兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达及细胞内定位 被引量：6

1

作者 陈柳 云涛 +3 位作者 刘光清 倪征 余斌 宋毅 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第2期135-139,共5页

为了探讨兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白的细胞内定位,利用杆状病毒表达系统构建了表达RHDV结构蛋白(VP60)的重组杆状病毒。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测以及电子显微镜观察结果表明,VP60不仅能在昆虫细胞中正确表达,而且能自组装... 为了探讨兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白的细胞内定位,利用杆状病毒表达系统构建了表达RHDV结构蛋白(VP60)的重组杆状病毒。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测以及电子显微镜观察结果表明,VP60不仅能在昆虫细胞中正确表达,而且能自组装形成病毒样颗粒(VLPs)。进一步对表达蛋白进行细胞内定位观察发现,表达蛋白定位于Sf9细胞的细胞膜上。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 结构蛋白 昆虫—杆状病毒表达系统 细胞内定位

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兔病毒性出血症病毒次要结构蛋白(VP2)的表达和细胞内定位分析 被引量：3

2

作者 陈柳 刘光清 +4 位作者 倪征 余斌 云涛 华炯钢 李双茂 《中国动物传染病学报》 CAS 2009年第2期1-7,共7页

病毒蛋白VP2是兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV)的一种次要结构蛋白。本文旨在构建VP2与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体,进而利用它研究VP2在细胞内的定位情况。首先在大肠杆菌中表达GST-VP2融合蛋白,然后用纯化... 病毒蛋白VP2是兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV)的一种次要结构蛋白。本文旨在构建VP2与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体,进而利用它研究VP2在细胞内的定位情况。首先在大肠杆菌中表达GST-VP2融合蛋白,然后用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗VP2的抗血清。对制备的抗VP2抗血清进行特异性分析,再利用该抗体对转染pEGFP-VP2的BHK-21细胞进行检测,以研究VP2蛋白在细胞内的定位情况。结果表明,pEGFP-VP2转染BHK-21细胞后,不仅VP2蛋白得到了成功表达,而且通过检测偶联的绿色荧光蛋白可判断出VP2蛋白主要分布于BHK-21细胞的细胞质。本研究成功构建了VP2与绿色荧光蛋白融合的表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现VP2主要在细胞质内表达并分布,为深入探讨VP2的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 VP2 次要结构蛋白 细胞内定位

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LPS刺激对RAW264.7细胞p38蛋白激酶的细胞内定位的影响 被引量：1

3

作者 张琳 姜勇 张璐 《第一军医大学学报》 CSCD 2000年第3期197-201,共5页

目的 探讨p38蛋白激酶信号传导的过程及其在细胞中的特异性作用机制。方法 应用间接荧光标记免疫探针技术及共聚焦激光扫描技术观察单核细胞中p38蛋白激酶的分布及LPS对其分布的影响。结果p38在未受刺激的静息单核细胞及内皮生长因子（... 目的 探讨p38蛋白激酶信号传导的过程及其在细胞中的特异性作用机制。方法 应用间接荧光标记免疫探针技术及共聚焦激光扫描技术观察单核细胞中p38蛋白激酶的分布及LPS对其分布的影响。结果p38在未受刺激的静息单核细胞及内皮生长因子（EGF）刺激的单核细胞胞浆和胞核中荧光强度均呈弥散性分布；脂多糖（LPS）刺激使细胞核区的荧光强度明显增强，而胞浆区域的荧光强度降低。激酶动力学的研究显示，p38激活先于p38移位。LPS刺激后30 min，p38激酶活性即达到高峰，随后2 h内逐步下降，p38激酶活性呈一过性增高；LPS刺激45 min后，核区荧光强度达到峰值，且在2 h内维持在高水平。结论 单核细胞由LPS激活后，其p38蛋白激酶由胞浆转位到胞核，反应具有一定的特异性；p38移位入核依赖于p38磷酸化活化及由细胞浆移位到细胞核是一系列连续发生的事件。 展开更多

关键词 P38蛋白激酶 LPS刺激 RAW264.7细胞 细胞内定位

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人ERA的细胞内定位

4

作者 纪宗玲 陈苏民 +4 位作者 陈南春 张俊杰 吴元明 卢兹凡 路凡 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期169-170,185,共3页

