核质粒(DNA疫苗),进行了酶切鉴定和序列分析, 确定含有正确的读码框.用上述DNA疫苗分别肌注免疫小鼠,三免小鼠后21天MPT70 和PstS-3抗体均达到为1∶12800.三免后21天小鼠的脾脏细胞诱导产生较高水平的MPT70和PstS-3特异性的细胞因子γ-干扰素,浓度分别为16872.82pg/ml和11460.98pg/ml.三次免疫后经静脉强毒攻击,两组DNA疫苗免疫鼠的肺脏和脾脏的载菌数均比阴性对照组少,表明这两种疫苗都能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答,而且以前者为主.综合各项指标发现,DNA疫苗MPT70要优于PstS-3. 展开更多

关键词 dna疫苗 结核分枝杆菌 MPT 小鼠 免疫原性 诱导 免疫后 酶切 强毒 核质

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组表达萤火虫荧光素酶结核分枝杆菌的构建及其用于最低抑菌浓度测定的研究

6

作者 李媛媛 陈曦 +3 位作者 王彬 付雷 朱慧 陆宇 《中国防痨杂志》 CAS 2017年第11期1193-1198,共6页

目的构建萤火虫荧光素酶（FFLuc）重组表达的结核分枝杆菌菌株，利用其建立抗结核药物最低抑菌浓度（MIC）检测方法，并应用该方法测定目前主要的抗结核药物的MIC。方法（1）以质粒pMV306hsp＋FFLuc为模板，PCR扩增FFLuc基因。构建重组... 目的构建萤火虫荧光素酶（FFLuc）重组表达的结核分枝杆菌菌株，利用其建立抗结核药物最低抑菌浓度（MIC）检测方法，并应用该方法测定目前主要的抗结核药物的MIC。方法（1）以质粒pMV306hsp＋FFLuc为模板，PCR扩增FFLuc基因。构建重组表达质粒pMV361＋FFLuc，电转化至结核分枝杆菌标准株H37Rv中，应用小动物活体成像系统鉴定FFI。tlC表达。比较结核分枝杆菌与重组结核分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线。（2）检测不同浓度的异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、莫西沙星（Mfx）、链霉素（Sin）、左氧氟沙星（Lfx）、利奈唑胺（Lzd）作用不同时间的表达荧光量变化，考察在不同药物作用下FFLuc表达的稳定性，建立以FFLuc标记结核分枝杆菌为基础的测定抗结核药物MIC的方法并测定INH、RFP、EMB、Mfx、Sm、Lfx、Lzd等7种药物的MIC。结果（1）pMV361＋FFLuc重组表达载体构建的稳定表达FFLuc的结核分枝杆菌菌株的菌量与荧光表达量（相对荧光强度）呈线性关系[r^2=0．994，lg（y）=0．905×lgCr）＋0．832]。（2）应用新方法检测的7种药物的MIc与微孔培养显色（MABA）法MIC测定结果基本相同。第4天时荧光检测INH、RFP、Mfx、EMB、Sm、Lfx和Lzd的MIC值分别是0．05、0．05、0．09375、4、0．8、0．15、0．15μg／ml；与MABA法检测结果相比，结果在相差1-2倍MIC值的可接受范围内。结论建立了FFLuc重组表达的结核分枝杆菌菌株检测抗结核药物MIC的方法与MABA法相比，所需时间更短，第4天即可检测结果。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 微生物敏感性试验 dna 重组 荧光素酶类 萤火虫

