怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因克隆及其功能分析 被引量：1

1

作者 夏瑾华 李丹丹 +4 位作者 李然 刘贤泥 刘子捷 罗冰 欧丽佳 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第2期36-43,共8页

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选得到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的核心片段,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因,并对其进行序列分析、亚细胞定位和器官表达分析... 通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选得到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的核心片段,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因,并对其进行序列分析、亚细胞定位和器官表达分析。结果表明,怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA总长度为828 bp,G+C含量为46.50%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like由275个氨基酸组成,分子量为30728.97 u,等电点为5.39,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(28.36%)、β-片层(20.73%)、无规则卷曲(50.91%)构成;三级结构为单体跨膜蛋白;预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like主要存在液泡膜中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like与葡萄烟草病毒增殖蛋白2A(GenBank:XP_034708140.1、XP_002279170.2)的同源性最高,同源性达到86.79%。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白2A-like定位于细胞质和细胞核中。实时定量PCR结果显示,烟草病毒增殖蛋白2A-like基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like具有典型烟草病毒增殖蛋白2A的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度较高,进化上较为保守,且可降低植株的光合作用效率。 展开更多

关键词 怀玉山三叶青 烟草病毒增殖蛋白2a-like 基因克隆 表达分析 亚细胞定位

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怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因克隆和功能分析 被引量：1

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作者 尹明华 曾淑琴 +3 位作者 曾荧 张彩霞 张慧博 张丽佳 《种子》 北大核心 2022年第3期45-51,共7页

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因,并采用生物信息学方法、转基因瞬时表达和实时定量PCR进行序列分析、亚细胞定位和... 通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因,并采用生物信息学方法、转基因瞬时表达和实时定量PCR进行序列分析、亚细胞定位和器官表达分析。结果表明,怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因cDNA总长度为858 bp,G+C含量为49.53%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A由285个氨基酸组成,分子量31437.53 Da,等电点5.77,为亲水性蛋白;二级结构由α-螺旋(28.77%)、β-片层(16.14%)、无规则卷曲(55.09%)构成;三级结构为单体;预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A主要存在细胞核、线粒体、叶绿体和细胞质中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A在进化上与硬粒小麦、节节麦、乌拉尔图小麦、大麦、二穗短柄草的亲缘关系较近,尤其是与硬粒小麦未命名蛋白产物(VAH 15508.1)在进化上具有最高的亲缘关系。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白2 A定位于细胞质和细胞核中。实时定量PCR结果显示,烟草病毒增殖蛋白2 A基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高。 展开更多

关键词 怀玉山三叶青 烟草病毒增殖蛋白2 A 基因克隆 亚细胞定位 表达分析

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怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因克隆和功能分析 被引量：2

3

作者 尹明华 陈佳雯 +5 位作者 陈瑞 樊凡 辜婷婷 何思捷 陈荣华 蔡红 《江苏农业科学》 北大核心 2022年第6期32-41,共10页

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆该病毒增殖蛋白3基因,并进行序列分析、亚细胞定位、器官表达分析和功能分析。结果表明:怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因c... 通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆该病毒增殖蛋白3基因,并进行序列分析、亚细胞定位、器官表达分析和功能分析。结果表明:怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因cDNA总长度为873 bp,G+C含量为44.22%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3由290个氨基酸组成,分子量33374.79 u,等电点9.72,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(57.24%)、β-片层(10.69%)、无规则卷曲(32.07%)构成;三级结构为单体;预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3主要存在质膜、液泡膜、内质网中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3与葡萄烟草病毒增殖蛋白3(GenBank:XP_002275179.1、GenBank:XP_034684444.1)的同源性最高,同源性达到94.83%。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白3定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜中。实时定量PCR结果显示,烟草病毒增殖蛋白3基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高;烟草病毒增殖蛋白3转基因阳性烟草的三叶青花叶病毒表达量显著高于烟草病毒增殖蛋白3转基因阴性烟草;与烟草病毒增殖蛋白3转基因阴性烟草相比较,烟草病毒增殖蛋白3转基因阳性烟草的净光合速率(P_(n))、气孔导度(G_(s))、蒸腾速率(T_(r))、最大光化学效率(F_(v)/F_(m))、实际光化学量子效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(q_(P))及电子传递效率(ETR)显著下降,而非光化学淬灭系数(NPQ)显著上升。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3具有典型烟草病毒增殖蛋白3的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,进化上高度保守,且可促进三叶青烟草花叶病毒的增殖,降低植株的光合作用效率。 展开更多

