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CRISPR/Cas分子诊断技术在结核分枝杆菌耐药性检测中的研究进展
1
作者 王苑柠 杜宗敏 《中国防痨杂志》 北大核心 2025年第5期666-672,共7页
结核病是全球公共卫生面临的一项严峻挑战。我国是结核病高负担国家,也是耐多药和利福平耐药结核病高负担国家。发展快速、灵敏的结核分枝杆菌耐药性检测方法对结核病的控制和治疗具有重要意义。成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered... 结核病是全球公共卫生面临的一项严峻挑战。我国是结核病高负担国家,也是耐多药和利福平耐药结核病高负担国家。发展快速、灵敏的结核分枝杆菌耐药性检测方法对结核病的控制和治疗具有重要意义。成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)作为细菌适应性免疫的组成部分,能够高效、特异性地识别和切割外源核酸靶标;同时某些CRISPR相关蛋白(Cas)具有反式切割活性,这为建立CRISPR/Cas结核病耐药性诊断技术开辟了新的研究领域。本文对CRISPR/Cas技术检测结核分枝杆菌及其耐药性的最新研究动态进行综述,并探讨该领域的未来发展趋势。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 结核 抗多种药物性 诊断技术 分子生物学检测 综述
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LncRNA NORAD靶向调控miR-20a-5p对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞凋亡的影响
2
作者 孙红梅 程欢欢 +1 位作者 孔祥龙 薛建昌 《中国感染与化疗杂志》 北大核心 2025年第5期549-556,共8页
目的 探讨长链非编码RNA DNA损伤激活的非编码RNA(LncRNA NORAD)靶向调控微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞凋亡的影响。方法 选取河北省胸科医院2022年3月至2023年4月的活动性肺结核患者、结核分枝杆菌感染无症... 目的 探讨长链非编码RNA DNA损伤激活的非编码RNA(LncRNA NORAD)靶向调控微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞凋亡的影响。方法 选取河北省胸科医院2022年3月至2023年4月的活动性肺结核患者、结核分枝杆菌感染无症状患者、健康体检者各50例。分别采集各组研究对象空腹状态下的静脉血,离心后检测血清中LncRNA NORAD和miR-20a-5p表达水平以及炎性因子水平。将人单核细胞系THP-1诱导分化为巨噬细胞并将其分为对照组(Control组)、模型组(Model组)、转染NORAD空载体组(sh-NC组)、转染sh-NORAD载体组(sh-NORAD组)、共转染sh-NORAD和miR-20a-5p抑制剂空载体组(sh-NORAD+miR-20a-5p inhibitor NC组)、共转染sh-NORAD和miR-20a-5p抑制剂载体组(sh-NORAD+miR-20a-5p inhibitor组)、转染miR-20a-5p空载体组(miR-NC组)、转染miR-20a-5p载体组(miR-20a-5p mimics组)。检测各组细胞LncRNA NORAD和miR-20a-5p表达水平(qRT-PCR法)、细胞增殖能力(CCK-8试剂盒法)、细胞凋亡情况(流式细胞术法)、细胞炎性因子水平(ELISA法)和细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl 2)和活化的半胱天冬蛋白酶-3(cleaved caspase 3)蛋白表达量,验证LncRNA NORAD与miR-20a-5p之间的靶向关系。结果 与健康体检者比较,活动性肺结核患者和结核分枝杆菌感染无症状患者血清中炎性因子水平和LncRNA NORAD表达水平显著升高、miR-20a-5p水平显著降低。与Control组比较,Model组细胞LncRNA NORAD、细胞增殖能力、Bcl 2蛋白表达水平以及炎性因子水平显著升高,miR-20a-5p水平、细胞凋亡率以及Bax和cleaved caspase 3蛋白表达量显著下降(P<0.05);与sh-NC组比较,sh-NORAD组细胞LncRNA NORAD表达水平、Bcl 2蛋白表达水平、炎性因子水平以及细胞增殖能力明显降低,miR-20a-5p水平、细胞凋亡率以及Bax和cleaved caspase 3蛋白表达量显著升高(P<0.05);与sh-NORAD+miR-20a-5p inhibitor NC组比较,sh-NORAD+miR-20a-5p inhibitor组细胞炎性因子水平、Bcl 2蛋白表达水平以及细胞增殖能力显著升高,miR-20a-5p水平、细胞凋亡率以及Bax和cleaved caspase 3蛋白表达量显著下降(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-20a-5p mimics组细胞炎性因子水平、增殖能力明显升高,细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。进一步通过实验证实LncRNA NORAD与miR-20a-5p之间的靶向关系。结论 在结核分枝杆菌诱导的巨噬细胞中LncRNA NORAD过表达,沉默LncRNA NORAD的表达可靶向下调miR-20a-5p的表达,从而抑制结核分枝杆菌诱导的巨噬细胞的炎性反应,促进细胞凋亡。 展开更多