在线阅读 下载PDF 职称材料

PCR检测结核分枝杆菌复合群IS_(986)DNA重复序列 被引量：1

7

作者 朱诗应 杨毓华 邵海枫 《医学研究生学报》 CAS 1994年第3期29-32,共4页

用ＰＣＲ检测ＭＴＢＣ特异的ＩＳ９８６ＤＮＡ重复序列。ＩＳ９８６ＤＮＡ重复序列全长１３５８ｂｐ，特异地存在于ＭＴＢＣ细菌染色体ＤＮＡ中，并且多次重复出现。作者参照文献，在此序列内合成一对引物，扩增出１８８ｂｐ的ＭＴＢＣ... 用ＰＣＲ检测ＭＴＢＣ特异的ＩＳ９８６ＤＮＡ重复序列。ＩＳ９８６ＤＮＡ重复序列全长１３５８ｂｐ，特异地存在于ＭＴＢＣ细菌染色体ＤＮＡ中，并且多次重复出现。作者参照文献，在此序列内合成一对引物，扩增出１８８ｂｐ的ＭＴＢＣ特异的ＤＮＡ片段。实验证明具有高度的特异性和敏感性。与其它的分枝杆菌和人血细胞ＤＮＡ无交叉反应。最小检出极限为１０ｆｇＤＮＡ或１０个菌体／ｍｌ。对ＰＣＲ反应体系中有关实验条件如引物浓度、ＴａｑＤＮＡ聚合酶用量、循环程序等进行了优化选择。在临床标本细菌ＤＮＡ抽提中首次采用了简便的ＴＥ－Ｔｒｉｔｏｎ煮沸法，节省了成本，使整个检测时间缩短至６～８ｈ。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌复合群 聚合酶链反应 dna重复序列

在线阅读 下载PDF 职称材料

结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制的研究 被引量：16

8

作者 吴雪琼 梁建琴 +5 位作者 李洪敏 张俊仙 由昆 金关甫 刘佳文 闫国蕊 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期49-54,共6页

目的　了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制 ,建立快速分子药敏试验方法。方法　通过聚合酶链反应 (PCR) -单链构象多态性 (SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性 (RFL P)和 PCR-直接测序 (DS)技术分析 10 7株结核分枝杆菌临床分离株 emb B... 目的　了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制 ,建立快速分子药敏试验方法。方法　通过聚合酶链反应 (PCR) -单链构象多态性 (SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性 (RFL P)和 PCR-直接测序 (DS)技术分析 10 7株结核分枝杆菌临床分离株 emb B基因。结果　以 H3 7Rv标准株为对照 ,10 7株结核分枝杆菌临床分离株的 16 S r DNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准相同。 38株药物敏感株的 emb B基因、SSCP均泳动正常 ,RFL P和 DS分析与对照株相同。 6 9株耐乙胺丁醇 (EMB)分离株中 ,2 5株 (36 .2 % ) emb B基因 SSCP泳动异常 ;8株 RFL P分析异常 ;DS分析 2 5株均为 30 6位密码子突变 ,其中 1株合并有 2 74位 CGC→ CCC突变 ,其 EMB MICs均≥ 2 0 μg/ml;8株为 30 6位 ATG→ATA或 ATT突变 ,17株为 ATG→GTG或 CTG突变 ,后者 EMB MICs均≥ 30μg/ml。结论　部分结核分枝杆菌耐乙胺丁醇是由于其 emb B基因 (尤其是 30 6位密码子 )突变所致 ,PCR- SSCP技术可能成为测定部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型的简便。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 药物耐受性 聚合酶链反应 单链构象多态性 dna序列分析 乙胺丁醇

