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成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术研究进展 被引量:3
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作者 单琳琳 夏海滨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期856-862,共7页
成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾... 成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术已成为生物医学领域中研究基因功能及其表达调控的重要手段之一。随着CRISPR技术的拓展,各种基于CRISPR技术的新型研究、诊断和治疗等工具得到进一步的开发,并在新型动物疾病模型的建立、疾病快速诊断、肿瘤及免疫相关性疾病的治疗等方面取得了重大进展和突破。我们重点对CRISPR/CRISPR相关蛋白(Cas)技术的发展现状及其在生物医学领域的应用进展进行综述,并对其未来应用前景和发展方向进行讨论和展望。 展开更多
关键词 的规律间隔的回文重复序列(CRISPR) CRISPR相关蛋白(Cas) 基因编辑 基因诊断 基因治疗 综述
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CRISPR/Cas9技术:探索lncRNA的自身功能以及在癌症进程中的作用
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作者 李欣 胡莹 王玉明 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第3期364-375,共12页
CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物... CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物和治疗靶点,具有重要的应用前景。然而,由于lncRNA普遍具有低丰度和保守性差等特点,限制了传统手段对其功能的研究。CRISPR/Cas9技术为lncRNA的研究提供了一个高效、灵活且精确的工具,显著加速了该领域的进展。本文首先回顾了CRISPR/Cas9系统的基本原理及其在基因编辑中的广泛应用,包括CRISPR敲除、敲入、干扰和激活等多种功能系统。这些技术不仅可以筛选特定生物过程中的关键lncRNA,还能够用于基因功能研究,探索其在疾病中的作用。本文重点分析了CRISPR/Cas9技术在研究lncRNA功能和调控机制,以及其在肿瘤研究中的关键应用。此外,文章还总结了通过CRISPR/Cas9进行全基因组筛选以识别功能性lncRNA的方法,并探讨了这些lncRNA在癌症细胞增殖、迁移、侵袭以及耐药性中的作用。CRISPR/Cas9敲除系统可以高效敲除lncRNA基因,揭示其在基因调控中的具体功能。同时,CRISPR激活和干扰技术为非编码基因的研究提供了新的思路,通过调控lncRNA的表达水平,进一步探索其在癌症等疾病中的临床应用。文章还探讨了CRISPR技术在未来lncRNA研究中的潜力,尤其是在解决基因组复杂性、靶向效率和脱靶效应等技术难题方面的进展。综上所述,CRISPR/Cas9技术不仅为研究lncRNA提供了强有力的工具,也为未来开发新的癌症诊断和治疗手段提供了新的思路和机会。 展开更多
关键词 规则间隔回文重复序列(CRISPR/Cas9) 长非编码RNA 基因调控 癌症
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运用CRISPR/Cas9技术构建敲除体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因的ACT-1人未分化甲状腺癌细胞系 被引量:2
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作者 文丹 黄蓉 +2 位作者 谢建平 温琥玲 林师宇 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期419-424,共6页
目的构建体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因敲除的ACT-1人未分化甲状腺癌单克隆细胞系。方法用分子克隆技术及成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建AXIN1基因敲除的单克隆细胞系;采用实时荧光定量PCR检测AC... 目的构建体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因敲除的ACT-1人未分化甲状腺癌单克隆细胞系。方法用分子克隆技术及成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建AXIN1基因敲除的单克隆细胞系;采用实时荧光定量PCR检测ACT-1细胞的AXIN1 mRNA水平,Western blot法检测AXIN1蛋白水平。结果通过T7检测成功获得有效的两个单链导向RNA(sgRNA)Cr3及Cr5;通过酶切鉴定及测序成功构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的靶向AXIN1的sgRNA病毒载体;成功获得包括阴性对照在内的4个单克隆ACT-1未分化甲状腺癌细胞系;敲除组细胞AXIN1 mRNA及蛋白水平均明显降低。结论采用CRISPR-Cas9技术成功建立了敲除AXIN1基因的ACT-1未分化甲状腺癌细胞系。 展开更多
