目的:探讨蛋白激酶RNA样ER激酶(protein kinase RNA-like ER kinase,PERK)信号通路介导的线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)中的作用。方法...目的:探讨蛋白激酶RNA样ER激酶(protein kinase RNA-like ER kinase,PERK)信号通路介导的线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)中的作用。方法:将大鼠随机分为假手术(Sham)组和5个HIBI亚组(HIBI后3、6、12、24、48 h)。用于蛋白质印迹检测PERK、转录激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)蛋白的时程表达。将大鼠随机分为Sham组、HIBI组、HIBI+PERK组和HIBI+载体(Vector)组,每组15只。HIBI+PERK组和HIBI+Vector组大鼠在HIBI手术前1 h,将基于腺病毒相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的PERK过表达质粒或AAV载体注射到脑室内,用于特异性表达PERK。在HIBI后24 h进行FJC染色分析神经元变性和DHE染色、酶联免疫吸附试验分析氧化应激。将大鼠随机分为Sham组、HIBI组、HIBI+PERK激动剂(CCT020312)组,每组12只。在HIBI手术前1 h,向HIBI+CCT020312组大鼠脑室内注射CCT020312。在HIBI后3周进行开阔场地测试和莫里斯水迷宫测试。结果:与Sham组相比,PERK、ATF4、HSP60在HIBI后3 h开始明显升高,在12 h达到高峰,然后逐渐下降,直到48 h(F=60.23、56.72、74.31,均P<0.001)。与HIBI组相比,HIBI+PERK组神经元变性的数量(100.2±3.1 vs. 582.4±15.7,P<0.001)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)(42.4±2.9 vs. 17.7±2.1,P<0.01)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)(0.81±0.06 vs. 0.54±0.04,P<0.001)水平显著降低,和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)(112.4±3.6 vs. 177.5±6.6,P<0.05)、超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase,SOD)活性(46.3±1.9 vs. 64.2±2.3,P<0.05)活性明显增加。与Sham组相比,HIBI组大鼠海马组织中PERK(1.00±0.03 vs. 1.66±0.08,P<0.01)、ATF4(1.00±0.04 vs.1.53±0.06,P<0.05)、动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)(1.00±0.02 vs. 1.98±0.07,P<0.01)、HSP60(1.00±0.03 vs. 1.37±0.04,P<0.05)蛋白表达均明显增加(P<0.05)。与HIBI组相比,HIBI+PERK组大鼠海马组织中PERK(1.66±0.08vs. 2.95±0.17,P<0.01)、ATF4(1.53±0.06 vs. 3.42±0.22,P<0.01)、HSP60(1.37±0.04 vs. 2.03±0.09,P<0.05)蛋白表达均明显增加(F=46.72、30.63、20.64,P<0.001),和Drp1(1.98±0.07 vs. 1.04±0.05,P<0.05)蛋白表达明显降低(F=35.72,P<0.001)。HIBI+CCT020312组的平均逃避潜伏期和平台穿越次数均较HIBI组明显增加(F=246.84、113.62,P<0.001)。结论:PERK减轻HIBI模型诱导的氧化应激和神经元凋亡,其机制可能涉及PERK/ATF4信号通路对mtUPR的调节。通过CCT020312给药具有神经保护作用。展开更多
目的:在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中探讨动力相关蛋白1(dynamin related protein 1,Drp1)基因缺失激活线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein reaction,mtUPR)的分子机制。方法:采用不同浓度(...目的:在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中探讨动力相关蛋白1(dynamin related protein 1,Drp1)基因缺失激活线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein reaction,mtUPR)的分子机制。方法:采用不同浓度(0、2.5、5.0、10.0mmol/L)3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP)处理Drp1敲除或敲低的MEF细胞、Drp1抑制剂Mdivi-1或选择性阻断Drp1与下游蛋白相互作用的小分子多肽P110处理的MEF细胞以及相应对照,随后进行Western blot检测CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)、ATP结合盒B亚家族成员10(ATP binding cassette subfamily B member 10,ABCB10)、Lon肽酶1(Lon peptidase 1,LONP1)以及热休克蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60)的表达。RT-qPCR检测Drp1敲低或Mdivi-1处理后MEF细胞的ABCB10的mRNA水平。同时敲低Drp1和ABCB10,Western blot检测CHOP蛋白的表达,试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量,流式细胞术检测线粒体活性氧和线粒体膜电位水平。结果:3-NP处理后,Drp1敲除或敲低的MEF细胞以及Mdivi-1或P110处理的MEF细胞中CHOP表达呈现倍数上调。Drp1敲除或敲低的MEF细胞以及Mdivi-1或P110处理的MEF细胞中ABCB10蛋白表达上调,mtUPR效应蛋白LONP1和Hsp60表达上调。Drp1敲低的MEF细胞和Mdivi-1处理的MEF细胞中ABCB10 mRNA水平上调。同时敲低Drp1和ABCB10后,与Drp1敲低组相比,CHOP表达下调,LDH含量降低,线粒体活性氧水平降低,线粒体膜电位水平增加。结论:在MEF细胞中,Drp1表达下调可引起ABCB10表达量增加,导致mtUPR关键蛋白CHOP、LONP1和Hsp60蛋白表达上调,进而激活mtUPR。展开更多