关键词 长链非编码RNA dna损伤激活的非编码RNA 微小RNA-20a-5p 结核分枝杆菌 巨噬细胞 炎症 凋亡
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结核分枝杆菌DnaG引物酶与ssDNA模板相互作用的研究 被引量：1
3
作者 陈江 罗昊 +2 位作者 张知明 宋旭 王刚刚 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1920-1934,共15页
目的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引物酶DnaG(MtuDnaG)在其基因组DNA复制中起着至关重要的作用,因而被认为是抗结核药物研发的新靶点。然而MtuDnaG起始引物合成的机制尚不清楚,这阻碍了MtuDnaG抑制剂的筛选。本研究将鉴定M... 目的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引物酶DnaG(MtuDnaG)在其基因组DNA复制中起着至关重要的作用,因而被认为是抗结核药物研发的新靶点。然而MtuDnaG起始引物合成的机制尚不清楚,这阻碍了MtuDnaG抑制剂的筛选。本研究将鉴定MtuDnaG结合模板的特异性识别位点,探讨MtuDnaG与ssDNA模板之间的相互作用。方法本研究以MtuDnaG的双结构域蛋白MtuP49(包含了锌指结合结构域和RNA聚合酶结构域)为研究对象,利用生物化学和生物物理学方法,研究MtuDnaG与含不同三联体的ssDNA模板之间的相互作用,鉴定MtuDnaG的特异性识别位点。结果5'-GCG/C-3'三联体可能是MtuDnaG结合模板ssDNA的特异性识别位点。此外,在结核分枝杆菌基因组的复制起始点附近也存在可以与MtuP49特异结合的5'-GCG/C-3'位点,其3'端侧翼序列显著影响ssDNA与MtuP49的亲和力。突变实验表明,位于锌指结合结构域中的Arg31对MtuP49结合ssDNA的活性具有重要贡献。基于预测的MtuP49结构,推测在MtuP49结合模板ssDNA过程中,锌指结合结构域会发生分子内重排。结论本研究首次鉴定了MtuDnaG结合模板ssDNA的特异性识别位点,揭示了影响MtuDnaG与模板ssDNA相互作用的主要因素。本文的研究结果不但有助于阐明MtuDnaG起始引物合成的机制,也为靶向DnaG的新型抗结核药物开发提供了新的信息。 展开更多
关键词 引物酶dnaG 结核分枝杆菌 特异性识别位点 结构域重排 dna复制
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DNA微阵列法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性 被引量：3
4
作者 赵静 王凤平 +2 位作者 孙清清 杨玉婷 陈蕾 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1651-1654,共4页
目的探讨DNA微阵列法在结核菌耐药基因快速检出中的应用价值。方法应用DNA微阵列法定性检测来源于临床疑似结核病患者痰液样本,检测利福平(RFP)和异烟肼(INH)的3个耐药相关基因rpo B、kat G及inh A基因启动子的野生型及不同突变型;采用B... 目的探讨DNA微阵列法在结核菌耐药基因快速检出中的应用价值。方法应用DNA微阵列法定性检测来源于临床疑似结核病患者痰液样本,检测利福平(RFP)和异烟肼(INH)的3个耐药相关基因rpo B、kat G及inh A基因启动子的野生型及不同突变型;采用BACTECTMMGIT 960培养仪进行结核分枝杆菌(M.tuberculosis)培养,阳性液体培养物用改良罗氏比例法进行药物敏感试验。结果 174份M.tuberculosis核酸阳性痰液标本中15份rpo B突变型,突变频率最高的位点是531,突变率66.7%;17份kat G/inh A突变型,其中12份是kat G位点的单一突变,突变率为70.6%。对照68例改良罗氏比例法药敏结果,DNA微阵列法检测RFP、INH耐药的符合率均达90%以上。结论 DNA微阵列法可快速准确地检测大部分疑似结核病临床样本的rpo B、kat G和inh A基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药,并在临床诊断中推广应用。 展开更多
关键词 dna微阵列 结核分枝杆菌 耐药性
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用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因突变的研究 被引量：2
5
作者 张俊仙 吴雪琼 +8 位作者 张琼 梁建琴 张洪恩 鲁红利 李洪敏 陆阳 杨华卫 阳幼荣 王全立 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期225-228,共4页