关键词 人ERA EGFP 原位免疫细胞化学 细胞内定位 基因表达

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α_1-抗胰蛋白酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

5

作者 刘承武 胡水旺 +3 位作者 陈登宇 冯国开 邓鹏 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期408-411,共4页

目的构建鼠α1-抗胰蛋白酶(AAT)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达及定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到AAT编码序列。然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后转染NIH... 目的构建鼠α1-抗胰蛋白酶(AAT)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达及定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到AAT编码序列。然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后转染NIH3T3细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明构建正确。转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论成功构建带HA标签的AAT真核表达载体。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为下一步深入研究AAT在细胞内的相关生物学功能提供了一个重要工具。 展开更多

关键词 Α1-抗胰蛋白酶 血凝素 细胞内定位 载体构建

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C端谷氨酰胺富含结构域调节TIAR的细胞内定位

6

作者 谭理 李平 +1 位作者 童畅 朱运松 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期229-232,共4页

目的阐明核糖核酸(RNA)结合蛋白T细胞内抗原相关蛋白(TIAR)的结构域与细胞内定位之间的关系。方法细胞免疫荧光检测SMCC-7721细胞内源性TIAR的细胞内分布,亚克隆构建TIAR全长及缺失体的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒,脂质体法瞬时转... 目的阐明核糖核酸(RNA)结合蛋白T细胞内抗原相关蛋白(TIAR)的结构域与细胞内定位之间的关系。方法细胞免疫荧光检测SMCC-7721细胞内源性TIAR的细胞内分布,亚克隆构建TIAR全长及缺失体的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒,脂质体法瞬时转染SMCC-7721细胞,在荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞内的荧光分布情况,免疫印迹检测融合蛋白的表达情况。结果细胞免疫荧光结果显示在SMCC-7721细胞中TIAR主要浓集于细胞核,细胞浆也有少量弥散分布。酶切鉴定及测序结果显示TIAR全长及缺失体的pEGFP-C3重组表达质粒构建成功。EGFP-TIARFL(TIAR全长)主要分布于细胞核;而EGFP-TIARRRM123(TIAR的N端3个RNA结合结构域)弥散分布于整个细胞;EGFP-TIARQ-rich(TIAR的C端谷胺酰胺富含结构域)浓集于细胞核,但浓集程度要比TIARFL-EGFP弱。免疫印迹证实过表达的TIAR全长及缺失体的EGFP融合蛋白分子量大小符合预期。结论我们的结果提示C端谷氨酸富含结构域参与TIAR细胞内定位的调节。 展开更多

关键词 T细胞内抗原相关蛋白 细胞内定位 增强型绿色荧光蛋白

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核糖体蛋白RPL15多克隆抗体的制备与细胞内定位

7

作者 梁爽爽 冀美超 +3 位作者 胡晓晴 付成华 朱长军 董智雄 《天津师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2016年第5期55-59,共5页

为了解核糖体大亚基蛋白RPL15在细胞中的定位和功能,设计并合成了RPL15蛋白的多肽,作用于抗原免疫兔子,使其产生特异性多克隆抗体,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光方法检测RPL15抗体的特异性.结果证实本研究成功制备并纯化了RPL15的多克隆抗... 为了解核糖体大亚基蛋白RPL15在细胞中的定位和功能,设计并合成了RPL15蛋白的多肽,作用于抗原免疫兔子,使其产生特异性多克隆抗体,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光方法检测RPL15抗体的特异性.结果证实本研究成功制备并纯化了RPL15的多克隆抗体,且该抗体可以特异性识别RPL15蛋白.免疫荧光实验表明RPL15定位于细胞质和细胞核中,主要定位于核仁并呈点状分布,且与UBF、FBL和C23存在部分共定位. 展开更多

关键词 RPL15 核糖体 多克隆抗体 免疫荧光 细胞内定位

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髓样相关蛋白8真核表达载体的构建及其细胞内定位

8

作者 伍丽琼 吴翠玲 +3 位作者 王娟 徐佳 邓鹏 姜勇 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2010年第6期907-909,共3页

