目的研究膀胱癌组织及人膀胱癌细胞株T24中组蛋白去甲基化酶JARID1B的表达。构建JARID1B慢病毒表达载体并进行相关鉴定;观察经包装后慢病毒感染的T24中JARID1B表达情况。方法 Western blotting检测T24和6例膀胱癌及其癌旁组织JARID1B蛋...目的研究膀胱癌组织及人膀胱癌细胞株T24中组蛋白去甲基化酶JARID1B的表达。构建JARID1B慢病毒表达载体并进行相关鉴定;观察经包装后慢病毒感染的T24中JARID1B表达情况。方法 Western blotting检测T24和6例膀胱癌及其癌旁组织JARID1B蛋白表达。利用真核表达质粒pcDNA3.1(-)-JARID1B,将JARID1B基因连接入含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒表达载体pLv-EGFP中,构建重组慢病毒表达载体pLv-EGFP-JARID1B,将经酶切和DNA测序鉴定的重组质粒通过脂质体转染至T24,荧光显微镜观察GFP表达,RT-PCT检测JARID1B mRNA表达。包装慢病毒并感染T24,Western blotting检测目的蛋白JARID1B表达。结果膀胱癌及其癌旁组织JARID1B蛋白表达阳性率分别为16.7%和66.7%,且前者表达强度较弱;T24 JARID1B蛋白表达阴性。重组质粒经酶切和DNA测序证实目的基因插入正确;pLv-EGFP-JARID1B转染T24,荧光显微镜观察发现细胞表达GFP,RT-PCR显示T24表达JARID1B mRNA。包装慢病毒再感染T24后Western blotting分析显示,细胞表达目的蛋白JARID1B。结论膀胱癌组织JARID1B表达下调。成功构建JARID1B慢病毒表达载体,包装慢病毒感染T24后细胞过表达JARID1B。展开更多
UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表...UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表达载体,设计并合成干扰shRNA和阴性对照寡核苷酸片段。其中干扰shRNA及阴性对照通过退火形成双链DNA,并插入pCD513B-U6慢病毒干扰载体。采用双酶切的方法和DNA测序鉴定重组载体。通过干扰和过表达载体质粒共转293T细胞,利用qRT-PCR筛选出最有效的干扰序列。重组质粒与其他3种慢病毒辅助包装质粒(pRsv-Rev、pGag-Pol、pVSV-G)共转染293T细胞包装慢病毒。结果表明,本试验成功扩增Utx基因的全长序列,且成功构建了Utx的过表达和干扰载体。qRT-PCR筛选出pCD513B-U6-Utx-shRNA-3干扰效率最显著,干扰效率为70%。本试验成功包装出慢病毒Lenti-Utx-shRNA、Lenti-NC和Lenti-Utx,测定的病毒滴度分别为6.1×107 TU/mL、4.8×107 TU/mL和3.9×105 TU/mL。此试验为进一步在猪源细胞中进行Utx基因的研究奠定基础。展开更多
文摘UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表达载体,设计并合成干扰shRNA和阴性对照寡核苷酸片段。其中干扰shRNA及阴性对照通过退火形成双链DNA,并插入pCD513B-U6慢病毒干扰载体。采用双酶切的方法和DNA测序鉴定重组载体。通过干扰和过表达载体质粒共转293T细胞,利用qRT-PCR筛选出最有效的干扰序列。重组质粒与其他3种慢病毒辅助包装质粒(pRsv-Rev、pGag-Pol、pVSV-G)共转染293T细胞包装慢病毒。结果表明,本试验成功扩增Utx基因的全长序列,且成功构建了Utx的过表达和干扰载体。qRT-PCR筛选出pCD513B-U6-Utx-shRNA-3干扰效率最显著,干扰效率为70%。本试验成功包装出慢病毒Lenti-Utx-shRNA、Lenti-NC和Lenti-Utx,测定的病毒滴度分别为6.1×107 TU/mL、4.8×107 TU/mL和3.9×105 TU/mL。此试验为进一步在猪源细胞中进行Utx基因的研究奠定基础。