关键词 怀玉山三叶青 烟草病毒增殖蛋白3 基因克隆 功能分析 蛋白结构

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怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因克隆、亚细胞定位和组织表达分析 被引量：1

4

作者 洪森荣 向琼钰 +5 位作者 谢颖 熊晨露 徐晨慧 徐璐珂 陈荣华 蔡红 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2022年第6期1193-1204,共12页

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因的核心片段,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因,并采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR进行序列分析和器官表达分析。结果... 通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因的核心片段,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因,并采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR进行序列分析和器官表达分析。结果表明,怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因cDNA总长度为888 bp,G+C含量为51.58%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1由295个氨基酸组成,分子量33173.36 u,等电点9.16,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(43.73%)、β-片层(21.69%)、无规则卷曲(34.58%)构成;三级结构为单体;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1主要存在于内质网、内质网-质膜、细胞外、细胞质、线粒体和质膜中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1在进化上与Aegilops tauschii subsp.tauschill(节节麦)、Triticum turgidum subsp.durum(硬粒小麦)、Hordeum vulgare(大麦)的亲缘关系较近,尤其是与Aegilops tauschii subsp.tauschill(节节麦)烟草病毒增殖蛋白1在进化上具有最高的亲缘关系。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白1定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜中。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,烟草病毒增殖蛋白1基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号在叶中表达量最高,怀玉1号在茎中表达量最高。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1具有典型烟草病毒增殖蛋白1的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,对进一步揭示该酶生物学功能具有重要意义。 展开更多

关键词 怀玉山三叶青 烟草病毒增殖蛋白1 基因克隆 亚细胞定位 表达分析

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丙型肝炎病毒核心蛋白对HePG_2细胞增殖和细胞周期的影响

5

作者 刘重阳 刘为纹 +2 位作者 杨建民 陈东风 房殿春 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第9期1055-1057,共3页

目的　观察核心蛋白对细胞增殖和细胞周期调控的影响。方法　观察表达HCV核心蛋白的细胞株HePG2 C和作为对照的细胞株HePG2 CMV的细胞形态 ;绘制细胞生长曲线 ;检测细胞周期 ;用流式细胞仪、免疫组化染色检测PCNA ,P16 ,P2 7,P5 3;半... 目的　观察核心蛋白对细胞增殖和细胞周期调控的影响。方法　观察表达HCV核心蛋白的细胞株HePG2 C和作为对照的细胞株HePG2 CMV的细胞形态 ;绘制细胞生长曲线 ;检测细胞周期 ;用流式细胞仪、免疫组化染色检测PCNA ,P16 ,P2 7,P5 3;半定量RT PCR检测P16 ,P2 7,P5 3mRNA。结果　转染重组质粒PBK HVCC的HePG2 C细胞与转染空载体PBK CMV的HePG2 CMV细胞相比细胞形态未见明显变化。生长曲线显示HePG2 细胞在转染PBK HCVC和空载体PBK CMV后 ,生长速度无明显变化。检测转染空载体的细胞HePG2 CMV 81.3%进入G0 /G1期 ,7.7%进入S期 ;而转染PBK HCVC的细胞HePG2 C 73%进入G0 /G1期 ,13.7%进入S期。在进一步分子机制的探讨中发现HePG2 C细胞PCNA、P5 3表达显著增加 ,P16、P2 7表达显著降低。同样的变化也发生在转录水平。结论　HCV核心蛋白可能通过调节某些基因的转录与表达 ,增加细胞DNA合成 ,扰乱细胞周期 ,进而参与致癌过程。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒核心蛋白 肝癌 细胞周期 HEPG2 细胞增殖 HCVC

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H3N2流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达及其对293T细胞增殖的影响

6

作者 迟莹 卞倩 +3 位作者 李燕 张文帅 温恬 焦永军 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期40-44,共5页

目的:构建甲型H3N2流感病毒非结构蛋白-1(nonstructal-1,NS1)真核表达载体并表达其编码蛋白;探讨NS1对细胞增殖的影响。方法 :从江苏省甲型H3N2流感病毒毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vecto... 目的:构建甲型H3N2流感病毒非结构蛋白-1(nonstructal-1,NS1)真核表达载体并表达其编码蛋白;探讨NS1对细胞增殖的影响。方法 :从江苏省甲型H3N2流感病毒毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/NS1质粒,双酶切pMD18-T/NS1与pXJ40-HA后,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法检测NS1转染细胞后对细胞增殖的影响。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NS1蛋白的表达。MTT法证实转染NS1质粒后对细胞增殖有抑制作用。结论:成功克隆了NS1全长基因,构建了其真核表达载体,并初步验证了NS1蛋白过表达后能抑制细胞的增殖,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1的细胞模型和NS1蛋白对细胞增殖和凋亡作用机制的进一步研究提供了基础。 展开更多