关键词 的规律间隔的回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9) 未分化甲腺癌 体轴抑制蛋白1(AXIN1)
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CRISPR-Cas9系统抑制乙型肝炎病毒复制相关研究
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作者 邓万燕 孟田 +5 位作者 钱克莉 蔡雪飞 邓海君 胡接力 黄爱龙 龙泉鑫 《重庆医科大学学报》 CSCD 北大核心 2017年第11期1514-1521,共8页
目的:探讨成簇的、规律间隔的短回文重复序列-相关核酸酶9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein-9 nuclease,CRISPR-Cas9)技术的抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作用。方法:通过生物... 目的:探讨成簇的、规律间隔的短回文重复序列-相关核酸酶9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein-9 nuclease,CRISPR-Cas9)技术的抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作用。方法:通过生物信息学筛选,获得12条靶向HBV基因组不同区域的sg RNA(single-guide RNA,sg RNA)并分别构建psp Cas9-sg RNA质粒,与HBV1.3倍体复制质粒共转染至Hep G2细胞,通过荧光定量PCR筛选能够有效抑制HBV复制的sg RNA,并使用Southern blot验证获得的sg RNA功能;使用最新报道的重组共价闭合环状DNA(recombinant covalently closed circular DNA,rccc DNA)模型评估CRISPRCas9对HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,ccc DNA)的抑制水平,并通过克隆测序检测rccc DNA的突变状况;对C57小鼠进行尾静脉高压水动力注射(hydrodynamic injection,HDI)rccc DNA质粒与psp Cas9-sg RNA,检测不同时间点外周血中乙型肝炎病毒s抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBs Ag)及e抗原(hepatitis B virus e antigen,HBe Ag)水平,通过免疫组化技术观察CRISPR-Cas9处理后肝脏中乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B virus core antigen,HBc Ag)水平,在动物水平评估CRISPR-Cas9对HBV复制的抑制作用。结果:所筛选的靶向乙型肝炎病毒基因组聚合酶编码区以及衣壳蛋白编码区的sg RNA5及sg RNA9能有效抑制细胞中HBV复制,分别使细胞复制模型中rc DNA降低至对照组的(43.64±4.66)%(P=0.000)和(44.86±2.25)%(P=0.000);在r CCCDNA细胞模型中证实2组sg RNA分别使ccc DNA降低至对照组的(29.39±3.18)%(P=0.000)及(26.83±1.76)%(P=0.000);CRISPR-Cas9系统主要使rccc DNA的靶点区域发生以短片段缺失为主的突变,突变率位50%~60%。CRISPR-Cas9系统能够有效降低HBV水动力小鼠模型血清HBs Ag(sg RNA5:P=0.000;sg RNA9:P=0.001)及HBe Ag浓度(sg RNA5:P=0.000;sg RNA9:P=0.000);小鼠血清HBV DNA水平与对照组相比降低约1个lg值(sg RNA5:P=0.000;sg RNA9:P=0.001),肝脏免疫组化结果显示CRISPR-Cas9系统能够降低组织HBc Ag表达。结论:CRISPR-Cas9系统作为一种基因编辑技术,能够在细胞水平及动物模型中发挥抗HBV作用,可以作为一种新型的抗病毒策略并为HBV感染的治疗提供了一个新的方向。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 规律间隔的回文重复序列-相关核酸酶9技术 抗病毒作用
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弓形虫srs19d基因敲除株的构建及其在宿主细胞中的生物学功能分析 被引量:1
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作者 牛水珠 潘明 +1 位作者 葛层层 黄思扬 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第8期10-17,共8页
