细胞可透过性Cre重组酶表达、纯化及生物活性检测(英文) 被引量：1

1

作者 郭中敏 徐康 +6 位作者 岳颖 黄冰 唐欢 马芸 洪迅 陈系古 肖东 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第9期784-790,共7页

Cre/loxP系统由Cre位点特异重组酶和可被Cre特异性识别的loxP位点构成,该系统广泛用于条件性基因敲除和表达,以研究基因功能.为了表达和纯化一种细胞可透过性Cre重组酶(即His6 NLS Cre MTS);经IPTG诱导,在BL2 1(DE3)宿主菌成功表达His6... Cre/loxP系统由Cre位点特异重组酶和可被Cre特异性识别的loxP位点构成,该系统广泛用于条件性基因敲除和表达,以研究基因功能.为了表达和纯化一种细胞可透过性Cre重组酶(即His6 NLS Cre MTS);经IPTG诱导,在BL2 1(DE3)宿主菌成功表达His6 NLS Cre MTS融合蛋白,通过His BondNi NTA树脂分离并纯化了该蛋白质,随后借助细胞和非细胞的重组系统成功检测了His6 NLS Cre MTS的生物活性. 展开更多

关键词 cre/LOX P系统 细胞可透过性cre重组酶 表达 纯化 生物活性检测 细胞和非细胞的重组系统

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于重组酶介导等温核酸扩增技术快速检测食品中骆驼源性成分的方法建立及评价

2

作者 周臣清 张娟 +3 位作者 綦艳 赵玲 黄宝莹 杨纯佳 《中国乳品工业》 北大核心 2025年第2期75-80,共6页

文章开发一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)的方法,实现对食品中骆驼源性成分快速检测。针对骆驼细胞色素B(Cytochrome b,Cyt b)基因设计特异性引物,对建立的RAA体系优化其反应扩增条件,评估其... 文章开发一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)的方法,实现对食品中骆驼源性成分快速检测。针对骆驼细胞色素B(Cytochrome b,Cyt b)基因设计特异性引物,对建立的RAA体系优化其反应扩增条件,评估其特异性和灵敏度,并用建立的RAA法与GB/T 38164标准方法分别对24份市售骆驼制品进行检测并比对结果。结果表明,本研究建立的RAA法特异性强,乳及乳制品检出限为1.0%,肉及肉制品检出限为0.1%,且2种方法对24份骆驼乳肉及其制品检测结果一致。因此,本研究开发的RAA方法具有快速、特异性强、灵敏度高、操作简单等优点,市场应用前景广阔。 展开更多

关键词 重组酶介导等温核酸扩增技术 骆驼源性成分 细胞色素B基因 快速检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用细菌内同源重组技术构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体 被引量：2

3

作者 李玲 国蓉 +4 位作者 常绪生 印慨 张晔 刘志民 章卫平 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期185-190,共6页

目的构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体,最终获得胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入小鼠,为胰岛β细胞功能研究提供良好的基因敲除动物模型。方法以低拷贝质粒pBR322-2s为骨架构建取获载体(retrieving vect... 目的构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体,最终获得胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入小鼠,为胰岛β细胞功能研究提供良好的基因敲除动物模型。方法以低拷贝质粒pBR322-2s为骨架构建取获载体(retrieving vector),应用λ噬菌体Red重组酶介导的缺口修复(gap-repair)方法,通过细菌内的同源重组克隆长度约为12kb的小鼠胰岛素2(Ins2)基因组DNA,同时构建1个带有内部核糖体进入位点(IRES)序列、Cre重组酶序列和正负向筛选标记基因的微型打靶载体(mini-targeting vector),最后通过同源重组获得Ins2-Cre打靶载体。结果以Ins2基因的第3外显子为靶点,成功构建了受内源性Ins2基因启动子严格调控的表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体。结论成功构建了在胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体,为获得胰岛β细胞中基因特异性敲除小鼠模型提供了关键材料。 展开更多

关键词 胰岛分泌细胞 cre重组酶 基因打靶 打靶载体 同源重组 内部核糖体进入位点

在线阅读 下载PDF 职称材料

肥大软骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立 被引量：2

4

作者 侯宁 杨冠 +2 位作者 范雄伟 吴秀山 杨晓 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期69-74,共6页