目的:构建小鼠髓样相关蛋白8(MRP8)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法:提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应扩增得到MRP8编码序列,并将其克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后将... 目的:构建小鼠髓样相关蛋白8(MRP8)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法:提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应扩增得到MRP8编码序列,并将其克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后将重组质粒瞬时转染NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察结果。结果:重组质粒经聚合酶链反应、酶切和测序鉴定证明构建正确,并且该质粒能够在NIH3T3细胞的胞浆、胞核中广泛表达,表达产物主要定位在细胞核中。结论:成功构建带有HA标签的MRP8真核表达载体。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究MRP8作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。 展开更多

关键词 髓样相关蛋白8 血凝素类 转染 细胞内定位 载体构建

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人Lrp蛋白在细胞中的定位及LPS对其表达的影响 被引量：5

9

作者 宋庆贺 于欣平 +3 位作者 陈苏民 陈南春 代忠明 侯立朝 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期542-546,共5页

为了对脂多糖应答基因(lrp)的功能进行深入的研究,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化后的全长Lrp蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.Western印迹表明,吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合,并有较高免疫印迹滴... 为了对脂多糖应答基因(lrp)的功能进行深入的研究,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化后的全长Lrp蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.Western印迹表明,吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合,并有较高免疫印迹滴度,为Lrp功能研究提供了重要的工具.激光共聚焦扫描荧光显微镜检测显示Lrp主要位于细胞核膜周围.Western印迹、RT-PCR以及细胞免疫组化染色结果都表明,用LPS刺激后,lrp在人HEK293和U937细胞内的表达均有明显的上升.结果提示,Lrp可能与对Lrp介导的反应有关. 展开更多

关键词 脂多糖 人脂多糖应答基因 抗体制备 细胞内定位

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新城疫病毒ClassⅠ强毒株磷蛋白在细胞中的表达与定位 被引量：2

10

作者 程靖华 孙英杰 +5 位作者 陈鸿军 仇旭升 宋翠萍 于圣青 吴艳涛 丁铲 《中国动物传染病学报》 CAS 2013年第1期17-22,共6页

根据ClassI新城疫病毒分离株9a5b编码序列设计特异性引物扩增P蛋白基因，原核表达后利用纯化的蛋白免疫BALB／C小鼠制备单克隆抗体，经二次亚克隆后筛选到4株针对P蛋白的单克隆抗体，利用所得单抗进行P蛋白在细胞内定位分析，NDV9a5b株... 根据ClassI新城疫病毒分离株9a5b编码序列设计特异性引物扩增P蛋白基因，原核表达后利用纯化的蛋白免疫BALB／C小鼠制备单克隆抗体，经二次亚克隆后筛选到4株针对P蛋白的单克隆抗体，利用所得单抗进行P蛋白在细胞内定位分析，NDV9a5b株按5M．O．I感染量接种DFl单层细胞，当PI=4h时，P蛋白呈点状弥散分布于细胞浆内；PI=6～8h时，P蛋白聚集于细胞核周围；PI=12h时，P蛋白呈单极化聚集于细胞核一侧；而PI=16h后开始形成合胞体，P蛋白在单个细胞中仍呈现单极分布；当PI=48h时，细胞核已发生碎裂，荧光强度有所减弱。本研究为深入开展P蛋白在病毒增殖以及细胞周期中的作用机制研究奠定了基础。 展开更多

关键词 新城疫病毒 ClassⅠ P蛋白 细胞内定位

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ClassⅠ新城疫病毒核衣壳蛋白在体外细胞感染过程中表达定位的检测 被引量：1

11

作者 孙英杰 陈鸿军 +4 位作者 詹媛 仇旭升 于洋 于圣青 丁铲 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期85-88,共4页

