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烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的表达、纯化及活性测定 被引量：3
1
作者 吕小群 张偌瑜 +2 位作者 徐学文 管云枫 缪朝玉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期1251-1254,共4页
目的获得具有较高纯度和酶活性的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶-1(Nmnat1),为进一步对其功能及调控的研究奠定基础。方法在大肠杆菌中进行Nmnat1表达的条件优化,采用Ni-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化,并通过酶联荧光法测定酶活性。结果 B... 目的获得具有较高纯度和酶活性的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶-1(Nmnat1),为进一步对其功能及调控的研究奠定基础。方法在大肠杆菌中进行Nmnat1表达的条件优化,采用Ni-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化,并通过酶联荧光法测定酶活性。结果 BL21-CondonPlus (DE3)-RIL为适宜的宿主菌,优化的蛋白表达条件为:在2×YT培养基(37μg/ml氯霉素和75μg/ml卡那霉素)中于28℃、0.5mmol/LIPTG(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导8h。纯化获得的Nmnat1蛋白具有较高的纯度和酶活性。结论适宜的宿主菌对Nmnat1蛋白的高效表达至关重要,进行表达条件优化后可获得大量具有较高纯度和酶活性的目的蛋白。 展开更多
关键词 烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶 表达 纯化 酶活性
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沉默信息调节因子1在椎间盘退变中的作用
2
作者 杨培 周蕾 +3 位作者 牛鑫月 周恒兵 刘香艳 雷昌斌 《中国脊柱脊髓杂志》 北大核心 2025年第2期205-208,共4页
椎间盘(intervertebral disc,IVD)位于脊柱相邻的两个椎体之间,主要由髓核(nucleus pulposus,NP)、纤维环(annulus fibrosus,AF)和上下两个软骨终板(cartilaginous endplates,CEP)[1]组成。随着年龄的增长和IVD的不断老化,会出现椎体骨... 椎间盘(intervertebral disc,IVD)位于脊柱相邻的两个椎体之间,主要由髓核(nucleus pulposus,NP)、纤维环(annulus fibrosus,AF)和上下两个软骨终板(cartilaginous endplates,CEP)[1]组成。随着年龄的增长和IVD的不断老化,会出现椎体骨质增生,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成代谢和分解代谢不平衡等,使得IVD的形态和功能改变,最终会导致椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)。IDD是引起腰痛的主要原因。有研究表明,炎症、氧化应激、线粒体功能障碍和异常机械负荷等多种病理因素参与了IDD的发展[2]。而沉默信息调节因子(Sirtuin,SIRT)家族是一类进化高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)依赖性组蛋白去乙酰化酶,参与细胞炎症反应、氧化应激和维持线粒体功能等[3]。SIRT家族蛋白之一的SIRT1能通过去乙酰化和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)核糖基化等方式修饰靶蛋白,调控核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(PI3K/Akt)等信号通路,从而减少炎症和氧化应激的发生,延缓IVD细胞的衰老。近年来,SIRT1被认为是预防和治疗IDD的一个新靶点,但其调控IDD的具体机制尚不明确。笔者对近年来关于SIRT1与IDD的相关研究进行综述。 展开更多
关键词 SIRT1 线粒体功能障碍 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 椎间盘退变 磷脂酰肌醇3激酶 组蛋白去乙酰化酶 丝裂原活化蛋白激酶 二磷酸腺苷
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ABCA1、ACAT1 DNA甲基化在Hcy致THP-1单核源性泡沫细胞胆固醇流出中作用研究 被引量：9
3
作者 杨安宁 王磊 +8 位作者 周龙霞 赵丽 王艳华 蔡欣 曹成建 杨程 陈久凯 马文斌 姜怡邓 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期44-48,共5页
目的探讨ABCA1、ACAT1 DNA甲基化在同型半胱氨酸(Hcy)致THP-1单核源性泡沫细胞胆固醇流出中的作用。方法复制泡沫细胞模型,用50、100、200、500μmol·L-1Hcy和100μmol·L-1Hcy+叶酸+维生素B12(100+F+V)干预,并设对照组(0μmol... 目的探讨ABCA1、ACAT1 DNA甲基化在同型半胱氨酸(Hcy)致THP-1单核源性泡沫细胞胆固醇流出中的作用。方法复制泡沫细胞模型,用50、100、200、500μmol·L-1Hcy和100μmol·L-1Hcy+叶酸+维生素B12(100+F+V)干预,并设对照组(0μmol·L-1Hcy)。油红O染色观察泡沫细胞形成,巢式降落式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测ABCA1、ACAT1 DNA甲基化水平,并分析两者比值变化;ELISA-like法检测DNA甲基转移酶(DNMTs)活性;化学比色法分析细胞内胆固醇含量。结果成功复制了泡沫细胞模型;给予不同浓度Hcy刺激后,ABCA1 DNA甲基化改变呈上升趋势,ACAT1 DNA甲基化改变呈下降趋势,给予100+F+V干预后可逆转上述变化,其中ABCA1 DNA甲基化改变更明显;同时,不同浓度Hcy可使泡沫细胞内DNMTs活性和胆固醇含量增加。结论 ABCA1和ACAT1 DNA甲基化的改变参与了Hcy致THP-1单核源性泡沫细胞胆固醇流出,DNMTs可能起关键调控作用。 展开更多
