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RNA干扰构建载体在防治植物病毒病中的研究
1
作者 孙媛 李梅蓉 +3 位作者 卢建霖 赵大媛 毛振坤 乔燕 《农业与技术》 2025年第1期35-39,共5页
植物病毒病素有植物癌症之称,具有种类多,易于突变,传播途径广,繁殖迅速,寄主高度依赖性等特点。在开展植物病毒病防治研究中,未有特效药剂可以抑制植物病毒病传播,因此植物感染病毒病便会导致严重损失。而RNA干扰作为植物抵抗的天然防... 植物病毒病素有植物癌症之称,具有种类多,易于突变,传播途径广,繁殖迅速,寄主高度依赖性等特点。在开展植物病毒病防治研究中,未有特效药剂可以抑制植物病毒病传播,因此植物感染病毒病便会导致严重损失。而RNA干扰作为植物抵抗的天然防御机制,其具有抗病毒、稳定转座子、监控异常表达mRNA特性,利用RNA干扰技术获得转基因植物是防治植物病毒病的有效方法之一。本文通过对植物病毒病和RNA干扰及在防治植物病毒病中的应用进行综述,有利于更好地利用基因工程为植物病毒病的防治研究提供理论依据。 展开更多
关键词 植物病毒病 抑制 rna干扰 防治
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dsRNA纳米融合制剂研制及对烟草普通花叶病毒和烟草脉带花叶病毒的抑制效果
2
作者 张盼 郭玉双 +4 位作者 汪汉成 尹国英 曹领改 贾蒙骜 余永旭 《农药学学报》 北大核心 2025年第3期473-483,399,共12页
由烟草普通花叶病毒(TMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)所致花叶病是烟草上的主要病害,严重威胁烟叶产业的可持续发展。纳米材料介导的RNA干扰(RNAi)是一种新型的绿色、安全、高效防治技术,在植物病毒病防治中有着巨大的应用潜力。本研究... 由烟草普通花叶病毒(TMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)所致花叶病是烟草上的主要病害,严重威胁烟叶产业的可持续发展。纳米材料介导的RNA干扰(RNAi)是一种新型的绿色、安全、高效防治技术,在植物病毒病防治中有着巨大的应用潜力。本研究旨在筛选出对TMV和TVBMV病毒抑制效果最佳的靶标序列,并通过双链RNA(dsRNA)纳米材料递送体系解析其对TMV和TVBMV的抑制效果。基于TMV基因组的外壳蛋白(CP)和P126基因,以及TVBMV基因组的CP和HC Pro基因设计靶标片段,结合病毒诱导基因沉默(VIGS)试验,明确不同片段对TMV和TVBMV的抑制效果,筛选最佳靶标片段。体外合成dsRNA,并分别与3种纳米材料壳聚糖(CS)、碳量子点(CQD)和石墨烯量子点(GQD)融合,筛选最佳融合比例并制备得到纳米材料-dsRNA制剂,通过激光粒度仪、Zeta电位测试仪和透射电镜对3种纳米制剂进行了表征,验证了3种制剂对TMV和TVBMV的抑制效果。结果表明:VIGS注射P126对TMV的抑制效果较好,平均抑制率为53.96%;VIGS注射V-HC对TVBMV的抑制效果较好,平均抑制率为61.22%;表明P126和HC Pro基因片段为TMV和TVBMV的最佳靶标。dsRNA和纳米材料的融合试验表明,dsRNA和CS的最佳融合质量比为1∶1,dsRNA和CQD的最佳融合质量比为1∶10;dsRNA和GQD的最佳融合质量比为1∶7。纳米制剂的表征结果证明,dsRNA被成功负载在纳米材料上。纳米材料-dsRNA制剂对TMV和TVBMV的病毒抑制验证试验表明,纳米制剂显著提高了dsRNA对TMV和TVBMV的抑制效果,且GQDdsRNA和CQD-dsRNA组合的抑制效果最佳。 展开更多
关键词 烟草普通花叶病毒 烟草脉带花叶病毒 rna干扰 双链rna 抑制效果 纳米材料
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植物病毒来源的小干扰RNA及其在果树病毒研究中的应用 被引量：2
3
作者 陈玲 段续伟 +4 位作者 张晓明 闫国华 王晶 周宇 张开春 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1080-1088,共9页
RNA沉默是植物中重要的抗病毒机制之一。病毒侵染后,寄主细胞中产生大量病毒来源的小干扰RNA(virus-derived small interfering RNA,vsiRNA),vsiRNA装载到寄主ARGONAUTE(AGO)蛋白中形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing compl... RNA沉默是植物中重要的抗病毒机制之一。病毒侵染后,寄主细胞中产生大量病毒来源的小干扰RNA(virus-derived small interfering RNA,vsiRNA),vsiRNA装载到寄主ARGONAUTE(AGO)蛋白中形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)靶向病毒基因组,发挥抗病毒作用。近年来,科学家们通过对拟南芥的遗传分析和多种植物vsiRNA的高通量测序,揭示了vsiRNA的起源和生物合成过程。本文综述了vsiRNA的研究现状及其在果树病毒研究中的应用,为果树病毒研究及病毒病防控提供一定的思路和借鉴。 展开更多
关键词 果树病毒 病毒来源的小rna(vsirna) rna沉默 vsirna应用
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转病毒来源发夹RNA小麦表现对大麦黄矮病毒的抗性 被引量：6
4
作者 燕飞 张文蔚 +2 位作者 肖红 李世访 成卓敏 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期97-102,共6页
将大麦黄矮病毒GPV株系的复制酶基因片段和CP基因片段构建成可在植物细胞内表达含有双链复制酶RNA(茎)和反义CPRNA(环)的复合发夹RNA结构,希望能够诱发植物体针对病毒的RNA干扰作用,从而达到抗病毒目的。利用基因枪法将该结构导入小麦... 将大麦黄矮病毒GPV株系的复制酶基因片段和CP基因片段构建成可在植物细胞内表达含有双链复制酶RNA(茎)和反义CPRNA(环)的复合发夹RNA结构,希望能够诱发植物体针对病毒的RNA干扰作用,从而达到抗病毒目的。利用基因枪法将该结构导入小麦幼胚愈伤组织细胞后,通过在幼苗再生阶段进行以叶片为模板的快速PCR来加速阳性植株的筛选过程,最终共获得基因组整合有外源基因的小麦再生植株21株。对再生植株接种不同剂量的病毒,其中9株对BYDV-GPV有低度抗性,表现在低接毒量时无症状,接毒量提高时发病且严重;6株具中度抗性,表现在低接毒量时无症状,接毒量提高时局部有不严重症状;6株具高度抗性,两种情况下均无症状。抗性实验结果表明,hpRNA介导对BYDV的抗性可能受到BYDV含量的影响,具有剂量效应的特点。 展开更多
关键词 发夹rna rna干扰 大麦黄矮病毒 转基因 小麦