肥大软骨细胞是软骨细胞的终末分化形式,在软骨内成骨过程中发挥十分关键的作用。为了研究肥大软骨细胞在骨骼发育过程中的功能,文章构建了在8.2 kb小鼠X型胶原基因(Coll0a1)启动子控制下表达Cre重组酶的转基因小鼠品系(Coll0a1(8.2)-C... 肥大软骨细胞是软骨细胞的终末分化形式,在软骨内成骨过程中发挥十分关键的作用。为了研究肥大软骨细胞在骨骼发育过程中的功能,文章构建了在8.2 kb小鼠X型胶原基因(Coll0a1)启动子控制下表达Cre重组酶的转基因小鼠品系(Coll0a1(8.2)-Cre)。采用显微注射法将11.5 kb的转基因片段导入小鼠基因组,共注射受精卵328枚,获得子代鼠51只,经PCR基因型鉴定有3只在基因组上整合有Cre重组酶基因。PCR检测发现Coll0a1(8.2)-Cre转基因在含有肥大软骨细胞的组织中表达。为了检测Cre重组酶表达的强度和组织特异性,转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配,子代ROSA26;Coll0a1(8.2)-Cre双转基因小鼠LacZ染色检测的结果显示,Cre重组酶在所有的肥大软骨细胞中表达。原位杂交的结果证实Coll0a1(8.2)-Cre转基因表达在肥大区的上端。通过对比发现Coll0a1(8.2)-Cre转基因表达的组织特异性和强度均优于之前我们构建的Coll0a1(1.0)-Cre转基因品系。以上结果表明,建立的肥大软骨细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠品系可以作为一种遗传学工具,介导目的基因在肥大软骨细胞中的敲除。 展开更多

关键词 肥大软骨细胞 cre重组酶 转基因小鼠 组织特异性

在线阅读 下载PDF 职称材料

肝特异性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的建立

5

作者 杨春 朱洪伟 +3 位作者 刘宗岳 王桂武 杨福合 邢秀梅 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第10期145-149,共5页

试验旨在建立肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞系,为获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。通过PCR方法分别从血液和pcDNA3.1(+)载体上扩增肝脏特异性启动子α1-抗胰蛋白酶启动子(PhAAT)和BGHpolyA片段。通过双酶切(XhoⅠ... 试验旨在建立肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞系,为获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。通过PCR方法分别从血液和pcDNA3.1(+)载体上扩增肝脏特异性启动子α1-抗胰蛋白酶启动子(PhAAT)和BGHpolyA片段。通过双酶切(XhoⅠ、SalⅠ)从载体pGC-FRT2neo上获得FRT2neo交换盒,再利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,最后通过三重融合PCR方法和酶切方法将4个片段连接。利用真核表达载体pC1-neo构建出Cre表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo。LipofectamineTM2000介导转染猪成纤维细胞,通过G418筛选出阳性细胞系,最后通过PCR鉴定证明构建的Cre重组酶表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo成功整合到细胞的基因组中,获得了肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。 展开更多

关键词 cre重组酶 肝脏特异性启动子 真核表达载体 三重融合PCR 细胞转染

在线阅读 下载PDF 职称材料

表达Cre重组酶的真核细胞系的建立及在重组伪狂犬病病毒研究中的应用 被引量：2

6

作者 苏鑫铭 徐亚林 +3 位作者 于春梅 曹瑞兵 周斌 陈溥言 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期114-119,共6页

根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400μg.mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre。利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies vir... 根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400μg.mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre。利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(带有gfp报告基因表达盒及loxP位点)感染293A-Cre细胞,荧光显微镜观察、PCR及Western blot检测gfp基因的表达。结果表明,S03109感染293A-Cre二代后loxP位点间的gfp表达盒被删除,获得重组病毒S0419。将S0419感染已转染pBlulox的293A-Cre细胞,在RK13细胞上筛选得到表达LacZ的重组病毒S06293。S06293在293A-Cre细胞上传代2次,X-Gal原位染色表明LacZ的表达消失。测序结果证实,在Cre重组酶作用下,2个同向loxP序列之间的外源基因序列被正确除去。以上结果表明,本研究构建的稳定表达Cre重组酶的293A-Cre细胞系可以用于在包含有loxP位点的PRV基因组中外源基因的快速删除或整合。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 PCR cre重组酶 真核细胞系 LOXP