为探究弓形虫表面抗原1相关序列(SRS)蛋白家族新成员SRS19D的功能,本试验以弓形虫Ⅱ型Pru虫株为亲本,运用成簇规律间隔短回文重复-CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建了PruΔsrs 19 d敲除虫株,并进行了噬斑试验、细胞内增殖试验、体... 为探究弓形虫表面抗原1相关序列(SRS)蛋白家族新成员SRS19D的功能,本试验以弓形虫Ⅱ型Pru虫株为亲本,运用成簇规律间隔短回文重复-CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建了PruΔsrs 19 d敲除虫株,并进行了噬斑试验、细胞内增殖试验、体外缓殖子转化试验、小鼠毒力试验和小鼠脑包囊检测试验。噬斑试验和细胞内增殖试验结果显示,与Pru虫株相比,PruΔsrs 19 d敲除虫株在人包皮成纤维(HFF)细胞上形成的噬斑显著变小(P<0.05),纳虫泡内形成的速殖子个数显著减少(P<0.05)。体外缓殖子转化试验发现,与Pru虫株相比,PruΔsrs 19 d敲除虫株的体外缓殖子转化率极显著降低(P<0.01)。小鼠毒力试验结果显示,与Pru虫株相比,弓形虫PruΔsrs 19 d敲除虫株不会引起ICR小鼠的死亡(P<0.05)。小鼠脑包囊检测试验结果显示,与Pru虫株相比,PruΔsrs 19 d敲除虫株感染小鼠后形成的脑包囊数量极显著减少(P<0.01)。本试验成功构建了弓形虫PruΔsrs 19 d敲除虫株,发现srs 19 d基因在弓形虫的体外生长、复制、毒力和慢性感染中发挥重要作用,为进一步探究SRS19D的功能和作用机制提供参考。 展开更多
关键词 弓形虫 表面抗原1相关序列(SRS) srs19d 规律间隔回文重复-CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9) 生物学功能
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NOD-SIRPA基因原位敲入BALB/c转基因小鼠的构建及鉴定
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作者 陶明阳 李馨 +1 位作者 吕亚楠 胡正 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第3期557-566,共10页
目的:基于成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas) 9技术构建NOD-信号调节蛋白α (SIRPA)基因敲入的小鼠模型,为构建更先进的人源化小鼠模型提供参考。方法:基于CRISPR/Cas9技术,将NOD背景SIRPA基因敲入至BALB/c小... 目的:基于成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas) 9技术构建NOD-信号调节蛋白α (SIRPA)基因敲入的小鼠模型,为构建更先进的人源化小鼠模型提供参考。方法:基于CRISPR/Cas9技术,将NOD背景SIRPA基因敲入至BALB/c小鼠受精卵中,扩繁获得稳定基因型来源的纯合小鼠(SIRPA-KI鼠)进行实验,设计PCR引物,核酸电泳鉴定小鼠基因型。按照小鼠品系分为C57BL/6组、BALB/c组和SIRPA-KI组,各组随机取3只周龄相近小鼠进行实验。诱导成熟的骨髓巨噬细胞与人CD47-Fc融合蛋白共孵育,Streptavidin PE/Cy7染色,流式细胞术检测PE/Cy7平均荧光强度(MFI),比较各组小鼠SIRPA基因结合人CD47 Fc的能力。每只鼠尾静脉注射2×109羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的人红细胞,体内吞噬实验检测各组小鼠巨噬细胞体内吞噬人红细胞情况。随机取BALB/c和SIRPA-KI小鼠各1只诱导成熟骨髓巨噬细胞,体外吞噬实验检测各组小鼠巨噬细胞体内吞噬人红细胞情况。结果:成功获得BLAB/c SIRPANOD/NOD纯合小鼠。流式细胞术,与C57BL/6组比较,BALB/c组小鼠MFI明显升高(P<0.01);与C57BL/6组和BALB/c组比较,SIRPA-KI组小鼠MFI明显升高(P<0.01)。体内吞噬实验,C57BL/6组小鼠巨噬细胞整体清除人红细胞速率最快;巨噬细胞吞噬6 h时,与SIRPA-KI组比较,C57BL/6组人红细胞剩余百分率明显降低(P<0.01)且接近0%;与SIRPA-KI组比较,BALB/c组人红细胞剩余百分率明显降低(P<0.05)。体外吞噬实验,BALB/c组小鼠巨噬细胞明显吞噬人红细胞,且吞噬指数较高,为30.700%;与BALB/c组比较,SIRPA-KI组小鼠巨噬细胞吞噬指数明显降低(P<0.01)。结论:通过CRISPR/Cas9技术向BALB/c品系敲入NOD背景SIRPA基因,成功构建对人CD47亲和力增强和可明显抑制吞噬人红细胞且具有优越的人类细胞异种移植效率的小鼠模型。 展开更多
关键词 信号调节蛋白α BALB/c小鼠 C57BL/6小鼠 基于成规则间隔回文重复序列/基于成规则间隔回文重复序列相关蛋白9技术
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基于CRISPR/Cas9方法构建‘沪农灵芝1号’基因编辑系统 被引量:3
7
作者 张志刚 张劲松 +5 位作者 邹根 唐传红 冯杰 鲍大鹏 陈建波 谭贻 《食用菌学报》 CSCD 北大核心 2023年第2期9-18,共10页