关键词 同型半胱氨酸 泡沫细胞 三磷酸腺苷-结合转运子A1 酰基辅酶A 胆固醇酰基转移酶1 DNA甲基化 胆固醇流出
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m6Am修饰酶PCIF1调控靶基因ACOT8参与胃癌进展的机制研究
4
作者 彭进 王伟宁 +2 位作者 谭智 叶冠男 周震 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期368-376,共9页
背景与目的:最新证据显示N6, 2’-O-二甲基腺苷(N6, 2’-O-dimethyladenosine,m6Am)修饰酶磷酸化C末端结构域相互作用因子1(phosphorylated c-terminal domain-interacting factor 1,PCIF1)可能是胃癌的重要生物标志物及治疗靶点。然而... 背景与目的:最新证据显示N6, 2’-O-二甲基腺苷(N6, 2’-O-dimethyladenosine,m6Am)修饰酶磷酸化C末端结构域相互作用因子1(phosphorylated c-terminal domain-interacting factor 1,PCIF1)可能是胃癌的重要生物标志物及治疗靶点。然而,这种新的PCIF1分子机制与胃癌进展的关系仍有待进一步探索。本研究分析PCIF1对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用及其调控靶基因酰基辅酶A硫代酯酶8(acyl-CoA thioesterase 8,ACOT8)在胃癌进展中的机制。方法:使用基因表达谱交互分析(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)分析胃癌患者的胃癌组织和非胃癌组织中的PCIF1表达,并分析了PCIF1表达与胃癌患者总生存率的相关性。收集2019年——2021年长沙市第一医院消化内科就诊患者的89对胃癌组织和匹配的癌旁组织。通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分析PCIF1表达。在体外实验中,将SNU5细胞分为PCIF1敲低(shPCIF1)组和相应对照(sh-NC)组,将AGS细胞分为载体对照组(normal control,NC)组和PCIF1过表达(PCIF1)组。使用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)和transwell法分析了PCIF1对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。此外,在PCIF1过表达的AGS细胞中敲低ACOT8并进行了拯救实验。采用皮下异种移植瘤模型来测定PCIF1在胃癌中的生物学效应。结果:PCIF1在胃癌组织和细胞系中呈高表达,并且PCIF1高表达胃癌患者的预后较差。与sh-NC组相比,sh-PCIF1组的细胞活力、EdU阳性细胞、迁移和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)。与NC组相比,PCIF1组的细胞活力、EdU阳性细胞、迁移和侵袭细胞数均显著增加(P<0.05)。在PCIF1过表达的AGS细胞中,敲低ACOT8的表达可降低细胞活力、EdU阳性细胞、迁移和侵袭细胞数。在体内实验中,与NC组相比,PCIF1过表达组裸鼠的移植瘤体积和重量均显著增加(P<0.05)。结论:PCIF1在胃癌细胞系和组织中上调。此外,PCIF1/ACOT8轴参与介导胃癌细胞的恶性行为产生。 展开更多
关键词 N6 2’-O-二甲基腺苷 磷酸化C末端结构域相互作用因子1 酰基辅酶A硫代酯酶8 胃癌 增殖 转移
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小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测
5
作者 赵虹 杨子超 张惊宇 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期622-629,共8页
目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础。方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分... 目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础。方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列。把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率。结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内。通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上。表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70%以上。结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具。 展开更多