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慢病毒介导LOX-1基因RNA干扰抑制氧化应激诱导心肌细胞凋亡 被引量：7
5
作者 刘彬 黄佳城 +5 位作者 周迎春 孙学刚 曾文璧 李杏 臧书文 郝文文 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期165-168,172,共5页
目的构建大鼠凝集素养氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)RNA干扰慢病毒表达载体并观察LOX-1在氧化应激诱导心肌细胞凋亡中的作用。方法设计针对大鼠LOX-1的shRNA序列,将shRNA序列插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒载体中,构建慢病毒载体pLL3.... 目的构建大鼠凝集素养氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)RNA干扰慢病毒表达载体并观察LOX-1在氧化应激诱导心肌细胞凋亡中的作用。方法设计针对大鼠LOX-1的shRNA序列,将shRNA序列插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒载体中,构建慢病毒载体pLL3.7-LOXl。慢病毒载体及包装载体dR8.9、VSVG共转染293FT细胞包装慢病毒。慢病毒侵染H9C2大鼠心肌细胞,RT-PCR鉴定对LOX-1抑制效率,CCK-8、Hochest33258染色检测LOX-1对H_2O_2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果通过双酶切鉴定,证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,抑制LOX-1能抑制H_2O_2诱导的细胞活力下降,减轻H_2O_2诱导的心肌细胞凋亡,与H_2O_2组比较均有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建靶向大鼠LOX-1基因RNAi慢病毒载体,LOX-1激活可能在H_2O_2诱导心肌细胞凋亡中发挥重要作用。 展开更多
关键词 慢病毒 rna干扰 LOX-1 氧化应激 凋亡
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人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达 被引量：6
6
作者 周军 李建明 +2 位作者 杨发达 柳玉红 丁彦青 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期589-592,共4页
目的构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础。方法利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U... 目的构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础。方法利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和CDH22基因重组慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染大肠癌细胞SW480,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰CDH22基因的细胞亚系。结果成功构建CDH22真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8×105U/ml。荧光定量PCR结果表明,所获得的细胞克隆11中CDH22 mRNA水平的表达显著降低。结论成功构建出CDH22基因慢病毒RNAi表达载体,并获得CDH22基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系,为研究CDH22在大肠癌转移中的作用机制提供了研究基础。 展开更多
关键词 CDH22 rna干扰 慢病毒 结直肠癌
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慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立 被引量：8
7
作者 涂露霞 方唯意 +4 位作者 刘真 李欣 何英 谢思明 姚开泰 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期844-847,851,共5页
目的检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株。构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率。方法应用荧光定量PCR检测EIF4G1mRNA... 目的检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株。构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率。方法应用荧光定量PCR检测EIF4G1mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平。构建重组靶向EIF4G1shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA。用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞,经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株。最后荧光定量PCR检测干扰效率。结果在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高。PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未干扰组相比可明显抑制EIF4G1mRNA水平EIF4G1表达。结论成功构建了pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株。 展开更多
关键词 真核翻译起始因子4G1 慢病毒 重组质粒 rna干扰 鼻咽癌细胞
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不同靶点shRNA干扰对虾白斑综合征病毒增殖效果分析 被引量：8
8
作者 周俊芳 杨先乐 +2 位作者 万夕和 沈辉 房文红 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期105-108,共4页