为分析核衣壳蛋白(NP)在新城疫病毒(NDV)感染真核细胞过程中细胞内定位的情况,本研究以NDV Class I强毒株9a5b作为免疫原制备4株NP特异性单克隆抗体(MAb),并将病毒株9a5b按5 MOI感染量接种DF1单层细胞,当接种后1 h～3 h时,NP有极少量表... 为分析核衣壳蛋白(NP)在新城疫病毒(NDV)感染真核细胞过程中细胞内定位的情况,本研究以NDV Class I强毒株9a5b作为免疫原制备4株NP特异性单克隆抗体(MAb),并将病毒株9a5b按5 MOI感染量接种DF1单层细胞,当接种后1 h～3 h时,NP有极少量表达并逐量增加,主要呈点状分布于细胞浆内;当接种后4 h～20 h时,NP聚集于细胞浆中,聚集数量与感染时间成正比;感染24 h后,细胞核碎裂,NP散在分布于细胞浆中。表明NP作为立早期蛋白,始终在胞浆中进行复制;在病毒感染初期,NP介导核糖核蛋白复合物发挥转录和翻译功能。本研究为深入开展NP与病毒mRNA转录、复制和包装的相互关系机制的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 新城疫病毒 ClassⅠ 核蛋白 细胞内定位

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小鼠神经生长因子的细胞内免疫组织化学阳性反应定位 被引量：1

12

作者 谌宏鸣 吴良芳 +1 位作者 保天然 周雪 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第4期316-318,共3页

用免疫组织化学方法对小鼠神经组织和非神经组织中神经生长因子的分布进行了定位观察。实验结果表明 :(1)神经生长因子免疫反应主要局限于神经组织 ,尤其是神经元 ;非神经组织除颌下腺的颗粒曲管外基本上都呈阴性反应 ;(2 )在神经元 ,... 用免疫组织化学方法对小鼠神经组织和非神经组织中神经生长因子的分布进行了定位观察。实验结果表明 :(1)神经生长因子免疫反应主要局限于神经组织 ,尤其是神经元 ;非神经组织除颌下腺的颗粒曲管外基本上都呈阴性反应 ;(2 )在神经元 ,神经生长因子定位于细胞核与细胞质但以胞核为主 ,少量位于胞质靠近细胞膜的部位 ;(3 )雄性小鼠颌下腺颗粒曲管细胞的NGF主要定位于分泌颗粒的界膜区。神经生长因子在胞内定位的精确性和分布的多样性 。 展开更多

关键词 神经生长因子 细胞内定位 免疫组织化学 小鼠

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3-取代芳基氧化吲哚在肿瘤细胞内的定位 被引量：2

13

作者 周园 王彩云 +4 位作者 苏晔 程昕 彭洪薇 杨纯正 熊冬生 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期751-754,共4页

目的观察3-取代芳基氧化吲哚(PHⅡ-7)在肿瘤细胞内的定位。方法通过化学合成的方法,在PHⅡ-7的1位引入氨烷基侧链,并将其氨基端进行FITC衍生化,在进行此衍生物体外抗肿瘤活性测定后,用激光共聚焦成像技术进行其在肿瘤细胞内的定位。结... 目的观察3-取代芳基氧化吲哚(PHⅡ-7)在肿瘤细胞内的定位。方法通过化学合成的方法,在PHⅡ-7的1位引入氨烷基侧链,并将其氨基端进行FITC衍生化,在进行此衍生物体外抗肿瘤活性测定后,用激光共聚焦成像技术进行其在肿瘤细胞内的定位。结果成功合成具有氨烷基侧链的PHⅡ-7衍生物,并使之与FITC偶联;合成衍生物具有一定体外抗肿瘤活性;随着PHⅡ-7作用时间的增加,药物在肿瘤细胞系K562及其耐药肿瘤细胞系K562/A02中均逐渐由细胞质向细胞核内聚集。结论对于肿瘤细胞系K562及其耐药肿瘤细胞系K562/A02,PHⅡ-7作用靶位均为细胞核。 展开更多

关键词 氧化吲哚衍生物 多药耐药 细胞内定位 共聚焦激 光扫描显微镜

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Syntaxin1A与Munc18a在细胞内的相互作用和定位研究(英文)

14

作者 徐平勇 白丽 +1 位作者 田伟 徐涛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第1期31-36,共6页