目的利用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变。方法根据结核分枝杆菌embB基因序列设计探针并制作DNA芯片,根据结核从分枝杆菌embB基因突变的热点片段设计引物,该片段用TAMRA荧光标记PCR扩增增后与DNA芯片杂交,同时以PCR... 目的利用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变。方法根据结核分枝杆菌embB基因序列设计探针并制作DNA芯片,根据结核从分枝杆菌embB基因突变的热点片段设计引物,该片段用TAMRA荧光标记PCR扩增增后与DNA芯片杂交,同时以PCR—SSCP和DNA测序法为对照。结果120株结核分枝杆菌临床分离株中,35株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；85株耐乙胺丁醇临床分离株中有50株检测到embB基因突变[58．8％(50／85)],均为306位密码子突变,该突变与PCR-SSCP和测序结果完全一致；85株耐药株中后有35株未检测到突变,占41．2％(35／85)。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株的embB基因突变,可协助临床医生制定合理的治疗方案,特别是复治患者,可帮助选择有效药物。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 乙胺丁醇 EMBB基因 dna芯片
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DNA微阵列芯片技术检测培阳肺结核患者痰样本中结核分枝杆菌耐药性的价值 被引量：5
6
作者 王悦 孙颖 孙炳奇 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期109-114,共6页
目的评价DNA微阵列芯片法(以下称芯片法)检测培养阳性患者痰样本的利福平和异烟肼相关耐药基因的效能。方法收集并检测389例疑似肺结核患者痰样,以BACTEC MGIT 960液体药敏(以下称MGIT 960药敏)为参考标准,评价芯片法检测样本利福平(RIF... 目的评价DNA微阵列芯片法(以下称芯片法)检测培养阳性患者痰样本的利福平和异烟肼相关耐药基因的效能。方法收集并检测389例疑似肺结核患者痰样,以BACTEC MGIT 960液体药敏(以下称MGIT 960药敏)为参考标准,评价芯片法检测样本利福平(RIF)、异烟肼(INH)耐药性和MDR-TB的灵敏度、特异度及一致性。应用线性探针耐药技术(GenoType MTBDRplus VER 2,0)对不一致的结果进行分析。结果将334例(334/389)MGIT 960培阳结果对应的痰处理液进行芯片法耐药检测,其中2例为非结核分枝杆菌,9例为阴性。与参考标准对比,芯片法对利福平耐药检测的灵敏度为92.4%,特异度为97.7%,Kappa值为0.90;异烟肼为82.6%,特异度为99.2%,Kappa值为0.86。在MDR-TB的病人中,芯片法与MGIT 960药敏法有较好的一致性;且在初治患者中Kappa值为0.95,灵敏度为95.5%,明显优于复治患者。结论线性探针耐药技术对22份不一致结果进行分析,认为检测限及耐药机制的差异、异质性耐药和多重感染等原因是导致基因型和表型或是两种分子法结果不一致的主要原因。应用芯片法检测培阳患者痰样本的利福平和异烟肼的相关耐药基因,与MGIT 960药敏法相比较具有较好的灵敏度、特异度和一致性,可快速检测出患者耐药情况和MDR-TB患者,为临床患者尤其是初治患者提供了快速有效的化疗参考方案。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 dna微阵列芯片法 MDR-TB 耐药
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快速DNA提取环介导等温扩增技术检测结核分枝杆菌的成本分析 被引量：1
7
作者 欧喜超 夏辉 +7 位作者 李强 逄宇 赵冰 张治英 李俊晨 章建康 池俊英 赵雁林 《中国防痨杂志》 CAS 2014年第7期596-599,共4页
结核病的早期诊断，对于很好地控制结核病的传播具有十分重要的意义。固体培养具有很高的诊断价值，但耗时较长，至少需要6～8周的时间。近年来涌现出很多新的技术和方法用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定。然而除了检测效能，检测成本... 结核病的早期诊断，对于很好地控制结核病的传播具有十分重要的意义。固体培养具有很高的诊断价值，但耗时较长，至少需要6～8周的时间。近年来涌现出很多新的技术和方法用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定。然而除了检测效能，检测成本也是制约各种技术或方法能否推广的决定性因素之一。结核分枝杆菌快速DNA提取环介导等温扩增检测技术（procedure for ultra rapid extraction of loop-mediated isothermal amplification, PURE-LAMP；Eiken Chemical，日本）是一种基于分子生物学原理的快速检测试剂盒，整个试剂盒采用封闭的反应体系，在反应体系内加入2条内引物和2条外引物， 展开更多
关键词 环介导等温扩增 结核分枝杆菌 dna提取 技术检测 成本分析 快速检测试剂盒 分子生物学原理 反应体系