在线阅读 下载PDF 职称材料

单耐氧氟沙星的结核分枝杆菌耐药机制研究 被引量：8

9

作者 王前 宋媛媛 +2 位作者 池俊英 王玉峰 赵雁林 《中国防痨杂志》 CAS 2014年第5期350-355,共6页

目的探讨单耐氧氟沙星的结核分枝杆菌中耐药相关基因突变及外排泵基因风坦两种不同耐药机制的作用。方法从国家结核病参比实验室2007年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐氧氟沙星的菌株17株。采用直接测序法检测利福平耐药相关基因删似... 目的探讨单耐氧氟沙星的结核分枝杆菌中耐药相关基因突变及外排泵基因风坦两种不同耐药机制的作用。方法从国家结核病参比实验室2007年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐氧氟沙星的菌株17株。采用直接测序法检测利福平耐药相关基因删似和gyrB突变情况。提取gyrA和gyrB无突变菌株的RNA后反转录并采用Real—timePCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量，对比菌株最低抑菌浓度（MIC）试验结果，筛选可能与氧氟沙星药物外排泵的相关基因，并选用大肠埃希菌为模式生物构建表达载体，检测过表达目的外排泵蛋白的大肠埃希菌对氧氟沙星的耐药程度加以验证。结果在17株单耐氧氟沙星的菌株中，有4株（4／17）检测到gyrA突变，其中包括90位点突变1株及94位点突变3株，上述突变均表现为高浓度耐药，其MIC均不低于4μg/ml。在gyrA和gyrB未突变菌株中，通过real-timePCR检测发现在高浓度耐药的2株菌株中，Rv0933和Rv2938的转录水平显著高于其他低浓度耐药菌株，较对照株H37Rv转录水平高16倍和5倍。在对照组和转入pEASY-E1-Rv2938的大肠埃希菌中MIC均小于0．125μg／ml，而转入pEASY-E1-Rv0933的大肠埃希菌的MIC为2μg／ml。结论本研究结果显示，gyrA耐药决定区基因突变与氧氟沙星高浓度耐药相关，PstB可能是氧氟沙星特异性的药物外排泵基因，其高水平表达与氧氟沙星高浓度耐药相关。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 荧光喹诺酮类 抗药性 细菌 dna促旋酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

结核分枝杆菌耐氟喹诺酮类药物的分子机制研究进展 被引量：9

10

作者 张玉娇 李晓静 米凯霞 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期918-927,共10页

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)通过空气传播引起人类感染的慢性传染病,耐药结核分枝杆菌的流行是目前结核病防治的世界难题。氟喹诺酮类药物是人工合成药物,应用于耐药结核的临床治疗中,在治疗中起着核心的作用... 结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)通过空气传播引起人类感染的慢性传染病,耐药结核分枝杆菌的流行是目前结核病防治的世界难题。氟喹诺酮类药物是人工合成药物,应用于耐药结核的临床治疗中,在治疗中起着核心的作用。但近年来,氟喹诺酮类药物的抗性菌株不断出现,愈发增加了结核病治疗的困难与治疗失败风险。在临床中氟喹诺酮药物的靶点比较清楚,是结核分枝杆菌的DNA旋转酶。目前发现结核分枝杆菌耐氟喹诺酮类药物的机制主要包括药物靶点DNA旋转酶的关键氨基酸改变、药物外排泵系统、细菌细胞壁厚度的增加以及喹诺酮抗性蛋白Mfp A介导的DNA旋转酶活性调控。其中在氟喹诺酮靶标DNA旋转酶功能活性改变的耐药机制方面,编码DNA旋转酶基因突变一直是研究的热点,但近年来发现DNA旋转酶的调控蛋白Mfp A以及DNA旋转酶的修饰在细菌耐药性中起着重要的作用,相关机制还亟待发现。本文综述了当前结核分枝杆菌耐氟喹诺酮类药物的作用机制,旨在为研发精准诊断技术和药物发掘提供科学理论基础和参考。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 氟喹诺酮 耐药 dna旋转酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

2017—2019年福建省结核分枝杆菌分离株基因型特征及其耐药性分析 被引量：5

11

作者 魏淑贞 赵永 +2 位作者 林建 林淑芳 戴志松 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2023年第1期73-78,共6页