在线阅读 下载PDF 职称材料

改善苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌细胞通透性提高反式肉桂酸转化率 被引量：5

7

作者 崔建东 贾士儒 谭之磊 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第6期1015-1019,共5页

研究了不同表面活性剂(曲通-X-100、Tween-80、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS))和有机试剂(丙酮、异丙醇、乙醇)对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌细胞通透性的影响。结果表明曲通-X-100、Tween-80、SDS、异丙醇和乙醇对... 研究了不同表面活性剂(曲通-X-100、Tween-80、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS))和有机试剂(丙酮、异丙醇、乙醇)对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌细胞通透性的影响。结果表明曲通-X-100、Tween-80、SDS、异丙醇和乙醇对提高细胞的通透性没有显著影响,但CTAB和丙酮可以显著的改善细胞通透性,提高反式肉桂酸转化率。原子力显微镜检测结果表明,用0.15g·L-1CTAB和60%丙酮处理细胞后可以明显的改变细胞形态,与对照(未处理细胞)相比,处理后的细胞表面粗糙,多皱折,表明细胞膜的通透性得到提高。流式细胞仪检测表明,0.15g·L-1CTAB处理细胞后,平均荧光道数(MnX)是对照(未处理细胞)的23倍,细胞通透性得到显著提高,反式肉桂酸转化率是对照的1.83倍,达到82%。60%丙酮处理细胞,MnX是对照的28倍,反式肉桂酸转化率是对照的1.90倍,达到84.9%。 展开更多

关键词 苯丙氨酸解氨酶 重组大肠杆菌 表面活性剂 细胞通透性 反式肉桂酸转化率

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于Cre重组酶体系的小鼠HPRT定点整合打靶载体的构建及其应用

8

作者 郑敬民 李坚 +1 位作者 杨桦 傅继梁 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期538-541,共4页

目的 :构建带有 Cre重组酶识别位点变异体 lox6 6的针对小鼠 HPRT基因的基因打靶载体 ,并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法 :利用含 HPRT基因组 DNA片段的质粒 p MP8和人工合成含 lox6 6序列的寡核苷酸 ,构建含 Cre重组酶识别位点... 目的 :构建带有 Cre重组酶识别位点变异体 lox6 6的针对小鼠 HPRT基因的基因打靶载体 ,并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法 :利用含 HPRT基因组 DNA片段的质粒 p MP8和人工合成含 lox6 6序列的寡核苷酸 ,构建含 Cre重组酶识别位点变异体 lox6 6的置换型打靶载体 ,经过限制性内切酶酶切鉴定其结构正确后 ,用电穿孔法对小鼠胚胎干细胞 R1株进行基因转染 ,经 G418/ 6 - TG(6 - thioguanine)分组药物筛选 ,进行 p SP- HPRT- lox6 6 - Neo载体的应用研究。结果 :得到了与设计一致的置换型打靶载体 p SP- HPRT- lox6 6 - Neo;将线性化的打靶载体导入 ES细胞后 ,能与靶位点有效地发生同源重组 ,获得了 2 0个靶基因被灭活了的 ES细胞克隆。结论 :此研究成功构建了含 Cre重组酶识别位点变异体 lox6 6针对小鼠 HPRT基因位点的置换型打靶载体 。 展开更多

关键词 基因打靶 胚胎干细胞 HPRT基因 cre重组酶 小鼠

在线阅读 下载PDF 职称材料

用N,N-二甲基六烷基溴化铵涂层的毛细管对重组促红细胞生长素及其酶解产物进行毛细管电泳和毛细管电泳-电喷雾质谱分析 被引量：2

9

作者 于冰 丛海林 +2 位作者 刘虎威 李元宗 刘锋 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期487-491,共5页

