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非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：2
1
作者 王小格 司煊瑛 +8 位作者 闫志伟 王飞 尤龙琪 刘梗 蔡茂 梁珺珹 梁玉秀 杜永坤 张改平 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第2期781-791,共11页
[目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重... [目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重组蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合制备单克隆抗体。通过Western blotting鉴定单克隆抗体特异性,通过ELISA方法测定腹水效价;利用在线软件预测p22蛋白抗原表位分布情况并合成重叠多肽,通过Dot blotting鉴定抗体识别的抗原表位。[结果]本研究成功构建了p22重组蛋白的原核表达质粒,获得原核系统表达的p22重组蛋白,分子质量约为22 ku。用纯化后p22蛋白作为免疫原免疫小鼠,成功筛选到4株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别为1G3D7G11、2G5H6H8、6D10G7D6和8F6F8B9,其腹水效价均达到1∶500 000。Western blotting结果显示,4株单克隆抗体均能与p22蛋白发生特异性反应。单克隆亚型鉴定结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8和6D10G7D6株单克隆抗体的重链均为IgG1类,8F6F8B9株单克隆抗体的重链为IgG2a类,4株单克隆抗体轻链均为Kappa型。Dot blotting检测结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8株单克隆抗体识别抗原表位位于第58—89位氨基酸处;8F6F8B9株单克隆抗体识别抗原表位位于第126—150位氨基酸处。[结论]本研究成功制备了4株ASFV p22蛋白的单克隆抗体,并初步鉴定了单克隆抗体所识别的B细胞表位区间。研究结果为p22蛋白的生物学功能研究和ASFV血清学检测提供了参考依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p22蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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鹅星状病毒2型单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：1
2
作者 王雯 佟贺 +1 位作者 杨兴淼 曹瑞兵 《南京农业大学学报》 北大核心 2025年第2期401-409,共9页
[目的]本研究旨在制备抗鹅星状病毒(goose astrovirus,GAstV)单克隆抗体并鉴定其识别的抗原表位,为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。[方法]通过原核表达系统表达并纯化GAstV-2 P2蛋白,用其免疫6周龄BALB/c雌鼠,利... [目的]本研究旨在制备抗鹅星状病毒(goose astrovirus,GAstV)单克隆抗体并鉴定其识别的抗原表位,为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。[方法]通过原核表达系统表达并纯化GAstV-2 P2蛋白,用其免疫6周龄BALB/c雌鼠,利用杂交瘤技术,经过细胞筛选和亚克隆,获得3株能稳定分泌抗P2蛋白的单克隆抗体,利用Western blot(WB)和间接免疫荧光(IFA)鉴定单抗特异性,用获得的单抗对GAstV感染阴、阳性肾脏切片进行免疫组化检测,用间接ELISA测定单抗效价和亚型,同时构建P2蛋白的不同截短体来鉴定单抗识别抗原表位。[结果]本研究共获得3株能稳定分泌抗P2蛋白抗体的杂交瘤细胞,命名为1B10、3C6、5B1。单抗效价分别为1∶2048000、1∶512000、1∶256000,亚型鉴定结果显示,3株单抗的重链均为IgG2b,轻链均为Kappa型。WB和IFA结果显示,3株单抗均可以特异性结合鹅星状病毒。免疫组化结果显示,5B1和3C6可以应用于免疫组化的检测。抗原表位鉴定结果显示,1B10识别_(109)TSTTSTGGLITELRN_(123),3C6识别_(206)LTDPEEDDDPLS_(217),5B1识别_(96)LNPELETAVLRV_(107)。[结论]本研究成功制备能识别不同抗原表位的3株单克隆抗体,为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定物质基础。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 P2蛋白 原核表达 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒D205R蛋白单克隆抗体的制备和抗原表位鉴定
3
作者 林志钊 赵燕燕 +6 位作者 任豪杰 史赛燕 韩世充 何文瑞 万博 张雨杭 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2025年第2期124-130,共7页