关键词 H3N2流感病毒 非结构蛋白-1基因 克隆 真核表达 细胞增殖

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COX-2在乙肝病毒X蛋白(HBx)促进肝癌细胞和肝细胞增殖中的作用 被引量：3

7

作者 徐付卿 山长亮 +1 位作者 叶丽虹 张晓东 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期968-973,共6页

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白(HBx)对肝癌的发生发展具有十分重要的作用.大量研究结果表明,与花生四烯酸代谢相关的磷脂酶COX-2与肿瘤细胞的增殖密切相关.为了阐明COX-2在HBx促进肝细胞增殖中的作用,在前期应用基因芯片方... 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白(HBx)对肝癌的发生发展具有十分重要的作用.大量研究结果表明,与花生四烯酸代谢相关的磷脂酶COX-2与肿瘤细胞的增殖密切相关.为了阐明COX-2在HBx促进肝细胞增殖中的作用,在前期应用基因芯片方法检测发现稳定转染HBx基因的肝癌细胞H7402-X中COX-2基因表达明显上调的基础上,本研究应用免疫印迹技术在蛋白表达水平上获得了相同的结果.进而,应用COX-2的特异性抑制剂Indo分别作用H7402-X细胞和L-O2-X细胞(稳定转染HBx基因的人永生化L-O2肝细胞),观察HBx蛋白是否通过COX-2促进肝癌细胞或肝细胞增殖.BrdU掺入实验和流式细胞仪检测结果显示,50μmol/L的Indo可明显抑制H7402-X细胞和L-O2-X细胞的增殖.本研究结果提示,HBx可通过COX-2所介导的花生四烯酸代谢促进肝癌细胞和肝细胞增殖. 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒X蛋白 COX-2 肝癌 肝细胞 细胞增殖

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猪圆环病毒2型Cap蛋白在烟草叶绿体中的表达

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作者 林优红 程霞英 +6 位作者 杨东风 姜永厚 邢少辰 韦正乙 韩蕊莲 梁宗锁 杨宗岐 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期350-356,共7页

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associate... 猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的主要抗原。但Cap蛋白高昂的生产成本限制了它的广泛应用。为了探索Cap蛋白新的生产途径,本研究选择烟草叶绿体为表达平台,构建了ORF2抗原基因烟草叶绿体表达载体pNK-a03,并通过基因枪法(gene biolistics)将表达载体导入烟草叶绿体中。转化植株经PCR和RT-PCR检测,证实ORF2抗原基因已整合进烟草叶绿体基因组中且正常转录。蛋白质印迹检测和ELISA分析表明,Cap蛋白在烟草叶绿体内获得有效表达,具有免疫活性。此外,种子萌发研究结果显示,转基因烟草植株F1代具有aadA抗性,目的基因可正常进行遗传。这些研究结果为探索Cap蛋白的新型表达途径提供了理论基础。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) 可读框2(ORF2)基因 衣壳(Cap)蛋白 烟草叶绿体 基因枪转化

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基于烟草脆裂病毒构建同时表达2种外源蛋白的载体及其应用

9

作者 郭歌 常发光 +3 位作者 赖家良 张先文 杜志游 廖乾生 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2022年第7期1381-1390,共10页

目的构建在整个寄主植物中能同时表达两个非融合蛋白的病毒载体。方法以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料,缺失TRV RNA2的2b基因5’端279 bp并将其起始密码子ATG改变为AGG、同时引入豌... 目的构建在整个寄主植物中能同时表达两个非融合蛋白的病毒载体。方法以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料,缺失TRV RNA2的2b基因5’端279 bp并将其起始密码子ATG改变为AGG、同时引入豌豆早枯病毒(pea early-browning virus,PEBV)外壳蛋白(coat protein,cp)基因启动子,获得pTRV2e2载体;在pTRV2e2载体的2b和PEBV的cp启动子下游插入不同的外源基因,测定病毒TRVe2表达外源蛋白的能力、携带外源基因后重组病毒的稳定性以及分析蛋白质的生物学功能。结果病毒TRVe2能快速同时表达2个非融合的外源蛋白,且至少能表达70 ku外源蛋白,且该病毒携带~2.0 kb外源基因能稳定存活于寄主植物中;病毒TRVe2可用于分析蛋白质的生物学功能以及2个蛋白质间的相互作用。结论本文构建的重组病毒TRVe2为快速有效地表达2个外源蛋白以及分析2个蛋白质间的相互作用提供技术工具。 展开更多

