猪圆环病毒2型(PCV2)可引起仔猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,PCV基因型多且常以混合感染为主,给养殖场造成严重经济损失。为建立一种能同时检测PCV2、PCV3、PCV4的荧光定量PCR(q PCR)方法,本研究根据...猪圆环病毒2型(PCV2)可引起仔猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,PCV基因型多且常以混合感染为主,给养殖场造成严重经济损失。为建立一种能同时检测PCV2、PCV3、PCV4的荧光定量PCR(q PCR)方法,本研究根据PCV2、PCV3和PCV4的rep基因序列,设计特异性引物和探针,利用三维响应面曲线优化扩增条件,建立了一种可同时检测3种PCV的三重Taq Man qPCR方法。通过将扩增的PCV2、PCV3、PCV4的rep基因片段克隆至pUC-57载体,构建重组质粒标准品,并经测序鉴定。特异性试验中,结果显示该方法仅对PCV2、PCV3、PCV4检测为阳性,对其他常见猪病毒及细菌检测结果均为阴性,特异性强;敏感性试验中,使用构建的3种重组质粒标准品等体积混合再10倍倍比稀后经该三重qPCR检测,结果显示该方法对PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品的检测限分别为1×10^(1)拷贝/μL、1×10^(2)拷贝/μL、1×10^(0)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验中,采用本研究建立的三重qPCR方法分别对3种浓度PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品进行组内和组间重复性检测,结果显示该方法组内和组间重复性试验的变异系数分别小于3.34%和2.77%,重复性较好。利用该方法检测浙江省送检的共120份仔猪组织病料及肛拭子样品,并利用已发表的检测PCV2、PCV3及PCV4的SYBR Green I qPCR方法同时检测,结果显示,本研究建立的方法对PCV2的检出率为60.8%(73/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为25.8%(31/120);SYBR Green I qPCR法对PCV2的检出率为65%(78/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为27.5%(33/120);两种检测方法的总符合率均为92.5%(111/120)。本研究首次建立了可用于鉴别检测临床样品中PCV2、PCV3、PCV4感染的q PCR鉴别检测方法,为猪场PCV感染的防控奠定基础。展开更多
【目的】通过研究猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PCV2)感染过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligands,PD-Ls)信号通路作用,寻找调节PCV2免疫抑制新途径,减少...【目的】通过研究猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PCV2)感染过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligands,PD-Ls)信号通路作用,寻找调节PCV2免疫抑制新途径,减少PCV2感染造成的经济损失。【方法】利用实验室构建的重组表达宿主菌pET32a-PD1/Rosetta(DE)进行诱导表达、纯化,获得猪可溶性PD-1蛋白(soluble PD-1,sPD-1)的诱导表达条件;制备大量具有活性的猪sPD-1蛋白,体外作用于PCV2感染的猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),分别通过CCK-8和流式细胞术检测PBMCs的增殖情况,间接免疫荧光法和RT-qPCR检测猪sPD-1蛋白对PCV2病毒载量的影响,RT-qPCR和ELISA检测猪sPD-1蛋白对免疫相关细胞因子IL-2、IL-12、IL-21、IL-17A和IFN-γ等的转录水平和分泌水平的影响。【结果】通过诱导表达、纯化获得了高纯度、高活性的重组猪sPD-1蛋白。与未使用猪sPD-1蛋白处理的PCV2感染PBMCs组相比,10μg·mL−1猪sPD-1蛋白处理的猪PCV2病毒载量下降至1000 copies·μL−1以下;CCK-8检测结果显示猪sPD-1蛋白处理组细胞增殖指数显著提高(P<0.05);流式细胞术检测发现猪sPD-1蛋白组的平均荧光强度为(68.60±10.14)%,相对于PCV2病毒组(28.70±3.18)%显著增强(P<0.05);反转录荧光定量PCR和ELISA检测,发现猪sPD-1蛋白处理组的细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的转录水平和分泌水平显著升高(P<0.05)。【结论】猪sPD-1蛋白可以通过阻断PD-1/PD-Ls通路降低PCV2的病毒载量,促进PBMCs的增殖,增强PBMCs细胞因子的转录水平和分泌水平免疫反应。因此,猪sPD-1蛋白在体外可以增强PCV2感染PBMCs的免疫反应,进一步为病毒性疾病的防控提供理论依据。展开更多
旨在了解近年来我国猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的分子流行病学特征和遗传变异情况。本研究选取GenBank数据库中168个国内(收录于2017—2023年)和9个国外PCV3基因组序列,利用生物信息学软件对其进行系统发育树构建...旨在了解近年来我国猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的分子流行病学特征和遗传变异情况。本研究选取GenBank数据库中168个国内(收录于2017—2023年)和9个国外PCV3基因组序列,利用生物信息学软件对其进行系统发育树构建、核苷酸同源性比对、氨基酸序列比对、抗原表位预测以及基因重组等分析,以期阐明PCV3在我国的传播及遗传进化规律。结果显示,我国PCV3的基因型可被划分为两个亚型,即PCV3a和PCV3b,且PCV3a和PCV3b均可进一步划分为不同的基因簇:PCV3a-1~PCV3a-3和PCV3b-1~PCV3b-5,其中PCV3a-1和PCV3b-2数量最多,占比最高;177个PCV3的全基因组序列相似性在98.3%~100%之间,其ORF2基因编码的氨基酸序列存在3个主要的点突变区,无碱基缺失和插入等情况。此外,基因重组分析表明,这些PCV3全基因组序列之间仅存在1个可能的重组事件,说明目前我国PCV3流行的基因型处于一个相对稳定的阶段。综上,本研究通过严格标准界定寻找到一种未来很可能被广泛认可的基因分型方法,且基于这种基因分型方法再对2017—2023年我国PCV3的遗传变异情况进行分析时所得到的结果较为可靠,这一结果不仅为未来PCV3的遗传变异分析研究提供了统一框架,更为进一步揭示PCV3的分子流行病学特征、遗传多样性和疫苗设计及防控策略的制定提供了基础资料。展开更多
