外泌体密切参与细胞间通讯,调控细胞生理过程,是目前癌症和其他疾病早期诊断的潜在生物标志物之一。因此,具有特定功能的外泌体的检测与分离具有重要临床意义。与此同时,开发低成本、高灵敏度的外泌体特异性识别元件,将在疾病早期诊断...外泌体密切参与细胞间通讯,调控细胞生理过程,是目前癌症和其他疾病早期诊断的潜在生物标志物之一。因此,具有特定功能的外泌体的检测与分离具有重要临床意义。与此同时,开发低成本、高灵敏度的外泌体特异性识别元件,将在疾病早期诊断和治疗过程中发挥关键作用。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选获得的、可与靶标特异性结合的单链脱氧核糖核酸或核糖核酸,具备稳定性高、可化学合成、高亲和力和特异性以及靶标范围广等独特优势。目前,靶向外泌体的适配体已应用于细胞成像、药物递送、疾病诊疗等众多研究领域。然而,外泌体的异质性以及复杂结构,为精准识别特定外泌体的适配体筛选带来巨大挑战,高效的筛选技术是获得优良性能适配体的关键。本文总结了外泌体适配体筛选过程中关键靶点的功能及其选择策略,概述了目前应用于外泌体适配体筛选的主要方法与应用,包括磁珠-SELEX、微流控-SELEX、硝酸纤维素膜-SELEX、细胞-SELEX和毛细管电泳-SELEX等5种筛选技术,并对其分离原理、优势与限制以及最新应用进行阐述与分析。最后,对外泌体适配体筛选所面临的问题与挑战进行了总结与展望。展开更多
目前,对急性白血病细胞表面特异性分子标记物所知甚少,因而白血病的诊断尚缺乏白血病细胞的特异性方法。为此,本研究采用细胞-指数富集配体系统进化(cell-systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,cSELEX)技术,筛选...目前,对急性白血病细胞表面特异性分子标记物所知甚少,因而白血病的诊断尚缺乏白血病细胞的特异性方法。为此,本研究采用细胞-指数富集配体系统进化(cell-systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,cSELEX)技术,筛选与急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)M2型(AML-M2)患者CD33+/CD34+细胞结合的核酸适配体(aptamer),为寻找AML-M2白血病细胞表面特异性分子标记物提供基础。首先,通过免疫磁珠方法分选出AML-M2患者骨髓CD33+/CD34+细胞并将其作为靶细胞,正常人CD33+/CD34+细胞为反筛选细胞,采用cSELEX技术,从单链DNA(single strand deoxyribonucleic acid,ssDNA)文库中筛选与AML-M2CD33+/CD34+细胞结合的适配体。随后,通过克隆和测序分析各适配体的结构。结果显示,经过13轮次的反复筛选,ssDNA文库的适配体与AML-M2患者CD33+/CD34+细胞的富集度从0.7%增加到52.9%,至第13轮时趋于稳定。对所获得的30个适配体序列分析表明,大多数适配体含有CCCCT、CTCTC和CTCAC保守序列中的一种。二级结构分析显示,30个适配体中含有3种不同类型的模拟二级结构。结论 :本研究成功筛选到AML-M2型白血病CD33+/CD34+细胞的适配体,这为进一步寻找AML-M2白血病细胞表面特异性分子标记物以及AML-M2型白血病的分子诊断创造了基础。展开更多
目的:进化筛选与B淋巴细胞活化因子(B cell activating factor be longing to the TNF family,BAFF)特异结合的单链DNA适体,鉴定其结合力。方法:应用指数方式富集的配体系统进化(systemati cevolution of ligands by exponential enrich...目的:进化筛选与B淋巴细胞活化因子(B cell activating factor be longing to the TNF family,BAFF)特异结合的单链DNA适体,鉴定其结合力。方法:应用指数方式富集的配体系统进化(systemati cevolution of ligands by exponential enrich-ment,SELEX)技术,将随机序列寡核苷酸文库与BAFF分子相互作用,分离出结合的寡核苷酸配体,经反复扩增、筛选数个循环,获得重组人BAFF的单链DNA适体,应用Dot blotting鉴定其结合力,酶联法比较各适体序列对BAFF的相对结合力。结果:优化实验条件后成功进行了13轮次筛选,随机选取42个阳性克隆测序,各序列GC含量最高达75%,分为6类不同序列;Dotblotting证实这些适体均与BAFF相结合;比较各适体序列结合BAFF的光密度值,以序列44光密度值最高(0.752,P<0.05),具有对BAFF相对最高结合力。结论:首次成功获得特异结合BAFF的高亲和力的单链DNA适体,为研发防治肿瘤和自身免疫疾病新药奠定了基础。展开更多
胃癌是发病率及死亡率均较高的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。血清肿瘤标志物的检测对提高早期胃癌的检出率,改善胃癌的治疗有重要的意义。核酸适配体以其灵敏度高、靶向性强等优势显示出了较强的临床适用性。本研究以双...胃癌是发病率及死亡率均较高的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。血清肿瘤标志物的检测对提高早期胃癌的检出率,改善胃癌的治疗有重要的意义。核酸适配体以其灵敏度高、靶向性强等优势显示出了较强的临床适用性。本研究以双向热循环消减指数富集式配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术为支持,纳米(琼脂)磁珠材料为载体,胃癌血清及正常人血清为筛选靶标,结合高通量测序技术建立了快速高效的核酸适配体筛选方法。经过19轮双向筛选,获得高重复率的胃癌血清特异性核酸适配体序列10条及正常人血清特异性核酸适配体序列8条。将这些序列分别混合并制成检测试剂A、B,结合实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术,对100份临床血清样本进行特异性验证。通过比较分析,建立了快速高效的胃癌血清检测技术。结果显示,核酸适配体G-AP1与N-AP1的二级结构类似于抗体的“Y”型,且呈茎环状。检测试剂A、B对胃癌及正常人血清的检出率分别为92%和88%。表明本技术可以较准确地筛选得到高特异性和强亲和力的核酸适配体,体现了核酸适配体作为新型肿瘤标志物在临床检测及治疗的应用潜力。展开更多