非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表... 非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表位。结果显示,成功构建pET32a-D205R表达质粒,并纯化大小约为44 ku的重组D205R蛋白。蛋白质免疫印迹(Western blot)检测结果表明,重组D205R蛋白与ASFV阳性血清发生特异性反应,有良好的免疫原性。利用杂交瘤细胞融合、筛选的方法,得到mAb 19A5。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测结果表明,mAb 19A5能特异性识别真核表达的重组D205R蛋白,并能检测到野生型D205R蛋白。用丙氨酸扫描法鉴定出167-SDPPVVWLGGRPGD-180是mAb 19A5的抗原表位,S167、W173、L174、G175、P178和D180是与mAb19A5结合的关键氨基酸。保守性和结构分析表明,抗原表位高度保守,且位于蛋白质表面,是线性表位。综上,成功制备mAb 19A5,并鉴定了mAb 19A5识别的抗原表位。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D205R蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定
4
作者 林琪虹 李长尧 +2 位作者 张朝霞 宋厚辉 翁长江 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期179-184,共6页
为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb... 为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb亚类鉴定试剂盒检测结果显示3D5 MAb为IgM型。采用western blot检测制备的3D5 MAb与293T细胞中过表达的E2蛋白及CSFV感染猪肾细胞(PK-15细胞)后(感染后不同时间)天然表达E2蛋白的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测3D5 MAb与PK-15细胞中天然表达E2蛋白的反应性。Western blot结果显示,过表达E2蛋白的293T细胞和感染CSFV的PK-15细胞中(感染后12 h)均出现了40 ku左右的特异性条带。IFA结果显示,感染CSFV的PK-15细胞中出现红色荧光。以上结果表明,制备的3D5 MAb均能够与过表达的和天然表达的E2蛋白有较强的反应性。利用一系列表达截短的重组E2片段,通过western blot鉴定3D5 MAb识别的抗原表位,结果显示,E2蛋白氨基酸序列中的157REKPFPHRMD167为3D5 MAb的抗原表位。本研究首次制备了CSFV E2蛋白的MAb,并对其进行了表位鉴定,为进一步深入研究CSFV E2蛋白的结构、功能、抗原表位的筛选及新疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体制备及抗原表位的鉴定
5
作者 陈桂娥 容芳 +3 位作者 苟鑫 孙荣航 李作生 陈瑞爱 《动物医学进展》 北大核心 2025年第1期23-28,共6页
为制备禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体,利用原核表达系统表达并纯化ALV p27蛋白,将其作为免疫原免疫注射Balb/c小鼠,用杂交瘤细胞融合和ELISA等筛选出阳性单克隆抗体细胞,对制备的单克隆抗体的抗体亚型、效价及特异性进行鉴... 为制备禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体,利用原核表达系统表达并纯化ALV p27蛋白,将其作为免疫原免疫注射Balb/c小鼠,用杂交瘤细胞融合和ELISA等筛选出阳性单克隆抗体细胞,对制备的单克隆抗体的抗体亚型、效价及特异性进行鉴定,将目的蛋白截短成4段,初步鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明,共筛选出4株单克隆细胞,其抗体亚类皆为IgG1型,其中3A1抗体效价为1∶64000,3B2为1∶256000,5F1为1∶128000,5G2为1∶8000;4株单克隆抗体识别的抗原表位在1-60 aa之间。研究结果为进一步建立ALV相关免疫学检测方法提供了重要的材料。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 P27蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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甲型流感病毒神经氨酸酶抗原蛋白表位与抗体的结构空间识别
6
作者 朱拯 陈郑珊 +8 位作者 张冠英 房婷 樊璞 毕磊 崔越 李泽亚 苏纯懿 迟象阳 于长明 《生物化学与生物物理进展》 北大核心 2025年第4期957-969,共13页