构建密码子优化的cas 9表达质粒pMD-EXP-cas 9,通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化灵芝(Ganoderma lucidum)菌株‘沪农灵芝1号’(‘Hunong No.1’)单核菌株L1,得到含有cas9完整表达盒的菌株L1-cas9。利用T7启动子构建靶向u... 构建密码子优化的cas 9表达质粒pMD-EXP-cas 9,通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化灵芝(Ganoderma lucidum)菌株‘沪农灵芝1号’(‘Hunong No.1’)单核菌株L1,得到含有cas9完整表达盒的菌株L1-cas9。利用T7启动子构建靶向ura3基因的表达质粒psgRNA-1和psgRNA-2,体外转录后得到sgRNA 1和sgRNA 2。通过PEG介导的转化,将sgRNA 1和sgRNA 2转化进L1-cas9的原生质体中,得到ura3基因被破坏的突变体,首次在‘沪农灵芝1号’菌株单核体中构建成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑系统,ura3基因的编辑效率为4个突变体(107个原生质体)。利用0.006%曲拉通X-100优化PEG介导的转化系统,可使ura3基因编辑效率提高至18个以上突变体(107个原生质体),本研究的结果为灵芝基因功能的研究和分子育种提供更高效的方法。 展开更多
关键词 ‘沪农灵芝1号’ 基因破坏 的规律间隔的回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9) 曲拉通X-100
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CRISPR/Cas9技术敲除RAW264.7细胞的GPR43基因抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能 被引量:1
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作者 徐方明 苏丛 +5 位作者 伍婷 陈昊然 张鹏飞 刘艳艳 兰燕虎 李家斌 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期481-486,共6页
目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sg... 目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sgRNA插入pLenticrisprV2质粒中,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pLenticrisprV2;将病毒感染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序GPR43基因相关序列并与野生型GPR43基因进行比对,确认敲除成功的细胞株(GPR43^-/-RAW264.7细胞),Western blot法检测GPR43蛋白水平。肺炎克雷伯菌感染GPR43^-/-RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测细菌感染后细胞内白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的变化,并观察敲除GPR43后,RAW264.7细胞吞噬能力的变化。结果挑选的单克隆细胞经Western blot验证GPR43蛋白不表达,并且DNA测序结果显示在sgRNA插入位置缺失34个碱基,证明成功敲除GPR43基因。GPR43^-/-RAW264.7细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均低于对照组,且GPR43^-/-RAW264.7细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力降低。结论CRISPR/Cas9技术敲除GPR43基因,抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能及炎性细胞因子的产生。 展开更多
关键词 RAW264.7细胞 的规律间隔的回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9) G蛋白偶联受体43(GPR43) 肺炎克雷伯
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化学调控CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究进展 被引量:1
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作者 肖珩 李永奎 邢曦雯 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2023年第3期1-9,共9页
规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术作为一项基因工程领域革新式的技术,为癌症、遗传性疾病及感染... 规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术作为一项基因工程领域革新式的技术,为癌症、遗传性疾病及感染性疾病等多种重大疾病的治疗提供了极大的帮助.但如何在特定细胞和组织中实现时空调控的精准基因编辑,进而避免脱靶效应,依然是该技术在临床转化领域面临的重要挑战.近年来,通过化学分子和反应实现对CRISPR/Cas9活性的调控已经成为提升这项基因编辑技术效率的重要手段之一.本文综合评述了一些最近报道的化学调控CRISPR/Cas9基因编辑的方法,并对其在临床医学领域的应用前景进行了展望. 展开更多