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结核分枝杆菌利福平耐药的分子机制及检测技术 被引量：1
8
作者 杨国元 黄福岚 杨彩虹 《畜牧兽医科技信息》 2024年第3期24-26,共3页
结核病是一种由结核分枝杆菌引起的人畜共患病,长期以来不仅给人类健康产生巨大威胁,也给养殖场(户)造成巨大的经济损失。利福平作为一个关键性药物,在结核病漫长的治疗历程中发挥了里程牌作用,但随着药物的使用,结核分支杆菌对利福平... 结核病是一种由结核分枝杆菌引起的人畜共患病,长期以来不仅给人类健康产生巨大威胁,也给养殖场(户)造成巨大的经济损失。利福平作为一个关键性药物,在结核病漫长的治疗历程中发挥了里程牌作用,但随着药物的使用,结核分支杆菌对利福平的耐药性愈发普遍,给结核病治疗带来了挑战。本文对结核分枝杆菌利福平耐药的机制及检测技术做一简单概述,以期为临床上治疗结核病制定合理用药方案提供参考。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 利福平 耐药 分子机制 耐药检测
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DNA指纹技术检测耐多药结核分枝杆菌的应用研究
9
作者 周琳 谭守勇 +6 位作者 唐林国 梁志强 刘志辉 陈其琛 蔡杏珊 黎意芬 李妙琼 《中国防痨杂志》 CAS 2007年第6期502-507,共6页
目的 应用结核分枝杆菌DNA指纹技术,了解耐多药结核分枝杆菌的基因型状况并探讨耐多药结核病的分子流行病学.方法 以结核分枝杆菌插入序列IS6110序列为模板,设计一对特异外向引物,建立一种结核分枝杆菌DNA指纹技术方法,对临床标本中分离... 目的 应用结核分枝杆菌DNA指纹技术,了解耐多药结核分枝杆菌的基因型状况并探讨耐多药结核病的分子流行病学.方法 以结核分枝杆菌插入序列IS6110序列为模板,设计一对特异外向引物,建立一种结核分枝杆菌DNA指纹技术方法,对临床标本中分离的220株耐多药结核分枝杆菌进行DNA指纹基因分析.同时对实验数据进行聚类分析,进行耐多药结核病分子流行病学研究.结果 根据结核分枝杆菌DNA指纹图谱分析,220株耐多药结核分枝杆菌均产生特征DNA指纹图谱,DNA指纹图谱变异很大.每一菌株DNA指纹的拷贝数介于3至18之间.其中大部分菌株,即205株(93.2%)包含6～13个拷贝,平均为11个带.这205株DNA指纹图谱中,162株为特异的,提示它们在流行病学上是独立的.有58株(26.4%)指纹图谱组成了15个簇,每簇2～8株,它们的IDNA指纹图谱相同,可能代表了近期的传播.尤其是在此DNA指纹图谱中,其中分子量为200 bp扩增带频率最大,在220株耐多药结核分枝杆菌均出现.结论 结核杆菌DNA指纹技术检测可应用耐多药结核分枝杆菌DNA指纹图谱分型,并可用于耐多药结核病分子流行病学调查. 展开更多
关键词 抗药性 多药 分枝杆菌 结核 印迹法 dna
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结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测 被引量：15
10
作者 谢芝勋 谢志勤 +5 位作者 雷剑明 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢丽基 温娟 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1141-1144,共4页
目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分... 目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,测定其特异性和敏感性,并对238份牛临床样品的DNA分别进行了检测。结果该方法对牛分枝杆菌能扩增出838bp和631bp的特异性基因片段,结核分枝杆菌只扩增出838bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段,对参试的其它牛菌株的DNA扩增结果均为阴性。敏感度检测可达到50pg的DNA含量。临床样品检测结核分枝杆菌阳性有21份,牛分枝杆菌阳性有1份,其它临床样品扩增结果全部为阴性。结论本方法可作为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。 展开更多
关键词 检测 结核分枝杆菌 牛分枝杆菌 二重PCR
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结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答 被引量：8
11
作者 柏银兰 薛莹 +5 位作者 王丽梅 樊爱琳 张薇 康健 何俊杰 徐志凯 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期418-421,494,共5页