采用毛细管电泳技术研究了重组促红细胞生长素(rhEPO)的分离问题。用N,N-二甲基六烷基溴化铵(6,6-ionene)涂层的毛细管测定了rhEPO中唾液酸的微多相性,同时采用毛细管电泳-质谱(CE-M S)联用技术在22m in内鉴定了rhEPO20段胰酶消化肽中... 采用毛细管电泳技术研究了重组促红细胞生长素(rhEPO)的分离问题。用N,N-二甲基六烷基溴化铵(6,6-ionene)涂层的毛细管测定了rhEPO中唾液酸的微多相性,同时采用毛细管电泳-质谱(CE-M S)联用技术在22m in内鉴定了rhEPO20段胰酶消化肽中的11段。该方法简单快捷,重现性好,可用于蛋白质一级结构的测定。 展开更多

关键词 毛细管电泳 毛细管电泳-质谱联用 N N-二甲基六烷基溴化铵涂层 重组促红细胞生长素 酶解产物 微多相性 肽图

在线阅读 下载PDF 职称材料

肉制品中鸡源性成分重组酶介导等温扩增检测方法的建立及应用 被引量：15

10

作者 苗丽 张秀平 +4 位作者 王建昌 王永亮 程奇 徐超 张璐 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期954-959,共6页

为了快速准确检测出肉制品中的鸡源性成分,本研究基于鸡线粒体细胞色素B基因(CytB),设计特异性引物和exo探针,建立了实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)方法,进行特异性、灵敏性和稳定性分析,并通过检测市售肉制品对所建立RAA方法的准确... 为了快速准确检测出肉制品中的鸡源性成分,本研究基于鸡线粒体细胞色素B基因(CytB),设计特异性引物和exo探针,建立了实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)方法,进行特异性、灵敏性和稳定性分析,并通过检测市售肉制品对所建立RAA方法的准确性和适用性进行分析。结果表明,该方法可以快速实现对高山鸡肉、乌鸡肉、芦花鸡肉、白羽鸡肉和野鸡肉基因组DNA的特异性扩增,而对猪肉、牛肉、羊肉等的DNA均没有扩增,可稳定检出的鸡源性成分最低质量分数为0.1%。在9份标识有鸡肉成分的市售样品中,7份检出鸡源性成分,有2份样品的鸡源性成分检测结果为阴性。本研究建立的实时荧光RAA方法操作简单,反应迅速,特异性强,灵敏度高,为肉制品中鸡源性成分的检测提供了技术保障。 展开更多

关键词 重组酶介导等温扩增 细胞色素B基因 鸡源性成分

在线阅读 下载PDF 职称材料

应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因 被引量：5

11

作者 赵艳 张晓丽 +1 位作者 郭龙彪 钱前 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期580-586,共7页

研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25μmol/... 研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA(+)/nptⅡ(-)/Cre(-)的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%～46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率(144.44%)也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。 展开更多

关键词 水稻 雌激素诱导 cre/loxP重组酶系统 转化细胞 标记基因删除

在线阅读 下载PDF 职称材料

脂质体介导外源性基因在骨髓基质细胞表达

12

作者 孙吉平 贾延劼 +2 位作者 罗芳 宋建辉 杨于嘉 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期140-144,共5页

目的:用阳离子脂质体介导真核表达载体pEGFP PDX 1转染大鼠骨髓基质细胞,并对其转染条件进行优化以获得较高效率。方法:构建的重组载体鉴定后,以脂质体介导其转染骨髓基质细胞,改变DNA,脂质体的量,在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率... 目的:用阳离子脂质体介导真核表达载体pEGFP PDX 1转染大鼠骨髓基质细胞,并对其转染条件进行优化以获得较高效率。方法:构建的重组载体鉴定后,以脂质体介导其转染骨髓基质细胞,改变DNA,脂质体的量,在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率;转染后48h进行细胞免疫组化染色检测目的基因的表达情况。结果:限制性酶切分析证实重组后的载体成功载入PDX 1基因;克隆的目的片断经序列测定与GenBank公布的序列一致;质粒∶脂质体为1∶1或1∶2的转染效率最佳;细胞免疫化学染色检测证实转染后骨髓基质细胞有PDX 1基因表达。结论:成功构建了含有PDX 1基因的真核表达载体;通过优化转染条件提高了pEGFP PDX 1转染大鼠骨髓基质细胞的效率,为成为组织工程的种子细胞提供了实验依据。 展开更多