目的:了解福建省结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)基因型的分布特征和流行情况,同时分析MTB基因型与其耐药的关系。方法:选取2017—2019年福建省结核病耐药监测点的477株MTB临床分离株作为研究对象。采用对硝基苯甲酸(PNB)... 目的:了解福建省结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)基因型的分布特征和流行情况,同时分析MTB基因型与其耐药的关系。方法:选取2017—2019年福建省结核病耐药监测点的477株MTB临床分离株作为研究对象。采用对硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)生长实验法进行菌种初步鉴定,并采用传统固体比例法对9种抗结核药物[异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampin,RFP)、链霉素(streptomycin,Sm)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、卡那霉素(kanamycin,Km)、氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、卷曲霉素(capreomycin,Cm)、丙硫异烟胺(prothionamide,Pto)、对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)]进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。应用熔解曲线法间隔区寡核苷酸分型(McSpoligotyping)技术对菌株进行基因分型。结果:477株MTB菌株中北京基因型有245株,占51.4%;T家族有44株(含2株T,28株T1,7株T2,T3和T4各3株,1株T5),占9.2%;H家族有35株(含13株H,1株H1,21株H3),占7.3%;EAI家族有11株(含10株EAI2-Manila,1株EAI5),占2.3%;LAM3、Manu2和X1家族各有1株,分别占0.2%;所属家族未定义或不明确的有139株,占29.1%。聚类分析显示,各基因型家族主要流行型为北京家族的SIT1(44.9%,214/477)、T家族的SIT53(2.5%,12/477)、H家族的SIT742(1.9%,9/477)、EAI家族的SIT19(1.5%,7/477)。各家族MTB菌株与INH的耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=10.311,P=0.036),其中,EAI+LAM+Manu+X家族菌株对INH的耐药率最高[28.6%(4/14)];对RFP的耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=14.366,P=0.006),其中,EAI+LAM+Manu+X家族菌株对RFP的耐药率最高[21.4%(3/14)];对Ofx的耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=23.643,P=0.000),其中,H家族菌株对Ofx的耐药率最高[17.1%(6/35)];对PAS耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=9.550,P=0.049),其中,未定义家族菌株对PAS的耐药率最高[4.3%(6/139)]。结论:福建省MTB流行基因型以北京基因型为主,同时应重视未定义家族菌株的流行并加强对T家族、H家族和EAI等家族菌株的监测。菌株对INH、RFP、Ofx和PAS的耐药性与各基因家族相关。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 基因型 dna 核糖体间隔区 聚合酶链反应 抗药性 细菌

在线阅读 下载PDF 职称材料

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测 被引量：6

12

作者 熊国亮 张慧慧 刘珍琼 《中国防痨杂志》 CAS 2006年第1期11-13,共3页

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺... 目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。 展开更多

关键词 套式聚合酶链反应 dna测序 分枝杆菌 结核 利福平 抗药性 微生物

在线阅读 下载PDF 职称材料

用PCR检测牛粪中副结核分枝杆菌

13

作者 李凯年 《畜牧兽医科技信息》 1994年第5期2-2,共1页

最近,新西兰D.M.Collins等人,根据DNA插入顺序的218bp片段研制了一种检测副结核分枝杆菌的聚合酶链反应(PCR)。这个插入顺序IS900对该菌是特异的。率法包括两个连续的扩增反应。用此法能可靠地检出每克粪便50个菌。用这种PCR检测了32份... 最近,新西兰D.M.Collins等人,根据DNA插入顺序的218bp片段研制了一种检测副结核分枝杆菌的聚合酶链反应(PCR)。这个插入顺序IS900对该菌是特异的。率法包括两个连续的扩增反应。用此法能可靠地检出每克粪便50个菌。用这种PCR检测了32份牛粪样。结果检出了全部9份含≥1600菌落形成单位(cfu)/克粪便的样品。 展开更多