目的研究结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法用表达MPT64的真核表达质粒pcDNA-M免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12... 目的研究结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法用表达MPT64的真核表达质粒pcDNA-M免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、流式细胞仪计CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应。结果MPT64基因免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖显著,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+细胞和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显。结论MPT64 DNA疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗的组分。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 MPT64 dna 免疫应答
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结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果研究 被引量：9
12
作者 梁艳 吴雪琼 +5 位作者 张俊仙 阳幼荣 王兰 李洪敏 李忠明 史迎昌 《中国防痨杂志》 CAS 2007年第5期382-385,共4页
目的研究结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌高耐利福平低耐异烟肼临床分离株HB240尾静脉注射BALB/c小鼠1个月后,将小鼠随机分成2组,第1组用利福平(RFP)、异烟肼(... 目的研究结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌高耐利福平低耐异烟肼临床分离株HB240尾静脉注射BALB/c小鼠1个月后,将小鼠随机分成2组,第1组用利福平(RFP)、异烟肼(INH)治疗12周,第2组用RFP、INH和结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗(免疫5次)联合治疗12周;治疗结束后4和8周,分别取肺、肝和脾观察病理改变、称取质量、作菌落计数。结果治疗结束后4和8周,第2组小鼠体质量均超过第1组,但无显著性差异(P>0.05)。治疗结束后4周,第2组肺、脾脏指数(0.017,0.011)均略低于第1组(0.020,0.012)(P>0.05);治疗结束后8周,第2组肺、肝脏指数(0.021,0.047)均略低于第1组(0.022,0.048)(P>0.05);而第2组脾脏指数(0.008)显著低于第1组(0.012)(P<0.05)。治疗结束后4周,第2组有4例脾脏未见明显病变,第1组仅1例脾脏未见明显病变;治疗结束后8周,第2组有1例肺门淋巴结肿大,而第1组有3例;第2组有5例脾脏未见明显病变,第1组仅2例脾脏未见明显病变。治疗结束后4周,第2组肺菌落计数和脾菌落计数比第1组显著减少,分别减少70%和80%。结论DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病疗效高于单纯化疗。 展开更多
关键词 dna疫苗 分枝杆菌 结核
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牛副结核分枝杆菌LAMP快速检测方法的建立 被引量：12
13
作者 王建峰 黄素文 +6 位作者 刘思国 倪建波 王春 张吉红 于纪棉 朱堂明 黄绍棠 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期555-557,共3页
为建立牛副结核分枝杆菌(MAP)的快速检测方法,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,以MAP的IS900基因序列为靶基因设计特异性引物,建立了MAP特异性的LAMP快速检测方法。经反应条件优化,检测结果显示,建立的LAMP检测方法具有良好的特异性... 为建立牛副结核分枝杆菌(MAP)的快速检测方法,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,以MAP的IS900基因序列为靶基因设计特异性引物,建立了MAP特异性的LAMP快速检测方法。经反应条件优化,检测结果显示,建立的LAMP检测方法具有良好的特异性,最低见测量为0.53 pg;与其他病原菌无任何交叉反应。临床样品检测与行业标准的符合率为100%。该LAMP检测方法可以用于MAP的常规检疫。 展开更多
关键词 牛副结核分枝杆菌 环介导等温扩增 检测
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高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测 被引量：14
14
作者 杨彩虹 杨敏 +4 位作者 于璐 包海洋 吴长新 曹旭东 陈创夫 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期403-412,共10页