目的 基于甲型流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白抗原抗体复合物结构数据,探究抗原蛋白表位与抗体的空间结构识别关系。方法 完整收集SAbDab数据库中NA蛋白抗原抗体复合物结构数据,对蛋白质结构进行处理分析,获取抗原表位和相... 目的 基于甲型流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白抗原抗体复合物结构数据,探究抗原蛋白表位与抗体的空间结构识别关系。方法 完整收集SAbDab数据库中NA蛋白抗原抗体复合物结构数据,对蛋白质结构进行处理分析,获取抗原表位和相应抗体配位氨基酸序列和空间分布信息,统计分析结合抗体序列、基因使用频率、氨基酸使用偏好性和互补决定区(CDR)氨基酸长度;分析抗体结合的热点区域,进一步对抗体配位空间结构相似性进行计算和层次聚类,深入探究抗原表位与抗体的空间识别关系,通过生物膜干涉(BLI)实验验证靶向不同抗原表位的抗体的识别特异性。结果 SAbDab数据库中甲型流感病毒NA蛋白的抗原抗体复合物结构数据以H3N2、H7N9、H1N1亚型为主,抗原表位的热点位置主要集中在催化活性位点区域,抗体物种来源以人源和鼠源为主,鼠源抗体VJ基因组合使用频率最高的是IGHV1-12*01/IGHJ2*01,人源抗体VJ基因组合使用频率最高的是IGHV1-69*01/IGHJ6*01。结合在催化活性位点区域内与结合在催化活性位点区域以外其他区域的抗体,在重链CDR氨基酸长度与氨基酸使用偏好性方面存在显著差异。抗原表位与抗体配位具有特定的识别关系,部分相似的抗体配位结构特异性地识别相同的表位,可在结构上观察到结合区域的重叠,BLI实验也验证了这类抗体对表位的竞争结合。结论 NA蛋白抗原表位位点分布以催化活性位点及周围环状区域为主,空间构象互补与静电相互作用在抗体与抗原的催化活性区域识别和结合过程中发挥重要作用。抗原与抗体存在不依赖于抗体唯一序列的空间识别关系,不同序列的抗体也可能形成识别同一抗原表位的局部空间结构。 展开更多
关键词 甲型流感病毒 神经氨酸酶 抗原表位 抗体 抗体配位相似性
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猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位的研究进展
7
作者 刘豪丽 刘素梅 +1 位作者 刘占通 邱天宝 《河南畜牧兽医》 2025年第3期5-8,共4页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种基因组为单股正链的RNA病毒。PRRSV毒株不断发生突变和重组,在感染的猪体中一般为多种毒株并存,给我国的养猪业健康发展造成巨大的损失。免疫接种是预防PRRS最有效的措施,而PRRSV蛋白抗原表位是设... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种基因组为单股正链的RNA病毒。PRRSV毒株不断发生突变和重组,在感染的猪体中一般为多种毒株并存,给我国的养猪业健康发展造成巨大的损失。免疫接种是预防PRRS最有效的措施,而PRRSV蛋白抗原表位是设计疫苗的重要靶点。以PRRSV的非结构蛋白、主要结构蛋白以及次要囊膜蛋白基因编码的不同区域为特征,对已鉴定并报道的PRRSV蛋白抗原表位,分别进行简要的综述,为深入探究PRRSV对机体细胞感染的过程找寻新的研究思路,同时也为针对性的多表位定向疫苗的研制工作奠定基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 抗原表位 结构蛋白 非结构蛋白 次要囊膜蛋白 多表位定向疫苗
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猪急性腹泻综合征冠状病毒M蛋白的结构预测及抗原表位分析
8
作者 林广宇 《现代畜牧兽医》 2025年第4期19-23,共5页
研究旨在系统揭示猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)M蛋白的分子特征,为相关疫苗设计及抗病毒药物研发提供参考。试验基于生物信息学方法,系统解析SADS-CoVM蛋白的结构与免疫功能特性。结果显示:SADS-CoV M蛋白由228个氨基酸组成,含3... 研究旨在系统揭示猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)M蛋白的分子特征,为相关疫苗设计及抗病毒药物研发提供参考。试验基于生物信息学方法,系统解析SADS-CoVM蛋白的结构与免疫功能特性。结果显示:SADS-CoV M蛋白由228个氨基酸组成,含3个跨膜结构域,无信号肽,具有疏水稳定性。SADS-CoV M蛋白二级结构以α-螺旋(32.89%)和无规则卷曲(38.60%)为主;三级结构预测与SARS-CoV-2 M蛋白相似性为34.31%。根据三级结构进行B细胞表位预测分析,筛选出4个高概率B细胞表位(第13~23位、第65~73位、第80~88位、第188~195位),提示潜在免疫干预靶点。研究表明,SARS-CoV-2M蛋白分子稳定,免疫原性强,为新型疫苗研发提供了分子基础。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 M蛋白 生物信息学 抗原表位
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重组犬瘟热病毒抗原表位T'TB和犬细小病毒vp2基因的真核表达 被引量：1
9
作者 王亚君 华育平 高光慧 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期349-353,358,共6页
将人工合成的犬瘟热病毒抗原表位T'TB基因克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的转移载体pFastBacHTc上,命名为pFastBacHTc-T'TB。应用PCR方法扩增犬细小病毒vp2基因,将其克隆至pMD18-T载体,测序后将vp2基因插入T'TB基因下... 将人工合成的犬瘟热病毒抗原表位T'TB基因克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的转移载体pFastBacHTc上,命名为pFastBacHTc-T'TB。应用PCR方法扩增犬细小病毒vp2基因,将其克隆至pMD18-T载体,测序后将vp2基因插入T'TB基因下游,命名为pFastBacHTc-T'TB-VP2,进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得携带犬瘟热病毒T'TB细胞表位和犬细小病毒vp2基因的重组转染质粒Bacmid-BacHT-T'TB-VP2,转染昆虫细胞Sf-9后获得融合重组T'TB-VP2蛋白,大小约为70ku。经Westernblot分析,表达的蛋白可与犬细小病毒阳性血清反应,具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 犬细小病毒 犬瘟热病毒T^ITB抗原表位 VP2基因 杆状病毒表达系统 表达