Syntaxin 1A (Syn1A) 和Munc18a蛋白在囊泡转运和分泌中起着至关重要的作用,然而它们在细胞中分选和转运的分子机制目前尚不清楚. 我们用绿色荧光蛋白(EGFP) 和红色荧光蛋白(TDimer2) 分别标记Syn1A和Munc18a,并用荧光显微技术观察它们... Syntaxin 1A (Syn1A) 和Munc18a蛋白在囊泡转运和分泌中起着至关重要的作用,然而它们在细胞中分选和转运的分子机制目前尚不清楚. 我们用绿色荧光蛋白(EGFP) 和红色荧光蛋白(TDimer2) 分别标记Syn1A和Munc18a,并用荧光显微技术观察它们在BHK-21和HEK293细胞中的转运和定位. 实验结果表明Syn1A主要定位在细胞质膜上,而Munc18a主要分布在胞浆中,但是与Syn1A共表达时能定位到细胞质膜上. 删除胞浆部分的Syn1A蛋白不能上膜,提示其胞浆结构域在分选和定位过程中起着重要的作用. 展开更多

关键词 SYNTAXIN 1A Munc18a 转运 细胞内定位

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稳定表达绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白A549细胞系的建立 被引量：1

15

作者 刘霄卉 罗军荣 +2 位作者 斯日古楞 周建华 马学恩 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期395-398,共4页

为研究绵羊肺腺瘤病病毒(JSRV)表面蛋白(SU)的致瘤机制,本研究构建稳定表达SU的羊肺细胞A549细胞系。采用PCR方法从含su基因的pGEX-4T-1-SU重组质粒中扩增SU编码序列,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,转染A549细胞。通过G418筛选,... 为研究绵羊肺腺瘤病病毒(JSRV)表面蛋白(SU)的致瘤机制,本研究构建稳定表达SU的羊肺细胞A549细胞系。采用PCR方法从含su基因的pGEX-4T-1-SU重组质粒中扩增SU编码序列,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,转染A549细胞。通过G418筛选,对转染阳性细胞进行纯化,获得稳定表达JSRVSU蛋白的A549细胞系。以间接免疫荧光及westernblot鉴定SU的表达状况,并运用共聚焦显微镜确认SU蛋白的亚细胞定位。结果表明,重组蛋白SU在A549细胞中有效表达,而且主要分布于细胞质中。该细胞系的建立为SU生物学功能的体外研究提供了平台。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 表面蛋白 真核表达 细胞内定位

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反转录原位聚合酶链反应的建立及用于肝癌组织切片细胞内HCV　RNA的检测

16

作者 褚桂珍 蒋明德 +5 位作者 曾维政 张建华 陈泰庆 邓桂英 楚人俊 张大华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 1994年第4期26-27,共2页

反转录原位聚合酶链反应的建立及用于肝癌组织切片细胞内ＨＣＶＲＮＡ的检测褚桂珍，蒋明德，曾维政，张建华，陈泰庆，邓桂英，楚人俊，张大华（成都军区总医院消化内科，成都６１００８３）我们建立了ＩＳＰＣＲ技术，并对２７例ＨＣ... 反转录原位聚合酶链反应的建立及用于肝癌组织切片细胞内ＨＣＶＲＮＡ的检测褚桂珍，蒋明德，曾维政，张建华，陈泰庆，邓桂英，楚人俊，张大华（成都军区总医院消化内科，成都６１００８３）我们建立了ＩＳＰＣＲ技术，并对２７例ＨＣＣ组织切片进行ＨＣＶＲＮＡ的检测，... 展开更多

关键词 RNA HCV 组织切片 成都军区总医院 反转录酶 细胞内定位 硬化肝 癌周组织 冰冻切片 楚人

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早幼粒细胞性白血病致病蛋白PML-RARa增强细胞自噬活性

17

作者 黄莺 陈婷婷 陈国强 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第A10期2009-2009,共1页

关键词 PML-RARa 细胞自噬 白血病细胞 同系移植 溶酶体 转基因小鼠 细胞内定位 酶抑制剂 特异性抑制剂 透射电子显微镜

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核蛋白1在肿瘤发展过程中的作用及相关研究进展 被引量：4

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作者 张兴博 赵家莹 张临友 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期445-448,共4页