关键词 化学调控 小分子 规律间隔回文重复序列及其相关蛋白9 基因编辑
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CRISPR/Cas9基因编辑非病毒递送系统
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作者 盛劲菡 郑琪臻 汪铭 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2023年第3期156-166,共11页
规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的基因编辑技术为哺乳细胞基因组的精准修饰与编辑研究提供了高效、快捷的工具,但其化学生物学应用依然面临着CRISPR基因编辑工具Cas9蛋白和gRNA的细胞及活体递送等问题.近年来... 规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的基因编辑技术为哺乳细胞基因组的精准修饰与编辑研究提供了高效、快捷的工具,但其化学生物学应用依然面临着CRISPR基因编辑工具Cas9蛋白和gRNA的细胞及活体递送等问题.近年来,研究人员通过开发多种非病毒递送载体,实现了编码CRISPR/Cas9基因编辑工具的DNA和信使RNA(mRNA)以及Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的递送,并应用于靶基因的化学修饰与编辑调控.本文主要概述了近期CRISPR/Cas9基因编辑递送的研究进展,并对其化学生物学应用前景进行了展望. 展开更多
关键词 规律间隔回文重复序列相关蛋白9(CRISPR/Cas9) 基因编辑 药物递送 非病毒载体 纳米颗粒
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CRISPR-dCas9系统在妇科肿瘤治疗研究中的应用
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作者 夏月(综述) 李力(审校) 《实用妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期116-119,共4页
2013年以来,CRISPR-Cas9基因编辑系统成为热点,随着研究深入,研究者们通过对RuvC中的D10A和HNH中的H840A两个位点进行点突变,使Cas9蛋白失去核酸酶活性,成为dCas9。虽然不再具有DNA切割活性,但在sgRNA的引导下依然可与目的基因结合。科... 2013年以来,CRISPR-Cas9基因编辑系统成为热点,随着研究深入,研究者们通过对RuvC中的D10A和HNH中的H840A两个位点进行点突变,使Cas9蛋白失去核酸酶活性,成为dCas9。虽然不再具有DNA切割活性,但在sgRNA的引导下依然可与目的基因结合。科学家将该系统应用于宫颈癌、卵巢癌及子宫内膜癌等妇科肿瘤的研究中并取得了巨大突破。通过以该系统为介导调节基因活性或基于dCas9蛋白无核酸酶活性的特性实现DNA实时检测,在妇科肿瘤的预防、筛查及治疗等方面均表现出潜在的临床应用价值。 展开更多
关键词 规律间隔回文重复序列 Cas9蛋白 妇科肿瘤
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基于CRISPR/Cas系统的纸基分析在快速检测食源性致病菌中的应用 被引量:2
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作者 李鹏儒 沈兴 +3 位作者 孟静南 罗林 王涓 徐振林 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1147-1160,共14页
由食源性致病菌引起的食品安全事件严重影响人类健康,开发针对食源性致病菌的快速检测技术十分必要。成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白(CRISPR-associated protein... 由食源性致病菌引起的食品安全事件严重影响人类健康,开发针对食源性致病菌的快速检测技术十分必要。成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)是原核生物的适应性免疫系统,具有特异性识别并切割核酸序列的功能。纸基分析方法作为一种简便性好、成本低廉的分析检测工具,在快速检测领域展现出良好的前景。因此,将CRISPR/Cas系统的高效识别能力和纸基分析方法的简便性相结合可实现对食源性致病菌的快速灵敏检测。本文简要介绍了CRISPR/Cas系统用于核酸检测的概况,对第二类单Cas效应蛋白系统的特点及原理进行概述,重点综述基于CRISPR/Cas系统的试纸分析、侧向流动分析和纸基微流控装置在检测食源性致病菌方面的应用,并讨论了CRISPR/Cas系统结合纸基分析建立检测方法的优势、当前的挑战及未来的发展前景。 展开更多
关键词 间隔回文重复序列相关蛋白 食源性致病菌 纸基分析 快速检测
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CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用 被引量:1
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作者 孔玉方 王慧煜 +2 位作者 袁向芬 许晓琳 吴绍强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第4期92-97,共6页
CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文... CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。 展开更多
关键词 规则间隔的回文重复序列及其相关蛋白12a(CRISPR/Cas12a) 动物疫病 核酸检测 试纸条
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基于CRISPR-Cas系统的光学信号传感检测策略综述 被引量:2
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作者 刘思彤 黄朝鹤 +4 位作者 罗美玉 王桢 陈虹铮 张钰婕 裴晓静 《光谱学与光谱分析》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2024年第4期918-924,共7页
簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR and CRISPR-associated system,CRISPR-Cas系统)是在大多数细菌和古菌中发现的一种获得性免疫系统,由Cas酶和引导RNA(guide RNA,gRNA)组成,根据gRNA序列的特异性识别并剪切靶标DNA或RNA。近年来,得益... 簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR and CRISPR-associated system,CRISPR-Cas系统)是在大多数细菌和古菌中发现的一种获得性免疫系统,由Cas酶和引导RNA(guide RNA,gRNA)组成,根据gRNA序列的特异性识别并剪切靶标DNA或RNA。近年来,得益于CRISPR-Cas系统优异的酶切活性,建立了多种生物传感技术(biosensor),光学信号传感策略简单、便携,广泛应用于科学研究和实际应用中。详细总结了近五年来基于CRISPR-Cas系统的各种光学传感策略的基本原理以及代表性成果和应用。同时,也对当前的应用前景和挑战进行展望。 展开更多
关键词 规则间隔回文重复序列 信号读出 光学传感
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靶向非洲猪瘟病毒EP152R基因sgRNA细胞系的构建及其对ASFV复制影响的研究 被引量:4
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作者 皇甫皓月 雷薪霖 +9 位作者 席飞 黄炼榆 王可欣 沈冬冬 张纪文 张振江 李芳 步志高 殷昊 赵东明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期452-458,共7页
有报道证实,缺失重要功能基因EP152R的非洲猪瘟病毒(ASFV)不能有效复制。为了筛选靶向ASFV EP152R基因的小向导RNA(sgRNA),分析EP152R基因对ASFV复制的影响,本研究利用簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)核酸酶系... 有报道证实,缺失重要功能基因EP152R的非洲猪瘟病毒(ASFV)不能有效复制。为了筛选靶向ASFV EP152R基因的小向导RNA(sgRNA),分析EP152R基因对ASFV复制的影响,本研究利用簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)核酸酶系统(CCTop)并利用猪的基因组作为脱靶对象设计并筛选靶向ASFV EP152R基因(72387nt~72845nt)的sg RNA,并采用非随机整合报告系统(TIDE)计算各对sg RNA的编辑效率确定最佳sg RNA。结果显示,筛选了5对靶向敲除ASFV EP152R基因的sg RNA,其中3对sg RNA对EP152R基因的编辑效率达30%~42%,另外两对sg RNA的编辑效率低于10%。将筛选的3对sg RNA退火后分别克隆至p-LentiCRISPRv2载体中,构建3个重组慢病毒质粒p-LentiCRISPRv2-gREP152R-1/2/3,并采用菌液PCR及测序鉴定正确后分别与2个辅助质粒共转染HEK293T细胞,72 h后获得各慢病毒并分别感染野猪肺细胞(WSL细胞),通过嘌呤霉素筛选表达各sg RNA的细胞WSL-g REP152R,并采用western blot鉴定。结果显示,构建的各细胞在40 ku处均出现特异性条带,而WSL细胞无该条带,表明正确构建表达3种EP152R sg RNA的细胞系WSL-g REP152R-1/2/3。将携带m Cherry报告基因的重组ASFV(mCherry-ASFV)以MOI 1感染各WSL-g REP152R细胞系,分别于不同时间观察荧光;收集各细胞上清液,采用荧光定量PCR(qPCR)检测ASFV P72基因的Ct值,并测定上清液中的病毒效价(感染后72 h)。观察结果显示,随感染时间的延长WSL-g REP152R-2/3中的红色荧光均明显减少;WSL-g REP152R-1及空白对照WSL细胞中的红色荧光则逐渐增多,但前者的红色荧光均少于后者。q PCR和TCID50测定结果显示,与空白对照WSL细胞相比,3种WSL-g REP152R细胞上清液中病毒扩增的Ct值均显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01),而病毒效价均显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01),且以WSL-g REP152R-2中的病毒效价最低。