目的评价高分辨率熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve,HRM)检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法 1)通过传统比例法药敏实验对本实验室保存的49株结核分枝杆菌进行异烟肼耐药性分析。2)进一步对该结核分枝杆菌进... 目的评价高分辨率熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve,HRM)检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法 1)通过传统比例法药敏实验对本实验室保存的49株结核分枝杆菌进行异烟肼耐药性分析。2)进一步对该结核分枝杆菌进行异烟肼耐药相关基因KatG基因和inhA基因进行异烟肼耐药决定区测序分析,筛查突变位点。3)根据筛查到的突变位点设计高分辨率熔解曲线分析所用的特异性引物,对异烟肼耐药基因耐药决定区进行高分辨率熔解曲线分析检测DNA突变,评估用高分辨率熔解曲线分析技术对结核分枝杆菌异烟肼耐药性检测的效率。结果 1)比例法药敏结果显示,49株实验菌株中20株为异烟肼耐药株,29株为异烟肼敏感株。2)测序分析结果显示:(1)KatG基因出现了4种突变形式,分别是234单位点突变;234、315双位点突变;234、463双位点突变;234、315、463三位点联合突变。(2)inhA基因检测到3种突变,即-8位、-15位、-152位。3)(1)对耐药株的基因突变进行分析发现:20株异烟肼耐药株中11株存在KatG基因第315位密码子的突变、占异烟肼耐药株的55%;6株存在inhA基因-15(4株)位碱基、-8(1株)位碱基、-152(1株)位碱基的突变,共占异烟肼耐药株的30%;2株同时存在基因KatG315密码子和inhA-15位碱基的突变,占异烟肼耐药株的10%;1株均未检测到KatG基因和inhA基因的突变,占异烟肼耐药株的5%。通过基因突变检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的敏感性为95%、特异性为100%。(2)用高分辨率溶解曲线检测实验菌株耐药基因突变的结果显示,18株存在基因突变,24株不存在基因突变,检测的灵敏度为94.7%、特异性为80%。(3)以高分辨率熔解曲线检测到突变为耐药的判断标准,检出19株为耐药株,24株为敏感株。以比例法药敏结果为参照,检测的灵敏度为95%、特异性为82.76%。结论高分辨率溶解曲线用于结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的检测具有较好的灵敏度,耗时短,在异烟肼耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 高分辨率熔解曲线(HRM) dna测序 耐药性 异烟肼
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结核分枝杆菌基因突变检测方法研究进展 被引量：15
15
作者 柳正卫 黄玉 赵雁林 《中国防痨杂志》 CAS 2013年第9期748-751,共4页
结核分枝杆菌全基因组测序工作的完成,为开展结核病基因研究提供了理论基础,对结核分枝杆菌基因突变的研究也成为当前结核病研究领域的热点之一。高分辨率熔解(high-resolution melting,HRM)、基因芯片、DNA直接测序等分子生物学新技术... 结核分枝杆菌全基因组测序工作的完成,为开展结核病基因研究提供了理论基础,对结核分枝杆菌基因突变的研究也成为当前结核病研究领域的热点之一。高分辨率熔解(high-resolution melting,HRM)、基因芯片、DNA直接测序等分子生物学新技术的发展和应用,为结核分枝杆菌基因突变研究提供了更有效的方法。现综合国内外近年来的文献,分类介绍应用于结核分枝杆菌基因突变检测的各种方法的原理、应用情况等,同时也对GeneXpert、结核分枝杆菌线性探针(line probe assay,LiPA)、基因芯片等当前比较成熟并有望得到广泛应用的商品化基因突变检测技术进行介绍。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 突变 序列分析 dna 寡核苷酸序列分析
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应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌链霉素耐药性的研究 被引量：4
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作者 张俊仙 吴雪琼 +2 位作者 邢婉丽 梁艳 阳幼荣 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1046-1048,1053,共4页