设计合成了靶向对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组不同位点的5个shRNA:RR9、RR1、DP1、DP2和PK1,并在凡纳滨对虾体内实施了RNA干扰(RNAi)抗WSSV增殖的试验。结果显示:5个shRNA不同程度地抑制了WSSV的复制,降低了对虾的死亡率,其中,靶向病... 设计合成了靶向对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组不同位点的5个shRNA:RR9、RR1、DP1、DP2和PK1,并在凡纳滨对虾体内实施了RNA干扰(RNAi)抗WSSV增殖的试验。结果显示:5个shRNA不同程度地抑制了WSSV的复制,降低了对虾的死亡率,其中,靶向病毒核糖核酸还原酶的shRNA RR9的RNA干扰效果最佳。 展开更多
关键词 凡纳滨对虾 对虾白斑综合征病毒 rna干扰
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PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达 被引量：6
9
作者 柳玉红 李建明 +1 位作者 周军 丁彦青 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期509-512,共4页
目的构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系,为PRL-3基因功能研究奠定基础。方法设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体。通过与pENTRTM/U6 ent... 目的构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系,为PRL-3基因功能研究奠定基础。方法设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体。通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体。利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系。结果成功构建PRL-3pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L。RT-PCR、Western blotting结果表明,克隆1PRL-3 mRNA及蛋白显著降低。结论成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系。 展开更多
关键词 rna干扰 慢病毒 PRL-3 结直肠癌
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重组腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞影响的动物试验 被引量：4
10
作者 刘雄 李刚 +3 位作者 张宝 王路 李晓华 李湘平 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期611-614,618,共5页
目的探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对于鼻咽癌细胞在体内增殖及转移能力的影响。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(rAAV)载体:(增强型绿色荧光蛋白,EGFP)rAAV-EGFP和rAAV-shRNA-LMP-1... 目的探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对于鼻咽癌细胞在体内增殖及转移能力的影响。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(rAAV)载体:(增强型绿色荧光蛋白,EGFP)rAAV-EGFP和rAAV-shRNA-LMP-1,以不同滴度rAAV-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞确定最佳转染复数(MOI),rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1,RT-PCR鉴定抑制效率,将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下制作鼻咽癌异位肝种植的肝肺转移模型,观察肝脏成瘤及肝内、肺转移情况,分析LMP-1基因沉默在动物水平对鼻咽癌细胞成瘤及转移能力的影响。结果rAAV-EGFP以5×104v.g(virus genome,病毒基因组数)/细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,RT-PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×104v.g/细胞转染C666-1后目的基因抑制效率大于90%,动物试验结果显示rAAV-shRNA-LMP-1组肝脏成瘤体积与对照组rAAV-EGFP无显著差异,但显著减少了种植肿瘤的肝内及肺转移率。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,可在动物水平抑制鼻咽癌细胞转移,但对鼻咽癌细胞生长无显著影响。 展开更多
关键词 鼻咽癌 重组腺相关病毒 rna干扰 EB病毒潜伏膜蛋白1 转移
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RNA干扰能有效抑制SARS相关冠状病毒复制 被引量：3
11
作者 李阳 倪兵 +6 位作者 石辛甫 吴玉章 王希良 何仰东 肖宇 姜曼 黎万玲 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期F002-F002,共1页
关键词 rna干扰 SARS 冠状病毒 复制
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人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 被引量：6
12
作者 许波群 李瑛 +5 位作者 薛凯 李梅 马翔 刁飞扬 崔毓桂 刘嘉茵 《医学研究生学报》 CAS 2010年第2期117-122,共6页