关键词 烟草脆裂病毒 基因组RNA2 双元表达载体 蛋白质功能分析 本氏烟

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转H5禽流感病毒M2e基因烟草的研究 被引量：3

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作者 张保龙 杨郁文 +1 位作者 倪万潮 侯继波 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第1期51-54,共4页

将禽流感病毒M2e与鸡IgG Fc的融合基因转入烟草植株,利用烟草生产禽流感抗原蛋白,探索利用植物作为生物反应器生产禽流感疫苗的可行性。将M2e-Fc融合基因克隆到植物表达载体pBI121中,与CaMV35s启动子相连,以烟草子叶作为外植体,利用农... 将禽流感病毒M2e与鸡IgG Fc的融合基因转入烟草植株,利用烟草生产禽流感抗原蛋白,探索利用植物作为生物反应器生产禽流感疫苗的可行性。将M2e-Fc融合基因克隆到植物表达载体pBI121中,与CaMV35s启动子相连,以烟草子叶作为外植体,利用农杆菌介导法将外源基因转入烟草中。对抗性植株进行了PCR、RT-PCR分析。结果表明,M2e基因已经导入到烟草中,在转录水平得到了表达。为进一步利用转基因植物生产禽流感疫苗进行了前期的探索工作。 展开更多

关键词 H5亚型禽流感病毒 病毒基质蛋白2(M2) 烟草 转化

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过表达连接子蛋白40(Cx40)通过引起细胞周期阻滞抑制H9c2大鼠心肌细胞增殖

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作者 任媛媛 杨洁 +1 位作者 魏民新 苏超 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期714-720,共7页

目的 建立过表达连接子蛋白40(Cx40)的H9c2心肌细胞稳定株,初步探讨慢病毒载体介导的Cx40蛋白过表达对H9c2细胞增殖的影响及其相关机制。方法 采用实时定量PCR从H9c2细胞株扩增Cx40基因片段,与慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Puro连接,获得重... 目的 建立过表达连接子蛋白40(Cx40)的H9c2心肌细胞稳定株,初步探讨慢病毒载体介导的Cx40蛋白过表达对H9c2细胞增殖的影响及其相关机制。方法 采用实时定量PCR从H9c2细胞株扩增Cx40基因片段,与慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Puro连接,获得重组pLVX-Flag-Cx40表达载体。通过与包装质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,获得携带Flag-Cx40的重组慢病毒颗粒。感染的H9c2细胞经嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定表达株(H9c2-Flag-Cx40细胞)。采用Western blot法检测Cx40蛋白表达情况;通过CCK-8法检测Cx40对H9c2细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期的变化;实时定量PCR检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的mRNA表达;Western blot法检测cyclin D1蛋白表达;免疫共沉淀(Co-IP)实验检测H9c2细胞Cx40和Yes相关蛋白(YAP)的相互结合情况;分离胞质、胞核蛋白,利用Western blot法检测Cx40对YAP细胞定位的影响。结果 测序结果显示成功构建重组pLVX-Flag-Cx40表达载体,Flag-Cx40重组慢病毒可在H9c2细胞过表达,H9c2-Flag-Cx40稳定细胞株构建成功。与对照组相比,过表达Cx40明显降低H9c2细胞的增殖速率,细胞周期阻滞在G0/G1期,cyclin D1表达量降低。H9c2-Flag-Cx40稳定转染细胞的胞质中YAP表达量明显增多,而在胞核中的表达量明显减低,Cx40通过在胞质中与YAP结合,阻止其进入细胞核发挥转录共激活作用。结论 慢病毒介导Cx40基因过表达使H9c2细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期,并抑制其增殖。 展开更多

关键词 连接子蛋白40(Cx40) 慢病毒载体 H9C2细胞 心肌细胞 细胞增殖

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OrfA与E2F5的互作关系及其对肺腺癌细胞增殖的影响

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作者 穆璐 张潇筠 +3 位作者 韩宝泉 陈昱光 张智英 徐坤 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2021年第12期11-17,27,共8页