核蛋白1（NUPR1）,又称为p8、com1,是在大鼠胰腺炎模型中首先鉴定得到的小分子核蛋白,其在急性胰腺炎的发展过程中,可被强烈而迅速地诱导表达。在应激条件下,NUPR1表达通常呈上调趋势,说明NUPR1可以被宿主体内的微环境所影响。

关键词 非小细胞肺癌 乳腺癌细胞 大鼠 多柔比星 乳头状癌 细胞内定位 微环境 细胞增殖 细胞周期 正常前列腺组织

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PRMT1通过精氨酸甲基化作用修饰剪接因子SF2／ASF 被引量：1

19

作者 贾荟 杜超豪 +1 位作者 鲍时来 郑胡镛 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期216-220,共5页

目的:探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶1(protein arginine methyltransferase1,PRMT1)对剪接因子SF2/ASF(spli-cing factor 2/alternative splicing factor)的甲基化修饰位点。方法:构建SF2/ASF野生型和Arg93/97/109突变体质粒,在体外表达... 目的:探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶1(protein arginine methyltransferase1,PRMT1)对剪接因子SF2/ASF(spli-cing factor 2/alternative splicing factor)的甲基化修饰位点。方法:构建SF2/ASF野生型和Arg93/97/109突变体质粒,在体外表达和纯化GST标签的PRMT1、SF2/ASF及其Arg突变体融合蛋白,以甲基化活性实验检测PRMT1对SF2/ASF的甲基化作用及其甲基化修饰位点,以免疫荧光实验观察甲基化修饰对SF2/ASF亚细胞定位的影响。结果:PRMT1对SF2/ASF有明显的甲基化修饰作用;当Arg93/97/109突变为赖氨酸后,PRMT1对SF2/ASF突变体的甲基化修饰程度明显降低,其中Arg97突变后SF2/ASF甲基化程度减弱最明显。甲基化修饰不影响SF2/ASF的亚细胞定位。结论:发现SF2/ASF是PRMT1新的底物蛋白,Arg93/97/109均为PRMT1的甲基化修饰位点,其中Arg97是主要修饰位点;PRMT1对于SF2/ASF的甲基化修饰并不改变后者细胞内的定位。 展开更多

关键词 蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1) SF2/ASF 甲基化作用 精氨酸 细胞内定位 选择性剪接

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乙型肝炎病毒X蛋白截短突变体的构建及其对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响 被引量：1

20

作者 谢青 陈林林 +5 位作者 李治 单晓亮 聂丹 段玉洁 权会琴 唐霓 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期35-40,共6页

目的:观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)截短突变体在细胞内的定位及其对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响。方法:采用PCR克隆全长野生型HBx基因,在此基础上,分别构建融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和缺失HBx基因C端49~154 aa、C端85~... 目的:观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)截短突变体在细胞内的定位及其对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响。方法:采用PCR克隆全长野生型HBx基因,在此基础上,分别构建融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和缺失HBx基因C端49~154 aa、C端85~154 aa、N端1~57 aa+C端141~154 aa、N端1~57 aa或N端1~84 aa截短突变体的表达载体;激光共聚焦显微镜下观察HBx截短突变体在HEK293细胞中的定位;采用萤光素酶报告系统检测HBx截短突变体对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响。结果:(1)成功构建了HBx截短突变体与EGFP基因融合的表达载体。(2)野生型HBx及截短突变体在HEK293细胞中具有不同的定位,其中N端缺失突变体主要定位于细胞核周胞质;C端缺失突变体在胞质胞核中呈均匀分布;N端+C端缺失突变体的定位类似于野生型HBx,主要定位于胞质,呈不均一的粗大颗粒,胞核中也有少量表达。(3)与野生型HBx相比,HBx C端49~154 aa、C端85~154 aa、N端1~57 aa+C端141~154 aa、N端1~57 aa和N端1~84 aa缺失突变体在Huh7细胞中均使Wnt/β-catenin信号通路的转录活性明显下降,分别下降了78.7%、84.7%、75.7%、93.8%和95.5%。结论:HBx不同截短突变体的细胞定位及对Wnt/β-catenin信号通路转录活性不同,提示HBx的不同功能区对Wnt信号的转录激活发挥着不同的作用。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒X蛋白 截短突变体 细胞内定位 转录活性

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