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猫疱疹病毒多表位纳米颗粒疫苗的制备及免疫原性评价
10
作者 杨丹丹 刘冰 +6 位作者 赵维昊 赵亚楠 张玉蝶 郭巾玲 刘冬禹 殷玉和 吴丛梅 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第9期4260-4272,共13页
【目的】设计并开发针对猫疱疹病毒1型(FHV-1)gB、gD蛋白的多表位纳米颗粒疫苗,为FHV-1多表位纳米颗粒疫苗的抗原筛选与优化提供理论依据。【方法】本研究利用多种生物信息学工具对FHV-1 gB、gD蛋白的理化性质、跨膜结构、N-糖基化位点... 【目的】设计并开发针对猫疱疹病毒1型(FHV-1)gB、gD蛋白的多表位纳米颗粒疫苗,为FHV-1多表位纳米颗粒疫苗的抗原筛选与优化提供理论依据。【方法】本研究利用多种生物信息学工具对FHV-1 gB、gD蛋白的理化性质、跨膜结构、N-糖基化位点、二级结构、B细胞抗原表位、免疫原性和保守性进行分析。构建重组质粒pET20b-FBDF,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。经Ni柱亲和层析纯化及透析浓缩处理后得到重组蛋白FBDF,通过SDS-PAGE进行鉴定,BCA法测定蛋白含量,透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)观察自组装纳米颗粒的形态和粒径大小。将制备的FHV-1表位纳米颗粒疫苗皮下免疫BALB/c小鼠,评价其免疫原性。【结果】FHV-1 gB、gD蛋白的多个氨基酸域均表现出优异的亲水性、抗原性、结构柔韧性和表面可及性特征。FHV-1 gB、gD蛋白分别存在11和5个潜在的糖基化位点;蛋白二级结构均主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲组成,其中无规则卷曲占比最高;分别产生17和6个B细胞线性表位。筛选出3个高抗原性和保守性的优势抗原表位:gB_(1):197-208,gB_(2):314-325,gD:221-232。将表位使用柔性连接子(GGGGS)与Ferritin相连,经密码子优化后,构建pET20b-FBDF重组质粒。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白FBDF在30℃、0.5 mmol/L IPTG诱导16 h时成功可溶性表达。TEM和DLS结果显示,纯化后的FBDF蛋白可自组装成直径为16.55 nm的纳米颗粒。小鼠免疫结果显示,三免后14 d小鼠血清中抗体滴度达到峰值,其中FBDF+Al(OH)_(3)、FBDF+CpG、FRCPV组抗体滴度分别为1∶680000、1∶15600、1∶3500,显著高于PBS和Ferritin组(P<0.05)。接种FBDF可诱导小鼠产生较高水平的γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)和中和抗体,中和抗体水平最高可达1∶2^(5)。【结论】本研究构建的多表位纳米颗粒疫苗FBDF具有较好的免疫原性,可诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,为FHV-1多表位疫苗的研究奠定基础。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒(FHV) gB蛋白 gD蛋白 抗原表位预测 多表位疫苗
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口蹄疫病毒Asia1型猪源中和抗体的筛选与抗原表位鉴定 被引量：1
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作者 董开恒 黄书伦 +7 位作者 李凤娟 李坤 刘果 张强 包慧芳 李洪炫 卢曾军 张小丽 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5211-5221,共11页
Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流... Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流式细胞术分选免疫猪PBMCs中的抗原特异性B细胞,通过巢式PCR扩增单个B细胞IgG抗体重链与轻链可变区基因序列,分别构建IgG抗体重链与轻链表达质粒,将其共转染CHO-S细胞进行抗体表达;通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验(VNT)验证抗体反应性和中和活性,利用免疫印迹、中和抗体逃逸突变株筛选鉴定中和抗体所识别的抗原表位类型和抗原表位关键氨基酸。结果显示:获得了5株反应性良好的Asia1型FMDV特异性抗体,其中PD3和PD7为中和抗体,两株中和抗体识别相同表位,关键氨基酸为VP2蛋白72位残基(D)。本研究首次获得Asia1型FMDV特异性猪源中和抗体,鉴定VP272D是中和表位的关键氨基酸,进一步丰富了Asia1型FMDV抗原位点信息,为FMDV Asia1型分子疫苗和新诊断检测技术研究的奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 Asia1型 猪源单克隆抗体 抗原表位