目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐链霉素rpsl和rrs基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpsl和rrs基因序列设计探针并制作DNA芯片,用TAMRA(四甲基罗丹明)标记的引物扩增结核分枝杆菌rpsl和rrs基因突变热点的片段,与DNA芯... 目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐链霉素rpsl和rrs基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpsl和rrs基因序列设计探针并制作DNA芯片,用TAMRA(四甲基罗丹明)标记的引物扩增结核分枝杆菌rpsl和rrs基因突变热点的片段,与DNA芯片杂交,同时以聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和DNA测序法为对照。结果144株结核分枝杆菌临床分离株中,42株链霉素敏感株的PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同;102株链霉素耐药株中有79株检测到rpsl基因突变77.5%(79/102),其中74株为43位密码子AAG→AGG突变,5株为88位密码子AAG→AGG突变;rrs基因突变5%(5/102),4株为513位密码子A→C突变,1株为516位密码子C→T突变,均与PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果一致,余18株未检测到突变。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐链霉素分离株的rpsl和rrs基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 链霉素 RPSL rrs 药物耐受性 dna芯片
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结核分枝杆菌ESAT6、CFP10基因DNA疫苗对小鼠免疫原性的初步研究 被引量：4
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作者 王慧勤 李跃峰 +6 位作者 李志强 温书香 陈鹏博 赵庆亮 纪太旺 曹旭东 陈创夫 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期458-463,共6页
目的研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果。方法以构建的真核表达载体pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为:生理盐水组(SLYS)、卡介苗组(KJM)、pEGFP-N1... 目的研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果。方法以构建的真核表达载体pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为:生理盐水组(SLYS)、卡介苗组(KJM)、pEGFP-N1组(P-N1)、pEGFP-N1-ESAT6组(P-N1-E)、pEGFP-N1-CFP10组(P-N1-C)、卡介苗加pEGFP-N1组(K+P-N1)、卡介苗加pEGFP-N1-ESAT6组(K+P-N1-E)和卡介苗加pEGFP-N1-CFP10组(K+P-N1-C)。每只小鼠皮内注射100μL卡介苗,每只小鼠肌肉注射50μg质粒,每组共注射3次。以纯化的ESAT6、CFP10蛋白作为抗原,用DOT-ELISA方法检测小鼠血清中的抗体;用ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ的变化。结果免疫3次后的小鼠血清中检测到针对CFP10蛋白的抗体,未检测到针对ESAT6蛋白的抗体。但二者血清中IFN-γ水平都有显著上升,K+P-N1-C和K+P-N1-E免疫3次后,测得的IFN-γ平均含量为(107.591±7.3281)pg/mL和(95.7503±9.0184)pg/mL,显著高于免前、一免、二免(P<0.01)。结论结核分枝杆菌ESAT6,CFP10基因DNA疫苗和卡介苗联合应用后可诱导小鼠产生有效的细胞免疫应答,为DNA疫苗的研究奠定一定的基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ESAT6 CFP10 dna疫苗 卡介苗
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应用基因芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药基因的研究 被引量：13
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作者 李锋 李凫坚 +1 位作者 陈园园 王静 《中国防痨杂志》 CAS 2011年第3期188-189,共2页
在全球范围内,结核分枝杆菌耐药率不断上升,高耐药和耐多药菌株不断出现和传播,对化疗疗效及结核病流行产生很大影响。利福平（RFP）作为1种主要的抗结核药物,对其耐药常常导致化疗失败。快速检测RFP耐药菌株对了解细菌耐药性有较大意... 在全球范围内,结核分枝杆菌耐药率不断上升,高耐药和耐多药菌株不断出现和传播,对化疗疗效及结核病流行产生很大影响。利福平（RFP）作为1种主要的抗结核药物,对其耐药常常导致化疗失败。快速检测RFP耐药菌株对了解细菌耐药性有较大意义。我们收集了76株临床分离RFP耐药菌株，扩增rpoB基因的核心位点，并进行自主设计DNA芯片检测，并进行DNA直接测序，了解本地区耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因的突变特征。 展开更多