关键词 副结核分枝杆菌 PCR检测 菌落形成单位 聚合酶链反应 扩增反应 dna 粪样 法能 COLLINS

在线阅读 下载PDF 职称材料

荧光定量PCR测定支气管肺泡灌洗液中TbDNA对涂阴肺结核的诊断价值 被引量：9

14

作者 张红漫 李志惠 +4 位作者 赵杰 刘朋冲 耿书军 李毅 宋韬 《中国防痨杂志》 CAS 2009年第4期227-229,共3页

目的探讨纤支镜肺泡灌洗液中结核分枝杆菌DNA在涂阴肺结核诊断中的价值。方法应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术对300例涂阴肺结核,178例菌阳肺结核及119例肺炎或肺癌患者的纤支镜肺泡灌洗液标本进行结核分枝杆菌DNA检测。结果3种... 目的探讨纤支镜肺泡灌洗液中结核分枝杆菌DNA在涂阴肺结核诊断中的价值。方法应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术对300例涂阴肺结核,178例菌阳肺结核及119例肺炎或肺癌患者的纤支镜肺泡灌洗液标本进行结核分枝杆菌DNA检测。结果3种病因肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA阳性检出率分别为:74.3%(223/300)、94.9%(169/178)、17.6%(21/119)。结论荧光定量聚合酶链反应检测肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA,用于肺结核诊断可提高肺结核诊断的敏感性和准确性,明显优于痰抗酸染色,亦较痰结核菌培养诊断灵敏、快速,可作为肺结核诊断较可靠指标。 展开更多

关键词 结核 肺/诊断 支气管肺泡灌洗液 分枝杆菌 结核 dna 细菌 聚合酶链反应

在线阅读 下载PDF 职称材料

实时荧光PCR检测儿童肺结核粪便中Mtb-DNA的效果评价 被引量：4

15

作者 黄慧谦 吴驰 +3 位作者 陈建波 杨燕 侯志平 李小勇 《中国防痨杂志》 CAS 2012年第5期315-318,共4页

目的应用实时荧光PCR快速检测肺结核患儿粪便中Mtb-DNA,并初步评估其临床效果。方法收集肺结核住院儿童粪便标本76份,应用实时荧光PCR检测Mtb-DNA,检测结果与20例其他呼吸系统疾病患儿的粪便实时荧光PCR检测Mtb-DNA、76例粪便抗酸杆菌... 目的应用实时荧光PCR快速检测肺结核患儿粪便中Mtb-DNA,并初步评估其临床效果。方法收集肺结核住院儿童粪便标本76份,应用实时荧光PCR检测Mtb-DNA,检测结果与20例其他呼吸系统疾病患儿的粪便实时荧光PCR检测Mtb-DNA、76例粪便抗酸杆菌涂片检查以及41例患儿痰标本的涂片和(或)培养、实时荧光PCR检测结果进行比较。结果粪便实时荧光PCR检测敏感度达到23.68%(18/76),特异度为100.00%(20/20),肺结核患儿粪便PCR阳性率[23.68%(18/76)]明显高于涂片阳性率[6.58%(5/76)],41例患儿中痰涂片和(或)培养阳性例数(15例)和痰PCR检测阳性例数(18例)高于粪便PCR检测阳性例数(11例)。结论实时荧光PCR检测儿童粪便Mtb-DNA,是一种特异度高、比较敏感、非侵入性且相对安全的儿童肺结核快速诊断方法。 展开更多

关键词 结核 肺/诊断 分枝杆菌 结核 dna 细菌 粪便 聚合酶链反应 儿童

在线阅读 下载PDF 职称材料

PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统对MTB DNA检测方法的初步研究 被引量：4

16

作者 于佳佳 张旭霞 +5 位作者 张雨晴 任卫聪 姚丛 李传友 刘毅 唐神结 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2020年第12期1280-1288,共9页

目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonuc... 目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-1crRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为101拷贝/μl的质粒和100拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于106拷贝/μl的MTB DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均=-9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。 展开更多

关键词 结核 分枝杆菌 聚合酶链反应 dna探针 微阵列分析 CRISPR-Cas13a

在线阅读 下载PDF 职称材料

DNA分析与扩增

17

《生物技术通报》 CAS CSCD 1992年第12期25-28,共4页

关键词 dna 聚合酶链反应 基因测序 反转录酶 阳性菌株 副结核分枝杆菌 血单核细胞 分离株 链替换 艰难梭菌

在线阅读 下载PDF 职称材料