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2.1亚型猪瘟病毒流行株E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定 被引量：6
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作者 张艺潇 吴梦 +3 位作者 米士江 刘钟迪 涂长春 龚文杰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期511-521,共11页
为获得仅与我国基因2.1亚型猪瘟病毒(CSFV)流行株反应的单克隆抗体(MAb),并揭示疫苗株与流行株E2蛋白抗原氨基酸的差异,本研究利用基因2.1亚型重组质粒p FastBac1-JL23 E2通过杆状病毒表达重组E2蛋白(rE2),并采用Ni柱纯化后经SDS-PAGE检... 为获得仅与我国基因2.1亚型猪瘟病毒(CSFV)流行株反应的单克隆抗体(MAb),并揭示疫苗株与流行株E2蛋白抗原氨基酸的差异,本研究利用基因2.1亚型重组质粒p FastBac1-JL23 E2通过杆状病毒表达重组E2蛋白(rE2),并采用Ni柱纯化后经SDS-PAGE检测r E2的表达及纯化效果;采用western blot鉴定r E2的反应原性。SDS-PAGE及western blot结果表明经杆状病毒表达了基因2.1亚型CSFV E2蛋白,且其纯化效果和反应原性均较好。采用杂交瘤技术制备2.1基因亚型CSFV E2蛋白的单克隆抗体(MAb),采用亲和层析法纯化该MAb,采用BCA法测定其浓度及亚类。将79株1.1、2.1、2.2和2.3基因亚型的CSFV及1.1基因亚型的HCLV株和SM株感染PK-15细胞,72 h后采用IFA检测MAb与不同基因型CSFV的反应性;采用western blot鉴定MAb与10个基因亚型共18种CSFV代表株E2蛋白的反应性。采用IFA鉴定MAb与不同基因型CSFV的中和活性。结果显示,经IFA筛选后共获得16株分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株。其中仅一株MAb TCH061与所有2.1基因亚型(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j、2.1k、2.1l、2.1m、2.1n)CSFV感染的细胞反应后出现绿色荧光,与基因1.1亚型HCLV疫苗株和SM株以及其他基因型CSFV感染的细胞反应后均无绿色荧光;western blot结果显示,该MAb能够识别2.1基因亚型CSFV E2蛋白(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j),在90 ku处出现特异性条带,而与其他基因型CSFV E2蛋白均不反应。表明TCH061为2.1基因亚型CSFV E2蛋白特异性的MAb。MAb的纯化结果显示,在50 ku和25 ku处有明显条带,其浓度为1.70μg/μL且该MAb TCH061重链为Ig G2a,轻链为κ链。中和活性结果显示,TCH061对JL^(23)株(2.1b)、GDLF1株(2.1c)有一定的中和活性,但不能中和C株。分别以GD53株E^(24)个不同区域的截短蛋白为抗原通过western blot初步确定MAb识别抗原表位的区域。利用CLC Sequence Viewer比对与MAb反应的CSFV E2蛋白氨基酸序列的差异,通过SWISS-MODEL预测MAb抗原表位的关键氨基酸位点。利用杆状病毒表达CSFV JL^(23)株各位点突变后的E2蛋白,采用western blot鉴定各突变的E2蛋白与MAb TCH061的反应性。Western blot结果显示,TCH061的抗原表位位于E2蛋白的aa1~aa90,且其识别CSFV E2蛋白P^(20)不识别L^(20)的CSFV。通过SWISS-MODEL预测E2蛋白氨基酸序列的I18、G^(19)、P^(20)、L^(21)、G^(22)、A^(23)和E^(24)在空间上比较接近;MAb TCH061与JL^(23)株I18M突变的E2蛋白反应,与G^(19)K、P^(20)L和L^(21)P突变的E2蛋白均不反应,与G^(22)K突变的E2蛋白反应性较弱,与HCLV E2蛋白不反应,但与HCLV L^(20)P突变的E2蛋白反应。证实TCH061的抗原表位为^(19)GPLG^(22),经Py MOL结构模拟确定其为空间构象表位;且除了aa^(20),其他位点在各基因型CSFV中均非常保守,表明P^(20)是2.1基因亚型CSFV流行株E2蛋白抗原表位的关键氨基酸。综上所述,本研究首次获得一株区别于CSFV疫苗株和2.1基因亚型CSFV流行株的MAb TCH061,揭示了疫苗株与流行株E2蛋白氨基酸位点的差异,为研发猪瘟疫苗和CSFV流行株感染的血清学鉴别检测方法的建立提供了重要的MAb资源。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 单克隆抗体 病毒反应性 抗原表位
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靶向SARS-CoV-2棘突蛋白中独特B细胞抗原表位的鲨鱼单域抗体的研制
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作者 王越 沈立军 +2 位作者 方权 张锋 罗永能 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第1期32-39,共8页