关键词 耐利福平结核分枝杆菌 耐药基因 快速检测 基因芯片 dna直接测序 RPOB基因 应用 耐药菌株
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结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA抗结核免疫效应的初步研究 被引量：4
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作者 张万江 吴芳 +3 位作者 王萍 吴江东 李蕾 杜燕 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1534-1537,共4页
目的:探讨小鼠皮内注射结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA后,小鼠腹腔巨噬细胞是否被激活以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达,比较研究结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA和卡介苗菌激活小鼠腹腔... 目的:探讨小鼠皮内注射结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA后,小鼠腹腔巨噬细胞是否被激活以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达,比较研究结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA和卡介苗菌激活小鼠腹腔巨噬细胞的抗结核免疫应答过程及免疫效应。方法:用结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA、卡介苗菌和生理盐水分别皮内注射小鼠第30d、60d后,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、H2O2以及IL-12、TNF-α的表达。结果:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌表达IL-12和TNF-α,与卡介苗菌组相比较无明显差异;与生理盐水组比较差异显著(P<0.05)。结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA皮内接种小鼠后也能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、H2O2,与卡介苗菌组相比较无明显差异,与未免疫组比较差异显著(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株基因组DNA小鼠皮内接种后,能诱导小鼠腹腔巨噬细胞活化并产生较强的抗结核免疫效应,且该效应与卡介苗菌无明显差异。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 H37Ra菌株 基因组dna 抗结核
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结核分枝杆菌四价DNA疫苗免疫原性和保护效率研究 被引量：6
20
作者 顾田园 蔡宏 +2 位作者 田霞 余大海 朱玉贤 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第4期347-352,共6页
对结核杆菌四价DNA疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价.用编码结核分枝杆菌Ag85B、MPT64、MPT70和PstS-3等4种抗原蛋白的基因分别构建的单价DNA疫苗混合成四价苗免疫小鼠.3次免疫后21天,四种抗原特异性抗体滴度分别达到1:6 400、1:51 ... 对结核杆菌四价DNA疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价.用编码结核分枝杆菌Ag85B、MPT64、MPT70和PstS-3等4种抗原蛋白的基因分别构建的单价DNA疫苗混合成四价苗免疫小鼠.3次免疫后21天,四种抗原特异性抗体滴度分别达到1:6 400、1:51 200、1:6 400、1:6 400.四种蛋白质均能诱导脾脏细胞产生较高水平的抗原特异性IFN-γ,浓度分别为10 582.14 ng/L、13 635.97 ng/L、14 213.15 ng/L和9 657.35 ng/L.三次免疫后经静脉强毒攻击,四价苗组小鼠肺脏和脾脏的载菌数分别减少到阴性组的1/650和1/130.对肺组织的病理形态特征观察表明,空载体免疫的小鼠肺部严重损伤,肺实质干酪样坏死,坏死结节占肺实质的70%～80%,而四价苗免疫的小鼠,肺组织结构正常,肺泡轮廓清晰.研究首次证实,Ag85B、MPT64、MPT70和PstS-3 4种结核杆菌抗原蛋白编码基因组成的四价DNA疫苗,具有很高的免疫应答水平和保护效率. 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 抗原蛋白 四价dna疫苗 免疫原性 保护效率
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