【目的】确认大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助因子OrfA与转录因子E2F5的互作关系,以及OrfA对肿瘤细胞增殖的影响。【方法】采用重组DNA技术构建orfA与E2F5基因过表达载体;通过Western Blot试验,检测对比HEK293T、Hela229宫颈癌细胞、A... 【目的】确认大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助因子OrfA与转录因子E2F5的互作关系,以及OrfA对肿瘤细胞增殖的影响。【方法】采用重组DNA技术构建orfA与E2F5基因过表达载体;通过Western Blot试验,检测对比HEK293T、Hela229宫颈癌细胞、A375恶性黑色素瘤细胞、SMMC-7721肝癌细胞和SPC-A-1肺腺癌细胞中E2F5的表达量;通过酵母双杂交和免疫共沉淀试验,验证OrfA与E2F5的互作关系;采用CCK-8试剂盒和PI单染色法,检测过表达orfA基因对SPC-A-1细胞增殖的影响;采用RT-qPCR,检测过表达orfA基因对SMAD4和caspase-3基因表达的影响。【结果】成功构建了orfA与E2F5基因过表达载体pLenti-EF1α-orfA和pLenti-EF1α-E2F5;在5种细胞系中,以SPC-A-1细胞E2F5蛋白表达量最高;酵母双杂交和免疫共沉淀试验结果均证明,OrfA与E2F5可以直接相互作用;过表达orfA基因对SPC-A-1细胞增殖具有显著促进作用,同时能够增强SMAD4基因的表达,抑制caspase-3基因的表达。【结论】WDSV OrfA与E2F5有相互作用,且能促进SPC-A-1肺腺癌细胞的增殖。 展开更多

关键词 逆转录病毒周期蛋白(OrfA) E2F5转录因子 SPC-A-1肺腺癌细胞 细胞增殖

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过表达外源性Cyr61对人肝癌细胞株HepG2生长和迁移的影响 被引量：3

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作者 丁伟 司维柯 +2 位作者 孙世俊 潘静 李招权 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期378-381,共4页

目的采用AdEasy系统构建的带有标记基因RFP的重组腺病毒Ad-Cyr61感染人肝癌细胞株HepG2,并观察外源性Cyr61对肿瘤细胞生长和迁移的影响。方法Ad-Cyr61与Ad-RFP分别感染人肝癌细胞株HepG2,荧光倒置显微镜观察荧光表达,通过RT-PCR、免疫... 目的采用AdEasy系统构建的带有标记基因RFP的重组腺病毒Ad-Cyr61感染人肝癌细胞株HepG2,并观察外源性Cyr61对肿瘤细胞生长和迁移的影响。方法Ad-Cyr61与Ad-RFP分别感染人肝癌细胞株HepG2,荧光倒置显微镜观察荧光表达,通过RT-PCR、免疫组化实验分别检测Ad-Cyr61的mRNA和蛋白的表达;通过MTT实验、细胞计数实验、克隆形成实验和划痕愈合实验,观察Cyr61对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖和迁移的影响。结果Ad-Cyr61感染人肝癌细胞株HepG2,与对照组比较细胞数量增多,集落形成增加,细胞划痕逐渐愈合。结论Ad-Cyr61感染人肝癌细胞株HepG2后可促进细胞增殖和迁移,提示Cyr61在肿瘤发生和转移中可能起到重要作用。 展开更多

关键词 富半胱氨酸蛋白61 重组腺病毒 人肝癌HEPG2细胞 增殖 迁移

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采用TEV酶法进行整合膜蛋白拓扑学分析

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作者 雷凯健 饭田秀利 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1053-1057,共5页

为了研究膜蛋白的跨膜结构,进行拓扑学分析是十分重要的.有许多分析膜蛋白拓扑结构的方法,本文采用烟草蚀斑病毒(TEV)酶特异性切割测试蛋白中跨膜片段的前段或后端所插入的tev识别序列EXXYXQ(S/G),如果TEV酶能够切割,表明该序列位于目... 为了研究膜蛋白的跨膜结构,进行拓扑学分析是十分重要的.有许多分析膜蛋白拓扑结构的方法,本文采用烟草蚀斑病毒(TEV)酶特异性切割测试蛋白中跨膜片段的前段或后端所插入的tev识别序列EXXYXQ(S/G),如果TEV酶能够切割,表明该序列位于目标蛋白的细胞质外.将Tev识别序列ENLYFQG分别插入到拟南芥整合膜蛋白的的跨膜区域,然后转化进入酿酒酵母中.消解酶(zymolyase)酶破除酵母的细胞壁后,TEV酶消化球状体,最后通过Western免疫印迹法来分析结果.有关该方法的注意事项在结果中进行了讨论. 展开更多

关键词 烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶 拓扑学分析 Mca2蛋白 定点突变

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