关键词 慢病毒属 重组 遗传 质粒 遗传载体 烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1 RNA干扰 基因过表达
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NMNAT1缺失对小鼠视网膜双极细胞和无长突细胞的影响
6
作者 曹瑾 吴彩霞 毛建华 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2022年第5期359-363,368,共6页
目的探索烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1(NMNAT1)缺失对视网膜神经元细胞结构及功能的损伤作用。方法利用NMNAT1^(fl/fl)小鼠与Six3启动子下表达Cre重组酶的转基因(Six3-Cre)小鼠杂交,获得NMNAT1条件基因敲除小鼠及其同窝对照小鼠,实时荧光... 目的探索烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1(NMNAT1)缺失对视网膜神经元细胞结构及功能的损伤作用。方法利用NMNAT1^(fl/fl)小鼠与Six3启动子下表达Cre重组酶的转基因(Six3-Cre)小鼠杂交,获得NMNAT1条件基因敲除小鼠及其同窝对照小鼠,实时荧光定量PCR和Western blot进行检测。在基因敲除小鼠出生后第0、4、10、30天(P0、P4、P10、P30)取材,制作冰冻切片,分别进行HE染色测量视网膜厚度,免疫荧光染色鉴定受损细胞类型以及检测恢复蛋白和视紫质表达水平。结果与同窝对照小鼠相比,基因敲除小鼠在P0时视网膜并没有明显的形态差异,视网膜厚度比较差异无统计学意义(P>0.05);到P4时基因敲除小鼠表现出视网膜内层和外层中的分层破坏和大规模细胞死亡,基因敲除小鼠P4时距视神经500μm、1000μm、1250μm的视网膜厚度均明显低于同窝对照小鼠(均为P<0.05),而距视神经1750μm的视网膜厚度尚未受影响(P>0.05);基因敲除小鼠P10时距视神经500μm、1000μm、1250μm、1750μm的视网膜厚度均低于同窝对照小鼠(均为P<0.05)。基因敲除小鼠全部视网膜内外层的退化在P30时几乎完成。此外,与同窝对照小鼠相比,P4时基因敲除小鼠视网膜神经节细胞、双极细胞和无长突细胞的数量差异均没有统计学意义(均为P>0.05),P10时视网膜神经节细胞没有显著差异(P>0.05),基因敲除小鼠双极细胞、无长突细胞分别减少了约75%、51%(均为P<0.05)。与同窝对照小鼠相比,基因敲除小鼠在P4时视网膜几乎不表达恢复蛋白和视紫质(均为P<0.05)。结论NMNAT1缺失主要导致视网膜双极细胞和无长突细胞损害以及恢复蛋白和视紫质缺失。 展开更多
关键词 烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1 双极细胞 无长突细胞 恢复蛋白 视紫质
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规律运动对心肌Nmnat基因敲减果蝇心脏收缩功能和节律的影响 被引量：3
7
作者 夏晓璇 郑澜 +3 位作者 田旭 文登台 林丽容 吴端振 《中国运动医学杂志》 CAS 北大核心 2015年第8期757-763,共7页
目的:研究生命早期和中老龄期实施运动干预对心脏烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nmnat)基因敲减条件下果蝇心脏收缩功能、心脏节律、运动能力和生命周期的影响,探讨Nmnat在运动抗心脏衰老中的功能。方法:基因型y[1]v[1];P{y[+t7.7]v[+t1.8]=... 目的:研究生命早期和中老龄期实施运动干预对心脏烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nmnat)基因敲减条件下果蝇心脏收缩功能、心脏节律、运动能力和生命周期的影响,探讨Nmnat在运动抗心脏衰老中的功能。方法:基因型y[1]v[1];P{y[+t7.7]v[+t1.8]=TRi P.JF03337}att P2处女蝇分别与W1118、hand-Gal4雄蝇杂交,收集F1代Nmnat RNAi/+(Nmnat基因正常表达品系)、hand>Nmnat RNAi(心肌Nmnat基因敲减品系)雌蝇各1600只,两品系均随机分为4组:1周龄平台对照组、1周龄平台运动组、5周龄平台对照组、5周龄平台运动组,每组400只,1、5周龄平台运动组分别于2天龄、30天龄时实施连续5 d,2.5 h/d运动方案,采用q RTPCR技术检测心脏Nmnat基因表达;应用M-mode心动图检测运动结束后次日果蝇心功能;采用攀爬指数(CI)评定运动能力;统计存活情况。结果:1周龄敲减平台对照组心肌Nmnat的相对表达量较1周龄正常表达平台对照组约下降50%(P<0.001);与正常表达平台对照组相比,同龄敲减平台对照组舒张直径(DD)、收缩直径(SD)增加(P<0.001),缩短分数(FS)下降(P<0.001),收缩间期不齐指数(SIAI)升高(P<0.01,P<0.001);与1周龄敲减平台对照组相比,1周龄敲减平台运动组FS增加(P<0.001),SIAI下降(P<0.05);1周龄敲减平台运动组CI大于同龄敲减平台对照组;与1周龄平台对照组相比,相同遗传背景1周龄平台运动组存活曲线右移、上移,与5周龄敲减平台对照组相比,5周龄敲减平台运动组中位生存期缩短(P<0.05)。结论:Nmnat在维持心脏正常收缩功能和节律方面发挥重要作用。较早年龄段运动能有效改善果蝇因Nmnat基因敲减引起的心脏收缩功能下降和收缩间期节律紊乱,延缓增龄引起的运动能力下降,延长果蝇寿命。其机制可能与运动上调Nmnat表达,提高NAD+水平有关,而随年龄增加,NAD+水平降低、能量代谢下降将导致运动干预效果减弱。 展开更多
关键词 烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶 规律运动 心脏收缩 心脏节律 衰老
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