结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

1

作者 黄浩 黄汉菊 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期49-51,共3页

目的构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体,为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中,扩增出HSP65的编码基因,从T... 目的构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体,为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中,扩增出HSP65的编码基因,从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因,经相应限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1/His,并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞,用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果获得正向插入的pcDNA3.1/His-HSP65-G2重组表达质粒,表达产物的相对分子量为105 kD,与理论预期大小一致,并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3.1/His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 热休克蛋白65 汉坦病毒 G2糖蛋白

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结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp70在原核表达载体中的克隆表达与鉴定 被引量：2

2

作者 苏洁 蔡宏 朱玉贤 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期712-715,共4页

目的对结核分枝杆菌的一种热休克蛋白Hsp70基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达。方法以结核杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因Hsp70进行扩增,产物与载体质粒pET-22b(+)构建表达Hsp70的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coli... 目的对结核分枝杆菌的一种热休克蛋白Hsp70基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达。方法以结核杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因Hsp70进行扩增,产物与载体质粒pET-22b(+)构建表达Hsp70的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coliDH5α内提取质粒,酶切鉴定,再转化入表达宿主E.coliBL21(DE3)PlysS菌株内,对转化菌株以IPTG进行诱导后,破菌,离心,上清进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫印迹分析。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,所表达的蛋白质相对分子质量为70 000,抗体检测有特异带大小为70kDa。结论成功进行了结核杆菌分泌热休克蛋白Hsp70基因的克隆表达。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 热休克蛋白 载体 克隆 表达与鉴定

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结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3分泌表达模型的建立及鉴定 被引量：3

3

作者 董江涛 徐芳 +6 位作者 田玺择 姚楠 吴芳 章乐 王远志 曹旭东 张万江 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2012年第2期198-201,共4页

为了建立及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3分泌表达的模型。采用将0.3mL浓度约为1.0×107个/mL结核分枝杆菌菌悬液经昆明小鼠尾静脉注射,复制结核分枝杆菌感染小鼠模型,经鉴定小鼠... 为了建立及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3分泌表达的模型。采用将0.3mL浓度约为1.0×107个/mL结核分枝杆菌菌悬液经昆明小鼠尾静脉注射,复制结核分枝杆菌感染小鼠模型,经鉴定小鼠感染模型复制成功后第15天,进行小鼠肺泡的灌洗,收集小鼠肺泡灌洗液,获取感染小鼠肺泡巨噬细胞,以提取的感染小鼠肺泡巨噬细胞内的结核分枝杆菌基因组DNA为模版PCR扩增结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3的基因,同时进一步利用激光共聚焦显微镜观察小鼠肺泡巨噬细胞的方法进行研究。PCR结果证实感染结核分支杆菌的巨噬细胞内有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的基因表达;同时激光共聚焦显微镜下可见感染小鼠肺泡巨噬细胞内吞噬有大量结核分枝杆菌,并且证实有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的分泌表达。成功建立了结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3分泌表达的模型。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 肺泡巨噬细胞 结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3 表达 模型

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结核杆菌热休克蛋白70刺激表位在融合基因疫苗中的佐剂作用 被引量：2

4

作者 段秀梅 邹亚斌 +4 位作者 马洪喜 李树蕾 王银萍 王超 李玉琴 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期506-511,共6页

目的:探讨结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)的刺激表位在肝细胞癌相关抗原661(HCA661)融合基因疫苗pCI-HCA661-mtHSP70中的佐剂作用,为提高基因疫苗的免疫效果提供依据。方法:18只BALB/c小鼠随机分为pCI-neo组、pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组... 目的:探讨结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)的刺激表位在肝细胞癌相关抗原661(HCA661)融合基因疫苗pCI-HCA661-mtHSP70中的佐剂作用,为提高基因疫苗的免疫效果提供依据。方法:18只BALB/c小鼠随机分为pCI-neo组、pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组,每组6只,分别肌肉注射100μg空质粒pCI-neo、重组质粒pCI-HCA661-mtHSP70C和pCI-HCA661-mtHSP70E,流式细胞术分析小鼠脾T细胞亚群变化;ELISA法检测体外培养脾细胞上清中干扰素γ(IFNγ)的含量及免疫小鼠血清中HCA661特异性抗体的滴度;体外特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤试验观察融合基因疫苗对肿瘤细胞的抑制作用。结果:pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+T淋巴细胞的百分比和CD4+/CD8+比值与pCI-neo组比较差异有统计学意义(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+百分比和CD4+/CD8+比值均高于pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组,差异有统计学意义(P<0.05);在抗原肽刺激下,pCI-HCA661-HSP70E免疫组小鼠脾细胞培养上清中IFNγ含量较pCI-mtHCA661-HSP70C免疫组明显提高(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组IFNγ含量均高于pCI-neo组(P<0.05)。pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组诱导的HCA661特异性抗体水平较pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组显著增高(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组可以产生更强的CTL抗肿瘤效应。结论:mtHSP70刺激表位可以诱导机体对HCA661融合基因疫苗的特异性免疫应答,发挥更强的佐剂作用。 展开更多

