目的观察钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)抑制剂KN93对新生大鼠心房肌细胞钙负荷的影响,并对细胞CaMKⅡ的表达变化进行检测。方法新生大鼠心房肌细胞原代培养96h,应用钙离子导入剂ion...目的观察钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)抑制剂KN93对新生大鼠心房肌细胞钙负荷的影响,并对细胞CaMKⅡ的表达变化进行检测。方法新生大鼠心房肌细胞原代培养96h,应用钙离子导入剂ionomycin(1.0μmol/L)建立心房肌细胞钙超载模型,并在KN933种浓度(0.25、0.5、1.0μmol/L)的干预下,以钙离子指示剂Fluo-3/AM负载心房肌细胞,激光共聚焦显微镜观察心房肌细胞内游离钙的变化;应用Western blot法检测CaMKⅡ表达的变化。结果①细胞培养至第4天,免疫组织化学染色90%以上细胞α-肌动蛋白抗体阳性。②与对照组比较,钙离子导入剂ionomycin明显增加细胞内钙离子荧光值[(660.16±108.47)vs(376.12±57.57),P<0.01];KN93对细胞内钙离子荧光值无明显影响(P>0.05)。③预先加入3种不同浓度KN93可显著降低ionomycin导致的细胞内钙离子荧光强度的增加幅度(P<0.01),与对照组比较差异也有统计学意义(P<0.01)。④钙超载组细胞CaMKⅡ表达较对照组明显增加(P<0.01);而KN93对细胞CaMKⅡ表达影响不明显。⑤不同浓度KN93预处理后,钙超载组细胞CaMKⅡ的表达显著降低(P<0.01)。结论 CaMKⅡ抑制剂KN93可降低ionomycin引发的大鼠心房肌细胞钙负荷,并下调细胞CaMKⅡ表达。展开更多
黑色素合成是极其复杂的过程,其中涉及多种基因和miRNAs的参与。miR-186-5p在绵羊不同毛色皮肤中差异表达,说明其可能与毛色形成有关,生物信息学预测和绵羊不同毛色皮肤中miR-186-5p和Mitf的差异表达间接说明二者可能存在靶向关系,双荧...黑色素合成是极其复杂的过程,其中涉及多种基因和miRNAs的参与。miR-186-5p在绵羊不同毛色皮肤中差异表达,说明其可能与毛色形成有关,生物信息学预测和绵羊不同毛色皮肤中miR-186-5p和Mitf的差异表达间接说明二者可能存在靶向关系,双荧光报告直接证实了二者的靶向关系。为了证实miR-186-5p在黑色素形成中的作用,本研究构建miR-186-5p真核表达载体,并转染绵羊黑素细胞。结果显示,miR-186-5p通过与Mitf mRNAs的3′UTR结合抑制Mitf的表达和翻译。MITF是Tyr基因家族的调节因子。实时荧光聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和Western免疫印迹结果表明,过表达miR-186-5p引起的MITF下调抑制了TYR、TYRP1和TYRP2的表达。其中,mRNA表达水平分别下降34%、66%和52%;蛋白质表达水平分别下降32%、6%和46%。分光光度检测结果显示,黑色素含量下降59%倍。上述结果表明,miR-186-5p通过抑制靶基因Mitf的表达,抑制了绵羊黑素细胞内黑色素的生成。展开更多
文摘目的观察钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)抑制剂KN93对新生大鼠心房肌细胞钙负荷的影响,并对细胞CaMKⅡ的表达变化进行检测。方法新生大鼠心房肌细胞原代培养96h,应用钙离子导入剂ionomycin(1.0μmol/L)建立心房肌细胞钙超载模型,并在KN933种浓度(0.25、0.5、1.0μmol/L)的干预下,以钙离子指示剂Fluo-3/AM负载心房肌细胞,激光共聚焦显微镜观察心房肌细胞内游离钙的变化;应用Western blot法检测CaMKⅡ表达的变化。结果①细胞培养至第4天,免疫组织化学染色90%以上细胞α-肌动蛋白抗体阳性。②与对照组比较,钙离子导入剂ionomycin明显增加细胞内钙离子荧光值[(660.16±108.47)vs(376.12±57.57),P<0.01];KN93对细胞内钙离子荧光值无明显影响(P>0.05)。③预先加入3种不同浓度KN93可显著降低ionomycin导致的细胞内钙离子荧光强度的增加幅度(P<0.01),与对照组比较差异也有统计学意义(P<0.01)。④钙超载组细胞CaMKⅡ表达较对照组明显增加(P<0.01);而KN93对细胞CaMKⅡ表达影响不明显。⑤不同浓度KN93预处理后,钙超载组细胞CaMKⅡ的表达显著降低(P<0.01)。结论 CaMKⅡ抑制剂KN93可降低ionomycin引发的大鼠心房肌细胞钙负荷,并下调细胞CaMKⅡ表达。
文摘黑色素合成是极其复杂的过程,其中涉及多种基因和miRNAs的参与。miR-186-5p在绵羊不同毛色皮肤中差异表达,说明其可能与毛色形成有关,生物信息学预测和绵羊不同毛色皮肤中miR-186-5p和Mitf的差异表达间接说明二者可能存在靶向关系,双荧光报告直接证实了二者的靶向关系。为了证实miR-186-5p在黑色素形成中的作用,本研究构建miR-186-5p真核表达载体,并转染绵羊黑素细胞。结果显示,miR-186-5p通过与Mitf mRNAs的3′UTR结合抑制Mitf的表达和翻译。MITF是Tyr基因家族的调节因子。实时荧光聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和Western免疫印迹结果表明,过表达miR-186-5p引起的MITF下调抑制了TYR、TYRP1和TYRP2的表达。其中,mRNA表达水平分别下降34%、66%和52%;蛋白质表达水平分别下降32%、6%和46%。分光光度检测结果显示,黑色素含量下降59%倍。上述结果表明,miR-186-5p通过抑制靶基因Mitf的表达,抑制了绵羊黑素细胞内黑色素的生成。
