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犬瘟热病毒小熊猫株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析 被引量：11
1
作者 鞠会艳 乔军 +2 位作者 高玉伟 杨松涛 夏咸柱 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期112-120,共9页
根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白... 根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白基因全长1989bp,预测编码662个氨基酸,F蛋白氨基酸序列中含有5个潜在的N-联糖基化位点。聚类分析提示,CDVLP株是一株与CDV强毒株亲源关系很近的毒株。用DNAstar软件对CDVLP株和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白进行了疏水性及抗原表位预测分析。抗原表位差异提示CDVLP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要优于Onderstepoort弱毒株。在分子水平上阐明了CDVLP株的N和F蛋白基因更适合作为构建基因疫苗和重组活载体疫苗的目的基因。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒小熊猫株 核蛋白和融合蛋白基因 克隆 序列分析
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基于A53T转基因小鼠注射α-突触核蛋白纤维加速建立帕金森病模型
2
作者 周宇光 苏迎 +3 位作者 刘亚岭 韦昕钰 姜佩文 邹春林 《中国实验动物学报》 北大核心 2025年第9期1312-1319,共8页
目的通过在B6-hSNCA-A53T转基因小鼠脑内注射α-突触核蛋白预形成纤维(α-Syn PFF),促进帕金森病病理改变的快速出现,从而加快帕金森病小鼠模型的建立。方法选择C57BL/6J背景的α-Syn A53T转基因小鼠作为模型组,同系C57BL/6J小鼠为对照... 目的通过在B6-hSNCA-A53T转基因小鼠脑内注射α-突触核蛋白预形成纤维(α-Syn PFF),促进帕金森病病理改变的快速出现,从而加快帕金森病小鼠模型的建立。方法选择C57BL/6J背景的α-Syn A53T转基因小鼠作为模型组,同系C57BL/6J小鼠为对照组,通过脑立体定位技术将α-Syn PFF注射至小鼠双侧纹状体内。造模后,通过旷场实验评估小鼠的自主活动能力和焦虑行为;转棒、抓力及爬杆实验测定其运动协调性和四肢肌张力;埋藏食物实验评价小鼠的嗅觉功能;通过免疫组织化学染色法探究小鼠脑内炎症和病理性α-突触核蛋白发生。结果与对照组比较,A53T小鼠α-Syn PFF脑内注射后1月旷场实验中运动距离增加;转棒、抓力与爬杆实验无统计学意义;埋藏食物实验中寻找食物时间增加。造模2月后模型组旷场实验中运动距离减少;转棒、抓力与爬杆实验中运动协调能力以及肌张力减弱;埋藏食物实验中寻找食物时间增加。模型组小鼠黑质、皮层、海马区的病理性α-突触核蛋白增加;小胶质细胞增加,路易小体沉积;黑质多巴胺能神经元显著减少。结论A53T小鼠脑内注射α-Syn PFF后其嗅觉障碍和运动功能缺陷的发生显著提前;模型组小鼠黑质、皮层及海马区出现明显的α-突触核蛋白/路易小体沉积,并伴有黑质多巴胺能神经元丢失。因此,该模型可作为一种快速建立的α-突触核蛋白帕金森病动物模型。 展开更多
关键词 帕金森病 A53T转基因小鼠 动物模型 α-突触核蛋白预合成纤维 路易小体
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牛乳铁蛋白肽与蛙肽融合蛋白在毕赤酵母中的表达
3
作者 是一林 刘威 +1 位作者 吴昊东 王亮 《食品工业科技》 北大核心 2025年第22期205-214,共10页