文摘目的:探讨蛋白激酶RNA样ER激酶(protein kinase RNA-like ER kinase,PERK)信号通路介导的线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)中的作用。方法:将大鼠随机分为假手术(Sham)组和5个HIBI亚组(HIBI后3、6、12、24、48 h)。用于蛋白质印迹检测PERK、转录激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)蛋白的时程表达。将大鼠随机分为Sham组、HIBI组、HIBI+PERK组和HIBI+载体(Vector)组,每组15只。HIBI+PERK组和HIBI+Vector组大鼠在HIBI手术前1 h,将基于腺病毒相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的PERK过表达质粒或AAV载体注射到脑室内,用于特异性表达PERK。在HIBI后24 h进行FJC染色分析神经元变性和DHE染色、酶联免疫吸附试验分析氧化应激。将大鼠随机分为Sham组、HIBI组、HIBI+PERK激动剂(CCT020312)组,每组12只。在HIBI手术前1 h,向HIBI+CCT020312组大鼠脑室内注射CCT020312。在HIBI后3周进行开阔场地测试和莫里斯水迷宫测试。结果:与Sham组相比,PERK、ATF4、HSP60在HIBI后3 h开始明显升高,在12 h达到高峰,然后逐渐下降,直到48 h(F=60.23、56.72、74.31,均P<0.001)。与HIBI组相比,HIBI+PERK组神经元变性的数量(100.2±3.1 vs. 582.4±15.7,P<0.001)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)(42.4±2.9 vs. 17.7±2.1,P<0.01)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)(0.81±0.06 vs. 0.54±0.04,P<0.001)水平显著降低,和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)(112.4±3.6 vs. 177.5±6.6,P<0.05)、超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase,SOD)活性(46.3±1.9 vs. 64.2±2.3,P<0.05)活性明显增加。与Sham组相比,HIBI组大鼠海马组织中PERK(1.00±0.03 vs. 1.66±0.08,P<0.01)、ATF4(1.00±0.04 vs.1.53±0.06,P<0.05)、动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)(1.00±0.02 vs. 1.98±0.07,P<0.01)、HSP60(1.00±0.03 vs. 1.37±0.04,P<0.05)蛋白表达均明显增加(P<0.05)。与HIBI组相比,HIBI+PERK组大鼠海马组织中PERK(1.66±0.08vs. 2.95±0.17,P<0.01)、ATF4(1.53±0.06 vs. 3.42±0.22,P<0.01)、HSP60(1.37±0.04 vs. 2.03±0.09,P<0.05)蛋白表达均明显增加(F=46.72、30.63、20.64,P<0.001),和Drp1(1.98±0.07 vs. 1.04±0.05,P<0.05)蛋白表达明显降低(F=35.72,P<0.001)。HIBI+CCT020312组的平均逃避潜伏期和平台穿越次数均较HIBI组明显增加(F=246.84、113.62,P<0.001)。结论:PERK减轻HIBI模型诱导的氧化应激和神经元凋亡,其机制可能涉及PERK/ATF4信号通路对mtUPR的调节。通过CCT020312给药具有神经保护作用。
文摘目的:在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中探讨动力相关蛋白1(dynamin related protein 1,Drp1)基因缺失激活线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein reaction,mtUPR)的分子机制。方法:采用不同浓度(0、2.5、5.0、10.0mmol/L)3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP)处理Drp1敲除或敲低的MEF细胞、Drp1抑制剂Mdivi-1或选择性阻断Drp1与下游蛋白相互作用的小分子多肽P110处理的MEF细胞以及相应对照,随后进行Western blot检测CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)、ATP结合盒B亚家族成员10(ATP binding cassette subfamily B member 10,ABCB10)、Lon肽酶1(Lon peptidase 1,LONP1)以及热休克蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60)的表达。RT-qPCR检测Drp1敲低或Mdivi-1处理后MEF细胞的ABCB10的mRNA水平。同时敲低Drp1和ABCB10,Western blot检测CHOP蛋白的表达,试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量,流式细胞术检测线粒体活性氧和线粒体膜电位水平。结果:3-NP处理后,Drp1敲除或敲低的MEF细胞以及Mdivi-1或P110处理的MEF细胞中CHOP表达呈现倍数上调。Drp1敲除或敲低的MEF细胞以及Mdivi-1或P110处理的MEF细胞中ABCB10蛋白表达上调,mtUPR效应蛋白LONP1和Hsp60表达上调。Drp1敲低的MEF细胞和Mdivi-1处理的MEF细胞中ABCB10 mRNA水平上调。同时敲低Drp1和ABCB10后,与Drp1敲低组相比,CHOP表达下调,LDH含量降低,线粒体活性氧水平降低,线粒体膜电位水平增加。结论:在MEF细胞中,Drp1表达下调可引起ABCB10表达量增加,导致mtUPR关键蛋白CHOP、LONP1和Hsp60蛋白表达上调,进而激活mtUPR。