将m Cherry-ASFV感染各WSLg REP152R细胞并连续传3代,采用q PCR检测F2、F3代细胞上清液中的病毒扩增的Ct值。结果显示,与WSL细胞相比,各WSL-g REP152R细胞F2代上清液中ASFV扩增的Ct值均极显著升高(P<0.01),且WSL-g REP152R-2 F2代及WSL-g REP152R-1/2 F3代细胞上清液中均检测不到病毒扩增的Ct值。上述结果表明,本研究设计的sg RNA能够有效靶向ASFV EP152R基因并敲除该基因进而抑制ASFV及其子代病毒的复制,且g REP152R-2抑制ASFV复制的效果最好。本研究为ASFV疫苗的开发及抗ASF育种猪提供重要参考数据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9 EP152R g RNA
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基于RT-RAPID和CRISPR-Cas12a的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸检测方法的建立
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作者 冉红志 樊成 +4 位作者 王雪飞 刘静 康婕 钱卫东 王婷 《动物医学进展》 北大核心 2023年第9期44-50,共7页
为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技... 为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技术扩增引物、荧光探针、crRNA和报告分子;优化RT-RAPID的反应引物、反应温度和反应时间及Cas12a检测用的crRNA,并分析RT-RAPID-Cas12a方法的特异性和灵敏度。基于RT-RAPID荧光法和RT-RAPID-Cas12a荧光法的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸快速检测方法能在1 h内完成检测并得出结果,灵敏度分别为10 copies/μL和0.5 copies/μL,且两个方法均与诺如病毒GⅡ.17型、鼻病毒、偏肺病毒和博卡病毒无交叉反应。2个检测方法与RT-qPCR阳性样本一致率均为90%,阴性样本一致率均为100%。论文建立的基于RT-RAPID和Cas12a的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法均可高效快速地检测出诺如病毒GⅡ.6,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷且快速等特点。 展开更多
关键词 诺如病毒GⅡ.6亚型 反转录重组酶聚合酶扩增 规律间隔回文重复序列的/相关蛋白12a 核酸检测
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CRISPR/Cas系统在病原体检测方面的研究进展 被引量:6
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作者 王雅轩 朱晓雁 苏建荣 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期839-844,共6页
规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated,CRISPR/Cas)是一种广泛存在于细菌和古细菌内部的特有的适应性免疫系统,用于抵抗外来核酸入侵。目前,该系统被... 规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated,CRISPR/Cas)是一种广泛存在于细菌和古细菌内部的特有的适应性免疫系统,用于抵抗外来核酸入侵。目前,该系统被分为6个类型和22个亚型,常见被应用于核酸检测的Cas9、Cas12和Cas13分别属于II型、V型和VI型。根据世界卫生组织的标准,理想的病原体检测方法应该具备灵敏、特异、快速、低成本、易于使用和无需大型设备等特点,而CRISPR/Cas的特性使其在病原体检测方面显示出了巨大的潜力。本文主要总结了Cas9、Cas12、Cas13和Cas14在病原体检测中的应用,并对CRISPR/Cas未来的应用前景进行了展望。 展开更多
关键词 规律成间隔回文重复序列及其相关蛋白 基因编辑 病原体检测 生物传感器 诊断
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基因编辑技术在昆虫中的研究与应用 被引量:1
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作者 邱雨浩 贾豫 +2 位作者 倪建泉 王冰 王桂荣 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期246-256,共11页