文摘猪圆环病毒2型(PCV2)可引起仔猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,PCV基因型多且常以混合感染为主,给养殖场造成严重经济损失。为建立一种能同时检测PCV2、PCV3、PCV4的荧光定量PCR(q PCR)方法,本研究根据PCV2、PCV3和PCV4的rep基因序列,设计特异性引物和探针,利用三维响应面曲线优化扩增条件,建立了一种可同时检测3种PCV的三重Taq Man qPCR方法。通过将扩增的PCV2、PCV3、PCV4的rep基因片段克隆至pUC-57载体,构建重组质粒标准品,并经测序鉴定。特异性试验中,结果显示该方法仅对PCV2、PCV3、PCV4检测为阳性,对其他常见猪病毒及细菌检测结果均为阴性,特异性强;敏感性试验中,使用构建的3种重组质粒标准品等体积混合再10倍倍比稀后经该三重qPCR检测,结果显示该方法对PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品的检测限分别为1×10^(1)拷贝/μL、1×10^(2)拷贝/μL、1×10^(0)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验中,采用本研究建立的三重qPCR方法分别对3种浓度PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品进行组内和组间重复性检测,结果显示该方法组内和组间重复性试验的变异系数分别小于3.34%和2.77%,重复性较好。利用该方法检测浙江省送检的共120份仔猪组织病料及肛拭子样品,并利用已发表的检测PCV2、PCV3及PCV4的SYBR Green I qPCR方法同时检测,结果显示,本研究建立的方法对PCV2的检出率为60.8%(73/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为25.8%(31/120);SYBR Green I qPCR法对PCV2的检出率为65%(78/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为27.5%(33/120);两种检测方法的总符合率均为92.5%(111/120)。本研究首次建立了可用于鉴别检测临床样品中PCV2、PCV3、PCV4感染的q PCR鉴别检测方法,为猪场PCV感染的防控奠定基础。
文摘【目的】通过研究猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PCV2)感染过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligands,PD-Ls)信号通路作用,寻找调节PCV2免疫抑制新途径,减少PCV2感染造成的经济损失。【方法】利用实验室构建的重组表达宿主菌pET32a-PD1/Rosetta(DE)进行诱导表达、纯化,获得猪可溶性PD-1蛋白(soluble PD-1,sPD-1)的诱导表达条件;制备大量具有活性的猪sPD-1蛋白,体外作用于PCV2感染的猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),分别通过CCK-8和流式细胞术检测PBMCs的增殖情况,间接免疫荧光法和RT-qPCR检测猪sPD-1蛋白对PCV2病毒载量的影响,RT-qPCR和ELISA检测猪sPD-1蛋白对免疫相关细胞因子IL-2、IL-12、IL-21、IL-17A和IFN-γ等的转录水平和分泌水平的影响。【结果】通过诱导表达、纯化获得了高纯度、高活性的重组猪sPD-1蛋白。与未使用猪sPD-1蛋白处理的PCV2感染PBMCs组相比,10μg·mL−1猪sPD-1蛋白处理的猪PCV2病毒载量下降至1000 copies·μL−1以下;CCK-8检测结果显示猪sPD-1蛋白处理组细胞增殖指数显著提高(P<0.05);流式细胞术检测发现猪sPD-1蛋白组的平均荧光强度为(68.60±10.14)%,相对于PCV2病毒组(28.70±3.18)%显著增强(P<0.05);反转录荧光定量PCR和ELISA检测,发现猪sPD-1蛋白处理组的细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的转录水平和分泌水平显著升高(P<0.05)。【结论】猪sPD-1蛋白可以通过阻断PD-1/PD-Ls通路降低PCV2的病毒载量,促进PBMCs的增殖,增强PBMCs细胞因子的转录水平和分泌水平免疫反应。因此,猪sPD-1蛋白在体外可以增强PCV2感染PBMCs的免疫反应,进一步为病毒性疾病的防控提供理论依据。
文摘旨在了解近年来我国猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的分子流行病学特征和遗传变异情况。本研究选取GenBank数据库中168个国内(收录于2017—2023年)和9个国外PCV3基因组序列,利用生物信息学软件对其进行系统发育树构建、核苷酸同源性比对、氨基酸序列比对、抗原表位预测以及基因重组等分析,以期阐明PCV3在我国的传播及遗传进化规律。结果显示,我国PCV3的基因型可被划分为两个亚型,即PCV3a和PCV3b,且PCV3a和PCV3b均可进一步划分为不同的基因簇:PCV3a-1~PCV3a-3和PCV3b-1~PCV3b-5,其中PCV3a-1和PCV3b-2数量最多,占比最高;177个PCV3的全基因组序列相似性在98.3%~100%之间,其ORF2基因编码的氨基酸序列存在3个主要的点突变区,无碱基缺失和插入等情况。此外,基因重组分析表明,这些PCV3全基因组序列之间仅存在1个可能的重组事件,说明目前我国PCV3流行的基因型处于一个相对稳定的阶段。综上,本研究通过严格标准界定寻找到一种未来很可能被广泛认可的基因分型方法,且基于这种基因分型方法再对2017—2023年我国PCV3的遗传变异情况进行分析时所得到的结果较为可靠,这一结果不仅为未来PCV3的遗传变异分析研究提供了统一框架,更为进一步揭示PCV3的分子流行病学特征、遗传多样性和疫苗设计及防控策略的制定提供了基础资料。