关键词 融合基因疫苗 肝细胞癌相关抗原661 结核分枝杆菌热休克蛋白70 基因佐剂

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结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白影响小鼠巨噬细胞自噬形成的实验研究 被引量：12

5

作者 师长宏 江鹰 +4 位作者 赵勇 毛峰峰 张彩琴 白冰 张海 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1301-1303,共3页

目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用。方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬... 目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用。方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,抗酸染色观察胞内细菌形态,计数MTB的菌落数。提取巨噬细胞总蛋白,Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3表达水平的变化。结果:雷帕霉素诱导巨噬细胞形成自噬后感染结核分枝杆菌可使胞内细菌局限化,加入Hsp16.3蛋白可明显抑制了自噬体的形成,影响了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存,显著增加了细菌的菌落形成单位,降低了自噬相关蛋白LC3的表达(P<0.05)。结论:Hsp16.3蛋白可能通过调节Atg8的表达水平抑制自噬体的形成。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 自噬 热休克蛋白Hsp16.3 微管相关蛋白轻链3

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结核分枝杆菌HSP65与IL-2融合蛋白的表达和纯化 被引量：6

6

作者 王丽梅 师长宏 +4 位作者 张海 薛莹 柏银兰 高辉 徐志凯 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期801-804,共4页

目的获得融合表达的结核分枝杆菌热休克蛋白65与人白细胞介素2的重组蛋白,为进一步研究其对结核疫苗的作用奠定基础。方法用PCR的方法分别从H37Rv DNA和质粒pGEM-Teasy-IL-2中扩增目的基因片段hsp65和IL-2,将各目的片段克隆至pMD18-T载... 目的获得融合表达的结核分枝杆菌热休克蛋白65与人白细胞介素2的重组蛋白,为进一步研究其对结核疫苗的作用奠定基础。方法用PCR的方法分别从H37Rv DNA和质粒pGEM-Teasy-IL-2中扩增目的基因片段hsp65和IL-2,将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序,将测序正确的目的基因片段分别经EcoRI和ClaI,ClaI和HindⅢ双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EX HTa,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,经IPTG诱导后进行融合表达,并通过镍柱对融合蛋白进行纯化。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE和Western-blot分析,在Mr 78000处有特异性的蛋白表达条带。用镍柱进行亲和层析纯化后得到了高纯度的HSP65-IL-2融合蛋白。结论成功的构建了结核分枝杆菌HSP65与人IL-2的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,有望为结核的预防提供有效的疫苗。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 热休克蛋白65 白细胞介素2 表达 纯化

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结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达 被引量：3

7

作者 叶菁 隋延仿 +1 位作者 陈广生 张秀敏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期443-445,共3页

目的 :克隆结核杆菌热休克蛋白 70 (TBhsp70 )基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因 ,并将其克隆到pUC19中 ,进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组表达质粒pGEX TBhs... 目的 :克隆结核杆菌热休克蛋白 70 (TBhsp70 )基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因 ,并将其克隆到pUC19中 ,进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组表达质粒pGEX TBhsp70 ,在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果 :成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实 ,与GenBank公布的序列一致。含pGEX TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,能够表达相对分子质量 (Mr)约为 96 0 0 0的融合蛋白。结论 :获得了TBhsp70基因 ,成功地构建了原核表达质粒pGEX TBhsp70 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为其相关研究奠定了一定的基础。 展开更多

关键词 结核杆菌 热休克蛋白 克隆 原核表达

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结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建 被引量：3

8

作者 曾曙光 张积仁 +4 位作者 章锦才 吴世卿 刘启才 艾伟健 薛国初 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期433-436,445,共5页

目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物... 目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列。将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒。将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒。Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Westernblot检测mtHSP70蛋白表达情况。结果酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达。结论含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础。 展开更多

关键词 结核杆菌 热休克蛋白70 增强型绿色荧光蛋白 真核表达 免疫治疗 肿瘤

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结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白稳定表达细胞系的建立 被引量：1