基因编辑技术的发展对于昆虫生长发育和生殖等生理功能的研究以及行为调控机制的解析具有重要的意义。本文介绍了基因编辑技术的发展历程,阐述了锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription a... 基因编辑技术的发展对于昆虫生长发育和生殖等生理功能的研究以及行为调控机制的解析具有重要的意义。本文介绍了基因编辑技术的发展历程,阐述了锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术以及成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)protein 9,CRISPR/Cas9]介导的基因定点编辑技术的原理。在模式生物果蝇Drosophila中,三代基因编辑技术不断升级优化,具有编辑效率高、稳定传代和易于筛选等优势,有助于揭示细胞生物学、发育生物学和神经生物学等多个领域关键信号通路的作用机制;在医学媒介昆虫蚊子中,CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术在降低蚊虫抗药性、控制蚊虫种群数量和蚊媒疾病传播等方面具有重要研究价值;在农业害虫研究中,利用基因编辑技术能够实现多种信号通路中关键分子靶标的体内功能研究,为害虫治理提供新思路;在有益昆虫的研究中,基因编辑技术主要应用于家蚕Bombyx mori性别调控、抗病毒和提高蚕丝质量等方面。最后本文对基因编辑技术在昆虫研究中的发展做出如下几点展望:(1)优化基因编辑系统以提高编辑效率;(2)开发新型基因调控工具;(3)构建转基因昆虫品系,以期为昆虫基因功能的解析、经济性昆虫的改良、重大害虫的防治等研究提供借鉴与参考。 展开更多
关键词 基因功能 基因编辑技术 锌指核酸酶 类转录激活因子效应物核酸酶 规律间隔回文重复序列及其关联蛋白9
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益生菌遗传育种方法研究进展 被引量:1
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作者 高娉娉 刘汉清 +3 位作者 张凤 凌新 郭丽琼 林俊芳 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第22期302-310,共9页
益生菌的多样化益生作用使其在人类健康领域发挥着重要作用,基于益生菌生产的药品、食品和膳食补充剂也受到越来越多的关注。目前,研究人员致力于为药品和食品行业选育新型益生菌,以期为食品药品行业的发展提供新的思路。遗传育种为选... 益生菌的多样化益生作用使其在人类健康领域发挥着重要作用,基于益生菌生产的药品、食品和膳食补充剂也受到越来越多的关注。目前,研究人员致力于为药品和食品行业选育新型益生菌,以期为食品药品行业的发展提供新的思路。遗传育种为选育具有有益特性的益生菌菌株提供了一个很好的平台,这对提升益生菌的市场价值和人类健康具有重要意义。为了今后更好的开展益生菌育种工作,该文综述了原生质体融合、基因组重排、常压室温等离子体诱变及基因编辑技术[成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated,CRISPR-Cas)技术和碱基编辑技术]等遗传育种技术的研究现状及在益生菌中的应用,并讨论了遗传育种的安全性,旨在为优良益生菌的选育提供参考,促进益生菌资源的开发和利用。 展开更多
关键词 益生菌 原生质体融合 基因组重排 常压室温等离子体 规律间隔的回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated CRISPR-Cas) 碱基编辑
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基于上转换发光共振能量转移的CRISPR/Cas12a生物传感系统用于HPV16 DNA双信号检测 被引量:2
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作者 章丽玲 刘浏 +3 位作者 郑明秋 方文凯 刘达 唐宏武 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2022年第11期67-79,共13页
传统的纯核结构的上转换纳米材料用于生物传感时,存在表面猝灭效应或者因发光共振能量转移(LRET)效率不高导致灵敏度低等缺点,对目标物的灵敏检测有一定的局限性.本文通过多步高温共沉淀,介导壳层外延成长法,合成了NaYF_(4)∶Yb^(3+),Er... 传统的纯核结构的上转换纳米材料用于生物传感时,存在表面猝灭效应或者因发光共振能量转移(LRET)效率不高导致灵敏度低等缺点,对目标物的灵敏检测有一定的局限性.本文通过多步高温共沉淀,介导壳层外延成长法,合成了NaYF_(4)∶Yb^(3+),Er^(3+)(C-UCNPs)核层发光和NaYF_(4)@NaYF_(4)∶Yb^(3+),Er^(3+)@NaYF_(4)(CSS-UCNPs)内壳层发光能量限域型上转换纳米材料,并表征了材料的晶型、形貌、表面配体、元素组成和发光共振能量转移效率.结果表明,该材料具有表面猝灭效应低、发光共振转移效率较高的优势,随后将其与成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)12a-纳米金系统结合,实现了人乳头瘤病毒DNA(HPV16 DNA)的比色定性和上转换发光定量分析,检出限为69.8 pmol/L,双信号检测有效提高了检测结果的准确性.此外,本方法不仅特异性强,还能识别单碱基错配的HPV16 DNA,提高了DNA片段的容错率. 展开更多
关键词 上转换纳米材料 核/壳/壳结构 规律间隔的回文重复序列及其相关蛋白12a系统 人乳头瘤病毒
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