节球藻毒素-R(nodularin-R,NOD-R)是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素。然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法。本文利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,...节球藻毒素-R(nodularin-R,NOD-R)是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素。然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法。本文利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术结合高通量测序(HTSELEX),筛选出NOD-R特异的高亲和力适配体。生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术对适配体的鉴定结果表明,适配体H62与NOD-R之间的亲和力最高,达到了168 n M。而且,该适配体不与其他毒素结合,具有较高的特异性。以上结果表明,适配体H62有望作为NOD-R检测新方法——适配体生物传感器的分子识别元件。展开更多
文摘外泌体密切参与细胞间通讯,调控细胞生理过程,是目前癌症和其他疾病早期诊断的潜在生物标志物之一。因此,具有特定功能的外泌体的检测与分离具有重要临床意义。与此同时,开发低成本、高灵敏度的外泌体特异性识别元件,将在疾病早期诊断和治疗过程中发挥关键作用。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选获得的、可与靶标特异性结合的单链脱氧核糖核酸或核糖核酸,具备稳定性高、可化学合成、高亲和力和特异性以及靶标范围广等独特优势。目前,靶向外泌体的适配体已应用于细胞成像、药物递送、疾病诊疗等众多研究领域。然而,外泌体的异质性以及复杂结构,为精准识别特定外泌体的适配体筛选带来巨大挑战,高效的筛选技术是获得优良性能适配体的关键。本文总结了外泌体适配体筛选过程中关键靶点的功能及其选择策略,概述了目前应用于外泌体适配体筛选的主要方法与应用,包括磁珠-SELEX、微流控-SELEX、硝酸纤维素膜-SELEX、细胞-SELEX和毛细管电泳-SELEX等5种筛选技术,并对其分离原理、优势与限制以及最新应用进行阐述与分析。最后,对外泌体适配体筛选所面临的问题与挑战进行了总结与展望。
文摘目的:进化筛选与B淋巴细胞活化因子(B cell activating factor be longing to the TNF family,BAFF)特异结合的单链DNA适体,鉴定其结合力。方法:应用指数方式富集的配体系统进化(systemati cevolution of ligands by exponential enrich-ment,SELEX)技术,将随机序列寡核苷酸文库与BAFF分子相互作用,分离出结合的寡核苷酸配体,经反复扩增、筛选数个循环,获得重组人BAFF的单链DNA适体,应用Dot blotting鉴定其结合力,酶联法比较各适体序列对BAFF的相对结合力。结果:优化实验条件后成功进行了13轮次筛选,随机选取42个阳性克隆测序,各序列GC含量最高达75%,分为6类不同序列;Dotblotting证实这些适体均与BAFF相结合;比较各适体序列结合BAFF的光密度值,以序列44光密度值最高(0.752,P<0.05),具有对BAFF相对最高结合力。结论:首次成功获得特异结合BAFF的高亲和力的单链DNA适体,为研发防治肿瘤和自身免疫疾病新药奠定了基础。
文摘胃癌是发病率及死亡率均较高的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。血清肿瘤标志物的检测对提高早期胃癌的检出率,改善胃癌的治疗有重要的意义。核酸适配体以其灵敏度高、靶向性强等优势显示出了较强的临床适用性。本研究以双向热循环消减指数富集式配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术为支持,纳米(琼脂)磁珠材料为载体,胃癌血清及正常人血清为筛选靶标,结合高通量测序技术建立了快速高效的核酸适配体筛选方法。经过19轮双向筛选,获得高重复率的胃癌血清特异性核酸适配体序列10条及正常人血清特异性核酸适配体序列8条。将这些序列分别混合并制成检测试剂A、B,结合实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术,对100份临床血清样本进行特异性验证。通过比较分析,建立了快速高效的胃癌血清检测技术。结果显示,核酸适配体G-AP1与N-AP1的二级结构类似于抗体的“Y”型,且呈茎环状。检测试剂A、B对胃癌及正常人血清的检出率分别为92%和88%。表明本技术可以较准确地筛选得到高特异性和强亲和力的核酸适配体,体现了核酸适配体作为新型肿瘤标志物在临床检测及治疗的应用潜力。
文摘节球藻毒素-R(nodularin-R,NOD-R)是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素。然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法。本文利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术结合高通量测序(HTSELEX),筛选出NOD-R特异的高亲和力适配体。生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术对适配体的鉴定结果表明,适配体H62与NOD-R之间的亲和力最高,达到了168 n M。而且,该适配体不与其他毒素结合,具有较高的特异性。以上结果表明,适配体H62有望作为NOD-R检测新方法——适配体生物传感器的分子识别元件。
