猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)均为致病性冠状病毒,可以引起猪呕吐、腹泻脱水和新生仔猪死亡。为了建立一种快速检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank登录的2种病毒基因的保守序列,设计...猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)均为致病性冠状病毒,可以引起猪呕吐、腹泻脱水和新生仔猪死亡。为了建立一种快速检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank登录的2种病毒基因的保守序列,设计了两对特异性引物,分别扩增其N、M基因保守区,并将其克隆至pMD19-T载体;将10倍梯度稀释的混合重组质粒作为标准品模板,建立了一种检测PDCoV和PEDV的双重的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,并对其反应的敏感度、特异性和重复性进行了检测。结果表明,本试验所建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法对PDCoV和PEDV的最低检测量分别为51和32拷贝·μL-1,且与PBoV、TGEV、PRV、PCV2无交叉反应,特异性较好;对2016年至2017年在河北省收集的130份仔猪腹泻样本检测,结果显示,PDCoV的检出率为16.9%,PEDV的检出率为66.2%,二者同时感染的检出率为2.3%,与普通RT-PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为PDCoV和PEDV的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。展开更多
为建立可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪丁型冠状病毒(PDCoV)的双重Taq Man qRT-PCR方法,本研究根据Gen Bank中的PEDV M基因及PDCo V N基因设计了两对特异性引物和探针,构建重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立其检测方法,结果显...为建立可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪丁型冠状病毒(PDCoV)的双重Taq Man qRT-PCR方法,本研究根据Gen Bank中的PEDV M基因及PDCo V N基因设计了两对特异性引物和探针,构建重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立其检测方法,结果显示,根据两种病毒质粒标准品构建的标准曲线的相关系数(R2)均为1,线性关系良好。该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪博卡病毒(PBo V)及猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,建立的单一与双重荧光定量PCR对PEDV及PDCo V的质粒标准品检测下限均分别为4.7×10^(1)拷贝/μL和3.17×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;对该检测方法的重复性进行验证,结果显示,该方法组内和组间的变异系数均小于3%,重复性好。利用建立的该双重Taq Man q RT-PCR检测方法分别对118份猪粪便样品进行检测,结果显示,PEDV阳性检出率为56.8%(67/118),PDCo V阳性检出率为33.1%(39/118),二者共感染率为16.1%(19/118)。本研究首次以PEDV M基因及PDCo V N基因为靶基因,建立了同时检测PEDV和PDCo V的双重Taq Man q RT-PCR,该方法具有快速、灵敏、准确、重复性高等优点,可用于这两种病毒的同时检测和快速排查。展开更多
文摘猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)均为致病性冠状病毒,可以引起猪呕吐、腹泻脱水和新生仔猪死亡。为了建立一种快速检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank登录的2种病毒基因的保守序列,设计了两对特异性引物,分别扩增其N、M基因保守区,并将其克隆至pMD19-T载体;将10倍梯度稀释的混合重组质粒作为标准品模板,建立了一种检测PDCoV和PEDV的双重的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,并对其反应的敏感度、特异性和重复性进行了检测。结果表明,本试验所建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法对PDCoV和PEDV的最低检测量分别为51和32拷贝·μL-1,且与PBoV、TGEV、PRV、PCV2无交叉反应,特异性较好;对2016年至2017年在河北省收集的130份仔猪腹泻样本检测,结果显示,PDCoV的检出率为16.9%,PEDV的检出率为66.2%,二者同时感染的检出率为2.3%,与普通RT-PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为PDCoV和PEDV的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。
文摘为建立可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪丁型冠状病毒(PDCoV)的双重Taq Man qRT-PCR方法,本研究根据Gen Bank中的PEDV M基因及PDCo V N基因设计了两对特异性引物和探针,构建重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立其检测方法,结果显示,根据两种病毒质粒标准品构建的标准曲线的相关系数(R2)均为1,线性关系良好。该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪博卡病毒(PBo V)及猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,建立的单一与双重荧光定量PCR对PEDV及PDCo V的质粒标准品检测下限均分别为4.7×10^(1)拷贝/μL和3.17×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;对该检测方法的重复性进行验证,结果显示,该方法组内和组间的变异系数均小于3%,重复性好。利用建立的该双重Taq Man q RT-PCR检测方法分别对118份猪粪便样品进行检测,结果显示,PEDV阳性检出率为56.8%(67/118),PDCo V阳性检出率为33.1%(39/118),二者共感染率为16.1%(19/118)。本研究首次以PEDV M基因及PDCo V N基因为靶基因,建立了同时检测PEDV和PDCo V的双重Taq Man q RT-PCR,该方法具有快速、灵敏、准确、重复性高等优点,可用于这两种病毒的同时检测和快速排查。