关键词 外源性基因 细胞表达 大鼠骨髓基质细胞 阳离子脂质体介导 真核表达载体 限制性酶切分析 显微镜下观察 细胞免疫组化 细胞免疫化学 转染效率 染色检测 PDX-1 重组载体 表达情况 目的基因 序列测定 基因表达 种子细胞 组织工程

在线阅读 下载PDF 职称材料

可满足性问题生物砖翻转细胞计算模型 被引量：1

13

作者 陈梅 陈向群 +1 位作者 张路 许进 《计算机学报》 EI CSCD 北大核心 2013年第12期2537-2544,共8页

细胞内丰富的信息处理机制和细胞计算的巨并行性一直吸引着科学家构建细胞计算机.科学家利用细胞内的信息处理机制开发了不少模仿简单电子器件功能的细胞计算部件,如细胞布尔逻辑门、细胞记忆单元等,但这些部件没有充分利用细胞计算的... 细胞内丰富的信息处理机制和细胞计算的巨并行性一直吸引着科学家构建细胞计算机.科学家利用细胞内的信息处理机制开发了不少模仿简单电子器件功能的细胞计算部件,如细胞布尔逻辑门、细胞记忆单元等,但这些部件没有充分利用细胞计算的巨并行性特点.DNA重组酶Hin能催化DNA片段的翻转反应,通过切换DNA片段的方向来调控基因的表达.该文利用DNA重组酶Hin的这一性质,以合成生物学中广泛使用的生物砖为材料,以大肠杆菌Escherichia coli为宿主细胞,以DNA重组酶Hin为计算工具,构建了一个解决可满足性问题的细胞计算模型.该模型中,每个细胞可独立地生成并判定可满足性问题的一个解,数以亿计的细胞可检查数以亿计的可能解.该模型充分利用细胞计算的巨并行性,显示了细胞计算的巨大潜力. 展开更多

关键词 生物砖 DNA重组酶Hin 基因调控 可满足性问题 细胞计算

在线阅读 下载PDF 职称材料

小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠的构建及鉴定

14

作者 朱晓晨 谢欣宜 +3 位作者 赵旭日 徐丽娜 何智妍 周薇 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期689-698,共10页

目的·基于Cre-Loxp系统构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠并验证其敲除效率。方法·将Cx3cr1^(creERT2)与Stat3^(fl/fl)基因型小鼠多代交配繁育,直到获得足够数量的Stat3^(fl/fl);Cx3cr1^(creERT2)基因型小鼠,即条件敲除... 目的·基于Cre-Loxp系统构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠并验证其敲除效率。方法·将Cx3cr1^(creERT2)与Stat3^(fl/fl)基因型小鼠多代交配繁育,直到获得足够数量的Stat3^(fl/fl);Cx3cr1^(creERT2)基因型小鼠,即条件敲除小鼠(conditional knockout,CKO);同窝Stat3^(fl/fl)基因型小鼠,即对照小鼠(wild type,WT)。利用小鼠组织提取DNA后通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),结合特异性引物分别扩增的结果来判断小鼠基因型。在CKO及WT小鼠6周龄时通过腹腔注射他莫昔芬诱导小胶质细胞中Stat3基因的敲除;2周后,随机选取CKO小鼠(n=4)及WT小鼠(n=4),利用磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分选出小胶质细胞后通过实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)技术从基因水平检测基因敲除效率;通过脑组织切片免疫荧光染色标记小胶质细胞和STAT3蛋白观察小胶质细胞中STAT3的表达情况;利用流式细胞术分别检测STAT3在小胶质细胞及脾巨噬细胞中的变化。通过尼氏染色检测神经元细胞的情况;通过脑组织切片荧光染色标记小胶质细胞,观察皮层和海马区域小胶质细胞的情况;通过流式细胞术检测小胶质细胞表型。结果·成功繁育出CKO小鼠和WT小鼠。MACS后脑细胞中小胶质细胞的占比从10%提升到85%。RT-PCR结果显示,相对于WT小鼠,CKO小鼠小胶质细胞中Stat3的mRNA相对表达量为0.3317±0.0414,mRNA水平下调(P=0.001)。脑组织免疫荧光染色结果显示,CKO小鼠小胶质细胞中STAT3蛋白的荧光强度较WT小鼠弱。脑组织流式细胞术显示:WT小鼠小胶质细胞中STAT3的阳性细胞占比为(85.30±5.69)%;CKO小鼠小胶质细胞中STAT3的阳性细胞占比为(39.70±3.88)%,STAT3表达率下降(P=0.001)。脾组织流式细胞术显示,CKO小鼠与WT小鼠脾巨噬细胞中STAT3的阳性细胞占比的差异无统计学意义(P>0.05)。尼氏染色显示,CKO小鼠与WT小鼠神经元细胞无显著差异。脑组织切片荧光染色结果显示,CKO小鼠与WT小鼠的小胶质细胞在形态上无明显差异。小胶质细胞流式细胞术显示CKO小鼠与WT小鼠小胶质细胞表型无显著差别。结论·成功构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠,为后续相关研究提供动物模型。 展开更多