9

作者 师长宏 张海 +3 位作者 席丽 王晓武 王丽梅 赵勇 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期718-721,共4页

目的构建了表达结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的P815细胞系。方法将Hsp65与IL-2基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒Hsp65-IL-2-pcDNA3.1。在阳离子... 目的构建了表达结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的P815细胞系。方法将Hsp65与IL-2基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒Hsp65-IL-2-pcDNA3.1。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB/c遗传背景一致的P815(H-2d)细胞。G418筛选抗性克隆,免疫荧光检测融合蛋白的表达。结果真核质粒转染的阳性克隆细胞,经RT-PCR检测到Hsp65与IL-2融合蛋白mRNA水平的表达,分别用抗Hsp65和IL-2的单抗进行间接免疫荧光检测,可在转染重组质粒的P815细胞膜上观察到较强的绿色荧光。结论获得表达Hsp65与IL-2融合蛋白的稳定细胞系,为其CTL研究提供了合适的靶细胞。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 真核表达 热休克蛋白65 白细胞介素2 融合蛋白

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人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定 被引量：5

10

作者 程继忠 梁驹卿 +2 位作者 肖红 海涛 皇甫永穆 《同济医科大学学报》 CSCD 1997年第5期331-335,共5页

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆... 用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。 展开更多

关键词 结核杆菌 卡介苗 启动子 热休克蛋白

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人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定 被引量：1

11

作者 高红 戴五星 +4 位作者 黄海浪 陈智浩 梁靓 程继忠 皇甫永穆 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期243-246,251,共5页

目的　构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法　用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 p... 目的　构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法　用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果　酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论　成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。 展开更多

关键词 HSP65 BCG 结核杆菌 热休克蛋白 高效表达 重组卡介苗 质粒 信号肽 重组体 基因

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人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达 被引量：1

12

作者 党育平 王刚 +3 位作者 范雪莉 沈柱 樊建勇 刘玉峰 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期208-210,共3页

目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插... 目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 人乳头瘤病毒6型 E7蛋白 结核杆菌 热休克蛋白70 融合基因 原核表达

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共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响(R68) 被引量：1

13

作者 张元豫 刘霞 +2 位作者 李坤 郭永荣 白靖平 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期755-760,788,共7页

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/... 目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为7.410±1.738、8.844±1.981、22.4272±2.058、2.445±0.2517(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。 展开更多

关键词 重组结核杆菌热休克蛋白10 破骨细胞生成 共培养 核因子KB受体活化因子配体 活化T细胞核因子1蛋白 护骨素 C-Fos

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结核分枝杆菌Hsp16.3刺激小鼠巨噬细胞向M2分化 被引量：8

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作者 李姗姗 秦欢 +6 位作者 丁陈波 李龙梅 刘梅 李娜娜 张继东 徐林 罗军敏(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1595-1600,共6页

目的:探讨结核分枝杆菌热休克蛋白16.3(Mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3,MTB Hsp16.3)在体外细胞水平对小鼠骨髓来源M1型巨噬细胞的影响作用。方法:从BALB/c小鼠的胫股骨中取骨髓细胞,与GM-CSF共培养获取骨髓来源... 目的:探讨结核分枝杆菌热休克蛋白16.3(Mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3,MTB Hsp16.3)在体外细胞水平对小鼠骨髓来源M1型巨噬细胞的影响作用。方法:从BALB/c小鼠的胫股骨中取骨髓细胞,与GM-CSF共培养获取骨髓来源的M0型巨噬细胞,流式检测CD11b和F4/80的表达;分别用IFN-γ、IL-4诱导M0型巨噬细胞,光镜下观察细胞形态,荧光定量PCR、ELISA检测各组细胞IL-12、TNF-α、i NOS、IL-10、TGF-β、Arg-1的表达情况,构建小鼠骨髓来源M1/M2型巨噬细胞的技术平台;用MTB Hsp16.3刺激M0、M1型巨噬细胞,分别孵育24、48、72、96 h,采用ELISA、qRT-PCR检测不同时间点细胞培养液上清和细胞内的IL-12、TNF-α、i NOS、IL-10、IL-4、TGF-β、Arg-1的表达情况。结果:光镜下观察M0型巨噬细胞形态不规则,细胞伪足较短;M1型巨噬细胞形状呈长梭形,并有伪足伸出现,突触很长;M2型巨噬细胞伪足较短,细胞整体形态较为收拢。FCM检测有90%以上的骨髓细胞细胞具有CD11b和F4/80双阳性的特征。ELISA和qRT-PCR检测发现,M1型巨噬细胞高表达IL-12、TNF-α、i NOS;M2型巨噬细胞高表达IL-4、TGF-β、IL-10、Arg-1。MTB Hsp16.3刺激巨噬细胞后,M0和M1型巨噬细胞均高表达IL-10、TGF-β,低表达TNF-α、i NOS,且在48-72 h增加或降低的水平达到峰值。结论:成功诱导了小鼠骨髓来源的M1、M2型巨噬细胞;MTB Hsp16.3促进M1型巨噬细胞高表达M2型相关的细胞因子,可促进M1型巨噬细胞向M2型样巨噬细胞转换。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 巨噬细胞 结核分枝杆菌热休克蛋白16.3