目的制备特异性识别SARS-CoV-2棘突蛋白中独特B细胞抗原表位的鲨鱼单域抗体,并探究其在靶向SARS-CoV-2棘突蛋白S的免疫学检测中的作用。方法根据SARS-CoV-2棘突蛋白独特B细胞抗原表位序列人工合成多肽S9,与载体蛋白KLH偶联后对条纹斑竹... 目的制备特异性识别SARS-CoV-2棘突蛋白中独特B细胞抗原表位的鲨鱼单域抗体,并探究其在靶向SARS-CoV-2棘突蛋白S的免疫学检测中的作用。方法根据SARS-CoV-2棘突蛋白独特B细胞抗原表位序列人工合成多肽S9,与载体蛋白KLH偶联后对条纹斑竹鲨进行背部皮下免疫。尾静脉采血并分离外周血淋巴细胞,从中提取总RNA后逆转录为cDNA,以cDNA为模板扩增条纹斑竹鲨vNAR片段,与载体pComb3XSS连接构建噬菌体文库。从噬菌体文库中淘选识别该抗原表位的阳性克隆。将抗体基因克隆至pET-28a构建表达载体,诱导大肠杆菌原核表达并纯化获得鲨鱼单域抗体,分别应用于WB、ELISA和IFA等方法检测SARS-CoV-2棘突蛋白。结果共获得1个鲨鱼单域抗体克隆T01。重组表达并纯化的鲨鱼单域抗体T01与多肽S9结合的亲和力良好,EC50为(2.050±0.064)nmol/L且可特异性结合棘突蛋白的NTD片段。WB检测显示鲨鱼单域抗体T01能特异性地识别重组SARS-CoV-2棘突蛋白S1片段,而与其他6种感染人的冠状病毒的重组棘突蛋白S1片段没有交叉反应;IFA检测提示鲨鱼单域抗体T01可特异性地结合瞬间表达于HEK293细胞内的SARS-CoV-2棘突蛋白。结论成功制备一株靶向SARS-CoV-2棘突蛋白中独特B细胞抗原表位的鲨鱼单域抗体,为新型冠状病毒抗原检测提供了有效工具。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 棘突蛋白 B细胞抗原表位 条纹斑竹鲨 单域抗体
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猫杯状病毒VP1蛋白的单克隆抗体制备及抗原表位鉴定
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作者 张泽宇 董宁宁 +5 位作者 谈晓梅 李传锋 朱杰 刘光清 张伟 孟春春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5784-5791,共8页
本研究旨在制备并鉴定针对猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)VP1蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)。本研究使用SH14株FCV全病毒作为免疫原,通过腹腔注射法免疫BALB/c小鼠,制备了针对VP1蛋白的mAb。通过ELISA筛选,成功获... 本研究旨在制备并鉴定针对猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)VP1蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)。本研究使用SH14株FCV全病毒作为免疫原,通过腹腔注射法免疫BALB/c小鼠,制备了针对VP1蛋白的mAb。通过ELISA筛选,成功获得特异性单克隆抗体3A3C1株。对3A3C1株mAb进行了全面的生物学特性鉴定,3A3C1株mAb确认为IgG_(1)型,轻链为κ链。Western blot和间接免疫荧光检测的结果显示,3A3C1株mAb能特异性地识别并结合FCV SH14株、F9株和GZ22。此外,本研究还深入探究了3A3C1株mAb的线性抗原表位。通过分段表达VP1蛋白并进行详细的Western blot分析,最终确定3A3C1株mAb的线性抗原表位位于VP1蛋白的^(426)PSRLTPAGDYAITSG^(440)区域。本研究制备的3A3C1株mAb不仅是理解FCV免疫学特性的重要工具,也对发展FCV诊断方法和疫苗策略具有潜在应用价值。 展开更多
关键词 猫杯状病毒 单克隆抗体 抗原表位 衣壳蛋白
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大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白单克隆抗体制备与抗原表位鉴定
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作者 宋占林 明胜利 +5 位作者 曾磊 潘佳佳 赵黎明 刘桃雪 王江 刘忠虎 《河南农业科学》 北大核心 2024年第10期149-158,共10页
以大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass iridovirus,LMBV)主衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)为检测靶蛋白,利用原核表达系统表达MCP重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP/20)融合,经亚克隆筛选、小鼠... 以大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass iridovirus,LMBV)主衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)为检测靶蛋白,利用原核表达系统表达MCP重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP/20)融合,经亚克隆筛选、小鼠腹腔接种、收集腹水等过程获得单克隆抗体;利用免疫印迹技术对所制备的单克隆抗体免疫识别的特异性以及其识别的抗原表位进行研究分析,为研制适于养殖现场快速检测LMBV的胶体金检测试纸条奠定基础。结果表明,获得了1株单克隆抗体2C9-6。特异性分析结果显示,单克隆抗体2C9-6可以特异性识别真核表达的LMBV-MCP和LMBV病毒颗粒。抗原表位分析结果表明,单克隆抗体2C9-6识别LMBV-MCP的抗原表位位于LMBV-MCP蛋白N端第1—20位氨基酸。 展开更多