关键词 小胶质细胞 信号转导和转录激活因子3(STAT3) 他莫昔芬 小鼠 cre重组酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

Tnfrsf11a^(Cre)介导黄色荧光素蛋白有效标记脑小胶质细胞 被引量：2

15

作者 杨凤娇 黄紫薇 +2 位作者 赵殿元 徐龙 唐丽 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2022年第9期1345-1349,共5页

目的构建Tnfrsf11a^(Cre)Rosa26^(yfp)报告基因小鼠,检测Tnfrsf11a^(Cre)介导黄色荧光素蛋白YFP标记组织巨噬细胞的效率。方法将Tnfrsf11a^(Cre)小鼠与Rosa26^(yfp)小鼠交配,通过PCR筛选出Tnfrsf11a^(Cre)Rosa26^(yfp)报告基因小鼠。分... 目的构建Tnfrsf11a^(Cre)Rosa26^(yfp)报告基因小鼠,检测Tnfrsf11a^(Cre)介导黄色荧光素蛋白YFP标记组织巨噬细胞的效率。方法将Tnfrsf11a^(Cre)小鼠与Rosa26^(yfp)小鼠交配,通过PCR筛选出Tnfrsf11a^(Cre)Rosa26^(yfp)报告基因小鼠。分离成年Tnfrsf11a^(Cre)Rosa26^(yfp)小鼠脑小胶质细胞、肝脏巨噬细胞、肾脏巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、脾脏巨噬细胞,标记流式抗体,通过流式细胞术分析Tnfrsf11a^(Cre)介导荧光素蛋白YFP标记组织巨噬细胞的效率。结果Tnfrsf11a^(Cre)介导黄色荧光素蛋白YFP对脑小胶质细胞具有约91.27%的标记效率,但对肝脏、脾脏、肺泡巨噬细胞细胞的标记效率分别只有约63.60%、69.66%、32.76%。结论Tnfrsf11a^(Cre)可以介导YFP对脑小胶质细胞进行示踪。同时,Tnfrsf11a^(Cre)可用做脑小胶质细胞基因条件性敲除的工具鼠。 展开更多

关键词 Tnfrsf11a^(cre) Rosa26^(yfp) 组织巨噬细胞 脑小胶质细胞 cre重组酶 报告基因小鼠 流式细胞术

在线阅读 下载PDF 职称材料

Prrx1+牙周膜干细胞在牙移动过程中的谱系示踪 被引量：1

16

作者 汪席均 金安婷 +5 位作者 黄湘如 徐弘远 高昕 杨屹羚 代庆刚 江凌勇 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1008-1015,共8页