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结核分支杆菌热休克蛋白65kD在大肠杆菌中表达

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作者 何秀云 庄玉辉 《中国防痨杂志》 CAS 北大核心 2002年第5期245-248,共4页

目的　构建能表达结核分支杆菌热休克蛋白 6 5kD的工程菌。方法　设计引物并PCR扩增 ,目的基因克隆并转化 ,重组子经酶切和自动测序鉴定 ,阳性重组子转化表达宿主菌并受化学诱导后表达重组 6 5kD蛋白。结果　 6 5kD蛋白编码基因约 1.6k... 目的　构建能表达结核分支杆菌热休克蛋白 6 5kD的工程菌。方法　设计引物并PCR扩增 ,目的基因克隆并转化 ,重组子经酶切和自动测序鉴定 ,阳性重组子转化表达宿主菌并受化学诱导后表达重组 6 5kD蛋白。结果　 6 5kD蛋白编码基因约 1.6kb ,重组子单酶切和双酶切证明目的基因插入载体 ,3个测序反应覆盖 99.1%目的基因 ;大肠杆菌表达重组 6 5kD蛋白。结论　大肠杆菌表达系统是一种快速、简便获得单一结核分支杆菌抗原的途径。 展开更多

关键词 结核分支杆菌 热休克蛋白 表达 65kd 大肠杆菌 免疫学

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结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的高效自发再折叠和再组装 被引量：5

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作者 毛启龙 冯修光 昌增益 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第1期87-90,共4页

来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3以九聚体的形式存在 .用三种不同的强变性条件 (10 0℃加热15min ,12mol/L脲或 8mol/L盐酸胍处理 4h)将Hsp16 3变性 ,然后通过冷却或透析使之复性 ,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色... 来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3以九聚体的形式存在 .用三种不同的强变性条件 (10 0℃加热15min ,12mol/L脲或 8mol/L盐酸胍处理 4h)将Hsp16 3变性 ,然后通过冷却或透析使之复性 ,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色性光谱比较了变性 复性前后Hsp16 3的各个层次高级结构 .结果显示 ,变性的Hsp16 3几乎可以完全恢复至天然构象 ,这表明小分子热休克蛋白Hsp16 3具有很强的自发折叠和组装能力 . 展开更多

关键词 热休克蛋白 变性 复性 再折叠 再组装 结核杆菌 HSP16.3 小分子

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Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏感染中的作用 被引量：1

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作者 张彩勤 师长宏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期493-497,共5页

结核病(Tuberculosis,TB)主要是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的细菌感染性疾病.当宿主免疫力减弱,潜伏感染的Mtb得以复苏,导致TB感染的复发.巨噬细胞自噬作为宿主先天性和适应性免疫反应的重要组成部分,在保护宿主... 结核病(Tuberculosis,TB)主要是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的细菌感染性疾病.当宿主免疫力减弱,潜伏感染的Mtb得以复苏,导致TB感染的复发.巨噬细胞自噬作为宿主先天性和适应性免疫反应的重要组成部分,在保护宿主抗Mtb感染方面发挥着重要作用.热休克蛋白16.3(Hsp16.3)是Mtb潜伏感染(LTBI)期间表达的重要蛋白,它可能通过抑制巨噬细胞自噬而维持Mtb长期生存,从而导致LTBI的发生.本文综述了Hsp16.3在LTBI中调控巨噬细胞自噬的作用,期望Hsp16.3能够成为LTBI的生物标志物和抗结核药物的新靶点. 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 潜伏感染 自噬 热休克蛋白16.3

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用结核分枝杆菌HSP70启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒的研究

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作者 陈全 朱道银 +2 位作者 骆旭东 蒋英 江山 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2003年第6期697-700,共4页