关键词 大口黑鲈虹彩病毒 主衣壳蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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应用噬菌体展示随机12肽库筛选诺如病毒抗原模拟表位
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作者 周飞园 王璐 +6 位作者 梁芷妍 林璧慧 李佳恒 王宇 井多娜 张绪富 戴迎春 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期383-388,共6页
目的:利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选诺如病毒(NoV)的抗原模拟表位。方法:包被与GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17型NoV具有高特异性及中和能力较强的单链可变片段抗体(scFv),用Ph.D.-12噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选。ELISA鉴定淘选所得噬菌体与... 目的:利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选诺如病毒(NoV)的抗原模拟表位。方法:包被与GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17型NoV具有高特异性及中和能力较强的单链可变片段抗体(scFv),用Ph.D.-12噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选。ELISA鉴定淘选所得噬菌体与scFv的结合活性及其与NoV P蛋白的竞争作用;阳性克隆测序后进行生物信息学分析,合成多肽鉴定其抗原性。结果:发现1段与GⅡ.6 VP1区同源性较高的氨基酸序列“MG-D-W”,综合分析提示其可能为GⅡ.6 NoV的抗原模拟表位,且合成的包含“MG-D-W”的多肽可竞争抑制P蛋白与人类组织血型抗原(HBGAs)受体的结合。结论:“MG-DW”是与NoV单链抗体高亲和力的肽段,可能模拟了GⅡ.6 NoV与scFv结合的抗原表位。 展开更多
关键词 诺如病毒 12肽库 抗原模拟表位 单链可变片段抗体
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基于生物信息学诺如病毒多表位抗原的构建及鉴定
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作者 杜雪 赵印震 +4 位作者 张怡青 王晓军 王旭东 郭兰英 王云龙 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期2391-2398,共8页
目的:基于生物信息学技术设计诺如病毒(NoV)的多表位抗原并进行制备及鉴定。方法:采用生物信息学方法构建NoV多表位抗原NoV-ZH并进行分析。通过原核表达系统制备重组蛋白并鉴定,经动物免疫、杂交瘤技术制备单克隆抗体,并在胶体金平台初... 目的:基于生物信息学技术设计诺如病毒(NoV)的多表位抗原并进行制备及鉴定。方法:采用生物信息学方法构建NoV多表位抗原NoV-ZH并进行分析。通过原核表达系统制备重组蛋白并鉴定,经动物免疫、杂交瘤技术制备单克隆抗体,并在胶体金平台初步应用。结果:设计的多表位抗原二级结构中无规卷曲占比较大,理论分子质量及等电点(PI)为13.1 ku、7.16,性质稳定,亲水性较好。免疫评估显示具有良好的免疫原性,可激活体液免疫应答和细胞免疫应答。抗原序列连接pET-28a(+)、pET-32a载体后制备的蛋白分别以包涵体蛋白、可溶性蛋白的形式表达。经动物免疫、杂交瘤技术获得一对配对抗体,应用于胶体金试纸条灵敏度达0.5 ng/ml,试纸条可特异性结合两种基因型NoV重组衣壳蛋白。结论:成功制备诺如病毒多表位抗原并鉴定,为后续NoV通用型检测靶点探究及诊断原材料开发提供参考。 展开更多
关键词 诺如病毒 生物信息学分析 多表位抗原
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羊口疮病毒114蛋白的优势抗原表位预测及ORFV多表位疫苗的构建 被引量：2
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作者 周伟杰 梁绍波 +1 位作者 龙琴琴 庞峰 《贵州畜牧兽医》 2024年第1期21-24,共4页
为了探究羊口疮病毒114蛋白作为羊口疮病毒多表位疫苗靶标的可能性,试验利用在线软件ABCpred预测114蛋白的优势B细胞表位,利用在线软件IEDB的MHC-Ⅰbinding server预测114蛋白的优势细胞毒性T细胞(CTL)表位;利用IEDB的MHC-Ⅱbinding ser... 为了探究羊口疮病毒114蛋白作为羊口疮病毒多表位疫苗靶标的可能性,试验利用在线软件ABCpred预测114蛋白的优势B细胞表位,利用在线软件IEDB的MHC-Ⅰbinding server预测114蛋白的优势细胞毒性T细胞(CTL)表位;利用IEDB的MHC-Ⅱbinding server预测114蛋白的优势辅助性T细胞(HTL)表位;使用柔性短肽接头连接114蛋白的优势B、T细胞抗原表位,构建羊口疮病毒多表位疫苗。结果:羊口疮病毒114蛋白由346个氨基酸组成,包含12个优势B细胞抗原表位,分别位于292~307 aa、264~279 aa、146~161 aa、331~346 aa、113~128 aa、298~313 aa、35~50 aa、324~339 aa、281~296 aa、162~177 aa、315~330 aa、204~219 aa;包含1个优势CTL抗原表位,位于65~73 aa;包含5个优势HTL抗原表位,分别位于69~83 aa、68~82 aa、70~84 aa、48~62 aa、284~298 aa;构建了基于114蛋白的优势抗原表位的羊口疮病毒多表位疫苗。结论:羊口疮病毒114蛋白包含多个优势B细胞和T细胞抗原表位,可作为羊口疮病毒多表位疫苗的候选靶标,具有诱导强烈体液免疫与细胞免疫反应的可能性。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 114蛋白 B细胞抗原表位 T细胞抗原表位 多表位疫苗