目的·通过Cre/loxP重组酶系统研究牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)中配对相关同源基因1(paired related homeobox 1,Prrx1)阳性细胞谱系(Prrx1+细胞谱系)在小鼠牙移动过程中的动态分布。方法·利用Cre/l... 目的·通过Cre/loxP重组酶系统研究牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)中配对相关同源基因1(paired related homeobox 1,Prrx1)阳性细胞谱系(Prrx1+细胞谱系)在小鼠牙移动过程中的动态分布。方法·利用Cre/loxP重组酶系统,将诱导型Prrx1-Cre^(ERT2)小鼠与R26^(tdTomato)荧光标记小鼠交配繁殖,并通过PCR对其子代小鼠进行基因型鉴定。取8只子代小鼠,向其腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen,TA),以标记PDLSCs中的Prrx1+细胞谱系(即tdTomato^(+)细胞)。于小鼠上颌左侧安置加力装置[即正畸牙移动(orthodontics tooth movement,OTM)侧],右侧未加力即为对照侧,以构建小鼠OTM模型。分别于牙移动第3日(OTM 3 d)、第7日(OTM 7 d)时处死小鼠,收集其双侧上颌磨牙及周围牙周组织,经脱钙后行包埋及冰冻切片处理。采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)观察张力区和压力区牙周膜的改变,并利用免疫荧光染色观察Prrx1+细胞谱系在张力区及压力区的动态分布。结果·经PCR鉴定,子代小鼠基因型为Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)。随着加力装置作用的增加,OTM 7 d小鼠的牙移动距离[(87.44±4.02)μm]较OTM 3 d小鼠[(42.81±5.04)μm]明显增加,提示小鼠OTM模型构建成功。H-E染色结果显示:OTM 3 d时小鼠OTM侧压力区的牙周膜被压缩、间隙变窄,而OTM 7 d时OTM侧牙周膜宽度逐渐恢复;OTM 3 d时OTM侧张力区的牙周膜被拉伸,而OTM 7 d较OTM 3 d时牙周膜排列更规则。免疫荧光染色结果显示:OTM 3 d时OTM侧压力区牙周膜中tdTomato^(+)细胞数量较对照侧减少,OTM 7 d时OTM侧压力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧增加(均P<0.05);OTM 3 d及OTM 7 d时,OTM侧张力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧均有增加(均P<0.05)。结论·成功构建了Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)小鼠的OTM模型,并初步证实了Prrx1+细胞谱系参与OTM过程中的牙周改建。 展开更多

关键词 细胞谱系示踪 正畸牙移动 配对相关同源基因1 cre/loxP重组酶系统

在线阅读 下载PDF 职称材料

PP2A Cα敲除小鼠心肌细胞模型的构建

17

作者 陈文 温明达 +2 位作者 董大川 高艳红 张朝 《南京师大学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期74-77,共4页

体外构建PP2A Cα敲除的原代小鼠心室肌细胞模型.选择性地将雄性PP2A Cαfl/fl,Cre/-小鼠与雌性PP2ACαfl/fl,Cre/-小鼠交配.新生小鼠心脏经胰酶消化后差速贴壁获得原代小鼠心室肌细胞,用带有Cre的腺病毒侵染心肌细胞,经荧光显微镜观察... 体外构建PP2A Cα敲除的原代小鼠心室肌细胞模型.选择性地将雄性PP2A Cαfl/fl,Cre/-小鼠与雌性PP2ACαfl/fl,Cre/-小鼠交配.新生小鼠心脏经胰酶消化后差速贴壁获得原代小鼠心室肌细胞,用带有Cre的腺病毒侵染心肌细胞,经荧光显微镜观察和Western-blot检测,分析PP2A Cα的敲除效果.将基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的雌雄小鼠进行交配,得到其同样基因型的后代,进而可获得足量基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的原代小鼠心肌细胞.用带有重组酶Cre的腺病毒侵染细胞48 h后,可见带有绿色荧光的心肌细胞;Western-blot检测显示,PP2A Cα在Cre腺病毒侵染的心肌细胞可下调60%～80%.本研究成功建立了PP2A Cα敲除的原代小鼠心肌细胞模型. 展开更多

关键词 PP2ACα 新生小鼠心肌细胞 带重组酶cre的腺病毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用Pdl1敲除的巨噬细胞转录谱分析结核感染中PD-L1作用相关的候选基因

18

作者 石亚男 唐军 +2 位作者 李军丽 王杰 占玲俊 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2020年第5期31-39,共9页