目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白，功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程，多水平、多通路地调节靶因子，其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系，文中构建表达人SET基因的... 目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白，功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程，多水平、多通路地调节靶因子，其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系，文中构建表达人SET基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体。方法根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后，与退火的寡核苷酸连接，构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。该穿梭质粒经Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后与pAdTrack-CMV连接，构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescense protein，GFP）报告基因的穿梭质粒PATC—H1-siRNA。分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒PATC—H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒pAd—H1-siRNA后，转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据GFP报告基因的表达观察重组病毒的产生和感染效率，用Western blot检测人SET蛋白的表达水平。结果穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功；重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达；获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。经Western blot检测，SET基因腺病毒载体（AdH1-SiRNA／SET）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒载体组（AdH1-SiRNA／NS）相比，SET蛋白表达水平显著降低（P〈0．05），抑制效率为50％～70％。结论成功构建了表达人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA／SET，并在AD293细胞中验证其抑制SET蛋白表达的作用，为进一步研究SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。 展开更多
关键词 SET基因 rna干扰 重组腺病毒载体
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慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立 被引量：4
13
作者 李川 马纪 +1 位作者 张越 安靓 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期604-609,共6页
目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水平。构建带GFP的重... 目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting和Real-time PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。 展开更多
关键词 NESTIN 鼻咽癌细胞 慢病毒 重组质粒 rna干扰
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慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备 被引量：4
14
作者 杨志峰 王龙 +6 位作者 杨生生 匡颖 陈欢 徐国江 蔡在龙 王铸钢 毛积芳 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2007年第2期215-221,共7页
IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创... IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中. 展开更多
关键词 IKKα基因 慢病毒载体 rna干扰 转基因小鼠
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大鼠HSP27基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定 被引量：4
15
作者 黄捷 谢良地 +1 位作者 许昌声 王华军 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期488-492,共5页
目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达s... 目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达shRNA的结构酶切插入慢病毒转移质粒pNL-IRES2-EGFP,产生pNL-HSP27-IRES2-EGFP,在293T细胞中与VSVG、pHelper包装产生慢病毒。48 h后收集上清液,离心过滤后进行病毒滴度测定。用构建正确的慢病毒质粒载体感染血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs),检测干扰效果。结果酶切和测序两种方法结果证明3种质粒载体的插入序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为3.12×109fu.L-1。重组慢病毒质粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1的RNA干扰效率最高,为0.771。结论成功构建靶向大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体。为进一步研究HSP27功能和用慢病毒进行基因治疗奠定基础。 展开更多
关键词 热休克蛋白27 rna干扰 基因疗法 慢病毒
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慢病毒介导的c-met RNA干扰对人乳头状甲状腺癌K1细胞生物学行为的影响 被引量：8
16
作者 郑时玉 王丽 +1 位作者 刘泽兵 桂律 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1819-1824,共6页