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H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析 被引量：16
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作者 南文龙 金宁一 +5 位作者 鲁会军 赵翠青 田明尧 谭磊 张金双 白靓 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期630-633,637,共5页
目的:预测H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性。方法:依据近年H5N1亚型禽流感病毒流行趋势,下载得到相关HA蛋白氨基酸序列。进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特... 目的:预测H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性。方法:依据近年H5N1亚型禽流感病毒流行趋势,下载得到相关HA蛋白氨基酸序列。进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性。通过BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清,初步鉴定候选表位抗原性。结果:综合多项预测及空间构象模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA141～155、HA206～223、HA302～316。候选表位处于H5N1亚型禽流感HA1蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H5N1亚型禽流感病毒HA相应区域具有较好的一致性。而不同候选表位在BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能。结论:所筛选的表位具有成为H5N1亚型禽流感病毒HATh和B细胞相关抗原表位的可能。本研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H5N1亚型禽流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒 血凝素 H5N1 抗原表位
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鸭坦布苏病毒E蛋白特异性抗原表位鉴定及Epitope-ELISA血清学诊断方法建立 被引量：15
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作者 李晨曦 白小飞 +3 位作者 邵周伍林 张青山 刘明 张云 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期1958-1968,共11页
旨在建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)的特异性血清学诊断方法。本研究以纯化的单克隆抗体1A5为固相筛选分子,利用噬菌体展示技术鉴定DTMUV囊膜(E)蛋白的特异性抗原表位,并利用DNAStar分析抗原表位序列在DTMUV中保守性和与其他黄病毒的E蛋白相... 旨在建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)的特异性血清学诊断方法。本研究以纯化的单克隆抗体1A5为固相筛选分子,利用噬菌体展示技术鉴定DTMUV囊膜(E)蛋白的特异性抗原表位,并利用DNAStar分析抗原表位序列在DTMUV中保守性和与其他黄病毒的E蛋白相应位点的氨基酸序列相似性。结果成功筛选到DTMUV E蛋白的一个线性抗原表位_(87)YAEYI_(91),该抗原表位在DTMUV中具有高度的保守性,无氨基酸位点差异,而与其他黄病毒E蛋白相应位点的氨基酸序列不具有相似性。Dot-Blotting结果表明表位_(87)YAEYI_(91)与DTMUV阳性血清具有良好的亲和性,而与JEV、DENV、WNV等黄病毒阳性血清间不出现交叉反应,可见抗原表位_(87)YAEYI_(91)为DTMUV所特有的抗原表位。利用DTMUV特异性抗原表位87YAEYI_(91)建立Epitope-ELISA血清学诊断方法并对126份鸭血清样品进行检测,以中和试验作为标准进行比较,结果显示Epitope-ELISA检测方法的相对特异性为100%,相对敏感度为96%,并且Epitope-ELISA与其他黄病毒血清间不出现交叉反应性,表明本研究建立的Epitope-ELISA检测方法是一种特异的、灵敏的ELISA血清学诊断方法。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒 抗原表位 交叉反应性 Epitope-ELISA
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