目的分析结核菌(Mtb)感染的程序性死亡配体1(Pdl1)特异性敲除的巨噬细胞(MΦ)转录谱变化,筛选MΦ内PD-L1作用相关的候选基因。方法构建敲除小鼠(Pdl1^Flox/-),通过Cre-loxp技术培育出MΦ上Pdl1特异性敲除的纯合和杂合小鼠(Pdl1^Flox/Flo... 目的分析结核菌(Mtb)感染的程序性死亡配体1(Pdl1)特异性敲除的巨噬细胞(MΦ)转录谱变化,筛选MΦ内PD-L1作用相关的候选基因。方法构建敲除小鼠(Pdl1^Flox/-),通过Cre-loxp技术培育出MΦ上Pdl1特异性敲除的纯合和杂合小鼠(Pdl1^Flox/Flox-Cre,Pdl1^Flox/--Cre),用PCR和流式细胞术验证。分离上述小鼠腹腔MΦ,利用转录组测序技术检测Mtb感染MΦ24 h的表达谱,以同窝阴性小鼠(Pdl1^Flox/Flox)为对照,进行生物信息学分析。结果PCR和流式细胞术证实小鼠敲除成功。纯合、杂合及同窝阴性小鼠感染前后相比,差异表达基因最显著富集项为参与免疫反应和免疫过程的GO(P<0.01;P<0.01),筛出17个PD-L1相关的候选基因。通过KEGG富集分析,最显著富集的通路有Toll样受体、NF-κB信号通路等(P<0.01;P<0.01),筛出6个候选基因。结论通过转录谱分析,确定与免疫反应及免疫过程有关的Ccl2、Qa5、Il12a等17个基因,免疫及炎症相关代谢通路的Ptgs2、Cd40、Card11等6个基因为Mtb感染的MΦ内PD-L1相关的候选基因,除Il6外均为本研究新筛选的候选基因。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 巨噬细胞 Pdl1基因敲除 cre/loxp重组酶系统 转录组测序

在线阅读 下载PDF 职称材料

质粒研究在细菌性传染病中的应用

19

作者 彭克高 李根 《云南畜牧兽医》 1990年第3期43-45,共3页

质粒是细菌染色体外具有遗传功能的共闭环双链DNA,它具有自我复制能力,但受质粒本身及染色体的双重控制,在细菌分裂时可伴随染色体分配到子代细胞中,并在子代中延续。质粒DNA上的某些基因可以指导细菌产生某些特殊功能蛋白,从而赋予细... 质粒是细菌染色体外具有遗传功能的共闭环双链DNA,它具有自我复制能力,但受质粒本身及染色体的双重控制,在细菌分裂时可伴随染色体分配到子代细胞中,并在子代中延续。质粒DNA上的某些基因可以指导细菌产生某些特殊功能蛋白,从而赋予细菌多种功能如致病性,耐药性,产毒素性及生化反应等。质粒作为遗传工程中的载体,国内外均进行了大量的研究,但在临床医学中的应用,国内兽医学界几乎是空白。 展开更多

关键词 细菌染色体 遗传功能 细菌性传染病 功能蛋白 子代细胞 自我复制能力 闭环双链 致病性 重组体 限制酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

海外文摘

20

《今日养猪业》 2010年第6期49-50,共2页

诱导性表达Cre重组酶转基猪的构建 小型猪是生物医学研究最理想的试验动物之一，但是，这种猪模型还没有被广泛应用于人类疾病的基因敲除上。这项研究的目的是通过体细胞核转移技术建立Mxl-Cre重组酶转基因猪。在这项研究中。通过体细... 诱导性表达Cre重组酶转基猪的构建 小型猪是生物医学研究最理想的试验动物之一，但是，这种猪模型还没有被广泛应用于人类疾病的基因敲除上。这项研究的目的是通过体细胞核转移技术建立Mxl-Cre重组酶转基因猪。在这项研究中。通过体细胞核转移（体细胞核移植）创建转基因猪。 展开更多

关键词 体细胞核移植 cre重组酶 文摘 海外 转基因猪 试验动物 生物医学 基因敲除

在线阅读 下载PDF 职称材料