目的 :用结核分枝杆菌HSP70 (Heatshockprotein70 ,HSP70 )启动子改建分枝杆菌穿梭质粒 pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒。方法 :利用聚合酶链反应 (Polymerasechainreaction ,PCR)扩增H37Rv基因组 4 196 0 7～ 4 19835位的HSP70启动子及... 目的 :用结核分枝杆菌HSP70 (Heatshockprotein70 ,HSP70 )启动子改建分枝杆菌穿梭质粒 pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒。方法 :利用聚合酶链反应 (Polymerasechainreaction ,PCR)扩增H37Rv基因组 4 196 0 7～ 4 19835位的HSP70启动子及调控序列 ,末端引入一个多克隆位点 (Multipleclonesites ,MCS) ,再定向克隆入 pJEM 11的ApaI位点与XbaI位点之间 ,构建pJCH0 2载体 ,并对载体进行酶切鉴定及序列测定。将lhp -esat6融合基因克隆入 pJCH0 2载体 ,评价其在BCG中的表达情况。结果 :HSP70启动子、调控序列及引入的多克隆位点完全正确 ,lhp -esat6基因在BCG中成功表达。 结论 :成功改建穿梭质粒 pJEM11为穿梭表达质粒 pJCH0 2。本研究为构建BCG多价疫苗奠定了基础. 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 热休克蛋白 启动子 基因表达

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禽分枝杆菌副结核亚种hsp65与鹅副黏病毒HN融合基因真核表达载体的构建与表达

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作者 么乃全 李淑君 +6 位作者 姜秀云 马红霞 高云航 王春芳 胡静涛 徐凤宇 胡桂学 《中国兽药杂志》 2014年第4期5-10,共6页

为探索禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的热休克蛋白65(hsp65)对鹅副黏病毒(GPMV)血凝素神经氨酸酶(HN)的分子佐剂作用及构建GPMV DNA疫苗,针对GPMV的HN基因和MAP的hsp65基因设计引物,PCR克隆扩增两个基因,分别将二者先后与真核表达载体pVAX... 为探索禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的热休克蛋白65(hsp65)对鹅副黏病毒(GPMV)血凝素神经氨酸酶(HN)的分子佐剂作用及构建GPMV DNA疫苗,针对GPMV的HN基因和MAP的hsp65基因设计引物,PCR克隆扩增两个基因,分别将二者先后与真核表达载体pVAX1连接,构建了pVAX1-HN、pVAX1-hsp65-HN,并通过PCR、酶切和序列鉴定所获重组质粒;应用脂质体法将其转染至Marc-145细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验证实hsp65和HN在Marc-145细胞中获得了表达。本研究为制备新型GPMV DNA疫苗及探索hsp65在DNA疫苗中的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 鹅副黏病毒 血凝素神经氨酸酶 禽分枝杆菌副结核亚种 热休克蛋白65 构建 表达

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重组结核分枝杆菌Hsp16.3的纳米金免疫传感器检测Hsp16.3抗体

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作者 贺靖 杨双 +4 位作者 刘娟 刘达琳 郭婧玮 谭云洪 袁仕善 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2021年第4期42-47,共6页

克隆和表达结核分枝杆菌热休克蛋白16.3(Hsp16.3),建立纳米金免疫传感器检测结核病患者血清Hsp16.3抗体。PCR扩增hsp16.3基因,构建重组表达质粒pQE30-hsp16.3,表达和纯化Hsp16.3,Western blot分析其反应原性;晶种生长法制备金纳米棒并连... 克隆和表达结核分枝杆菌热休克蛋白16.3(Hsp16.3),建立纳米金免疫传感器检测结核病患者血清Hsp16.3抗体。PCR扩增hsp16.3基因,构建重组表达质粒pQE30-hsp16.3,表达和纯化Hsp16.3,Western blot分析其反应原性;晶种生长法制备金纳米棒并连接Hsp16.3,建立纳米金免疫传感器检测血清Hsp16.3抗体,接受者操作特性(ROC)曲线评价其灵敏度和特异性。成功构建重组表达质粒pQE30-hsp16.3,纯化Hsp16.3具有良好的反应原性;Hsp16.3的纳米金免疫传感器分别检测50例结核病患者、42例非结核肺病患者和50例体检健康者血清,红移值大于3.5的例数分别为42、7、1例;ROC曲线显示,曲线下面积0.888(P<0.01),界值3.5,灵敏度82%,特异性98%。结果表明,Hsp16.3的纳米金免疫传感器可用于检测结核病血清Hsp16.3抗体。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 热休克蛋白16.3 纳米金免疫传感器 肺结核 检测

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