目的:探讨c-Met在乳头状甲状腺癌(PTC)中的表达;构建针对人c-met基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并观察其对K1细胞c-met基因的沉默效应及对细胞生物学行为的影响。方法:免疫组化方法检测35例乳头状甲状腺癌及25例良性甲状腺疾病手术切... 目的:探讨c-Met在乳头状甲状腺癌(PTC)中的表达;构建针对人c-met基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并观察其对K1细胞c-met基因的沉默效应及对细胞生物学行为的影响。方法:免疫组化方法检测35例乳头状甲状腺癌及25例良性甲状腺疾病手术切除标本中c-Met的表达;构建人c-met基因的RNAi慢病毒载体,应用荧光定量RT-PCR与Western blotting检测其对c-met的干扰效率,应用克隆形成实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验检测其对细胞克隆形成、周期、迁移、侵袭能力的影响,应用裸鼠模型评估RNA干扰后细胞成瘤能力的影响。结果:c-Met在PTC中的表达明显高于良性甲状腺组织;成功构建了c-met RNAi慢病毒载体,RT-PCR及Western blotting实验显示其对乳头状甲状腺癌K1细胞c-met mRNA及蛋白表达的抑制均较明显;克隆形成实验显示c-met RNAi慢病毒载体能够抑制K1细胞的克隆形成能力;流式细胞术检测显示c-met RNAi慢病毒载体能够减少S细胞比列;划痕实验及Transwell实验显示c-met RNAi慢病毒载体能够抑制细胞迁移和侵袭;裸鼠成瘤实验显示RNA干扰后细胞的成瘤能力降低。结论:c-met RNAi慢病毒载体能够抑制K1细胞的克隆形成能力、细胞周期进程、迁移、侵袭及成瘤能力。 展开更多
关键词 甲状腺肿瘤 原癌基因 c-met 慢病毒载体 rna干扰
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RNA干扰在抗病毒研究中的应用 被引量：7
17
作者 陈芸 朱作言 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期356-359,共4页
关键词 rna干扰(rnaI) 小干扰rna(sirna) 抑制 靶基因 病毒
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单纯疱疹Ⅱ型病毒UL29基因shRNA表达载体的干扰效应 被引量：7
18
作者 黄畅 潘晓瑜 +1 位作者 袁俊杰 吕延成 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2014年第5期691-694,共4页
目的:应用RNA干扰技术,针对单纯疱疹Ⅱ型病毒(HSV-2)UL29基因构建短发夹RNA重组表达载体,观察其对HSV-2的干扰效应。方法:针对HSV-2 UL29基因筛选出4条拟干扰靶位点序列,分别设计、合成4组靶向UL29基因shRNA的基因真核表达载体。通过脂... 目的:应用RNA干扰技术,针对单纯疱疹Ⅱ型病毒(HSV-2)UL29基因构建短发夹RNA重组表达载体,观察其对HSV-2的干扰效应。方法:针对HSV-2 UL29基因筛选出4条拟干扰靶位点序列,分别设计、合成4组靶向UL29基因shRNA的基因真核表达载体。通过脂质体转染到HEK293细胞。再将HSV-2接种到HEK293细胞中。采用终点滴定法检测病毒滴度,RT-PCR检测shRNA对转录水平的影响,Western-blot检测shRNA对蛋白质表达水平的影响。结果:终点滴定法结果显示UL29shRNA各组均可不同程度降低病毒感染滴度,与空白组(未转染重组表达载体)比较差异显著(P<0.01)。RT-PCR结果显示,与空白组比较,4组抑制率分别为28.80%、59.95%、66.08%、36.27%,差异均具有显著性(P<0.05),shRNANC(不针对任何基因的序列)与空白组相比差异无显著性,其中以UL29shRNA1461组效果为最佳。Western-blot检测表明UL29shRNA各组ICP8蛋白表达水平比阴性对照组明显降低。结论:UL29shRNA能有效干扰HSV-2UL29基因的表达,抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制。 展开更多
关键词 疱疹病毒2型 人 rna干扰 SHrna UL29基因
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RNA干扰抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒N基因表达及病毒复制 被引量：4
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作者 黄良宗 钟科阳 +3 位作者 王淑敏 司兴奎 马春全 顾万军 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期148-150,F0003,共4页
根据siRNA设计原则,选取了PRRSV N基因上的保守序列作为可能的干扰位点,设计、合成了3个siRNAs,分别将其克隆到pSIREN-Shuttle中,获得3个siRNA重组表达质粒:pShuttle-N1,pShuttle-N2和pShuttle-N3。将siRNA重组表达质粒与融合表达质粒pE... 根据siRNA设计原则,选取了PRRSV N基因上的保守序列作为可能的干扰位点,设计、合成了3个siRNAs,分别将其克隆到pSIREN-Shuttle中,获得3个siRNA重组表达质粒:pShuttle-N1,pShuttle-N2和pShuttle-N3。将siRNA重组表达质粒与融合表达质粒pEGFP-ORF7共转染Marc145细胞,并通过荧光显微镜观察。结果显示,siRNA重组表达质粒能显著抑制PRRSV N基因的表达。在转染总剂量(0.7μg/孔)固定的条件下,分别将不同组合的siRNA表达质粒共转染Marc145细胞,各组合转染孔对PRRSV复制的抑制作用没有明显差异,其中3种siRNA表达质粒共转染对PRRSV复制的抑制最好,证实siRNA对病毒复制作用具有相加性。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) rna干扰 病毒复制
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靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定 被引量：3
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作者 冶贵生 张彦明 +1 位作者 徐浩 郭抗抗 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2007年第3期7-10,共4页
利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定... 利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 NS3基因 rna干扰 小发卡rna
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