天然牛乳铁蛋白肽(Bovine Lactoferricin,LfcinB)产量低、化学合成成本昂贵,因此利用基因工程制备LfcinB,成为获取牛乳铁蛋白肽的首选方法。本研究利用生物信息学方法分析融合蛋白的基本理化性质,将阴离子肽牛蛙皮肤抗氧化肽(Antioxidan... 天然牛乳铁蛋白肽(Bovine Lactoferricin,LfcinB)产量低、化学合成成本昂贵,因此利用基因工程制备LfcinB,成为获取牛乳铁蛋白肽的首选方法。本研究利用生物信息学方法分析融合蛋白的基本理化性质,将阴离子肽牛蛙皮肤抗氧化肽(Antioxidant Peptide from Bullfrog Skin Protein,APBSP)与LfcinB连接起来,以融合蛋白的方式进行表达,中和牛乳铁蛋白肽携带的阳离子,构建了重组酵母GS115/pPIC9K-EGFP-APBSP-LfcinB-His,筛选出表达量最高的重组酵母,并对表达产物LfcinB-His进行分离纯化鉴定和抑菌活性检测。结果表明,LfcinB具有抗菌活性而构建的重组蛋白APBSP-LfcinB和EGFP-APBSP-LfcinB-His不具备抗菌活性。在甲醇诱导下的重组酵母GS115/pPIC9K-EGFP-APBSP-LfcinB-His的生长趋势高于GS115/pPIC9K-LfcinB-His,且SDS-PAGE电泳能检测出融合蛋白的高效表达,纯化分离后的LfcinB-His溶液作用于金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌CMCC26003、大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌C600时,平均抗菌效价分别为3.62×10^(9)、1.98×10^(8)、1.86×10^(8)、1.54×10^(9) U/mL,具备较强的抗菌活性。本研究为进一步开展LfcinB的高密度发酵奠定了基础。 展开更多
关键词 牛乳铁蛋白 融合蛋白 牛蛙皮肤蛋白抗氧化肽 基因工程 超滤浓缩
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基于cGAS-STING通路和突触融合蛋白17介导的自噬在脑缺血再灌注损伤中的作用研究进展
4
作者 杨航 高安邦 +2 位作者 倪莹 马跃 高名同 《中国卒中杂志》 北大核心 2025年第4期479-485,共7页
急性缺血性卒中后,脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)可进一步损伤患者的神经功能,影响其预后。自噬在CIRI的病理过程中是一把“双刃剑”,其不同的激活程度以及在CIRI的不同时期,可对脑组织产生保护或损伤... 急性缺血性卒中后,脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)可进一步损伤患者的神经功能,影响其预后。自噬在CIRI的病理过程中是一把“双刃剑”,其不同的激活程度以及在CIRI的不同时期,可对脑组织产生保护或损伤的相反作用。环鸟苷酸-腺苷酸合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)-干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon gene,STING)通路是先天免疫中重要的效应通路,突触融合蛋白17(syntaxin 17,STX17)是可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性因子附着蛋白受体亚家族成员,两者在CIRI过程中对细胞自噬和线粒体自噬均具有重要的调节作用。本文对cGAS-STING通路和STX17在CIRI中调控自噬的机制及其相互关系进行综述,以期为CIRI的干预提供新的思路和依据。 展开更多
关键词 环鸟苷酸-腺苷酸合酶-干扰素基因刺激因子通路 突触融合蛋白17 自噬 脑缺血再灌注损伤
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核定位人源α-突触核蛋白转基因小鼠的建立
5
作者 韦梦晨 范胜涛 +3 位作者 吴海婷 张艺薇 王子鸥 黄璋琼 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期307-316,共10页
目的 建立一种核定位人源α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)转基因小鼠,并探究人源α-syn核输入对小鼠行为的影响。方法 构建hSNCA-NLS和EGFP的慢病毒载体,利用显微注射法建立转基因小鼠模型,通过PCR和Western Blot方法鉴定转基因首... 目的 建立一种核定位人源α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)转基因小鼠,并探究人源α-syn核输入对小鼠行为的影响。方法 构建hSNCA-NLS和EGFP的慢病毒载体,利用显微注射法建立转基因小鼠模型,通过PCR和Western Blot方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型和蛋白表达情况。采用免疫荧光鉴定人源α-syn在小鼠脑组织中的共定位情况,同时采用旷场、转棒、O迷宫实验评价转基因小鼠的行为改变情况。结果 hSNCA-NLS基因成功插入小鼠基因组中,人源α-syn成功表达,并且有明显的核定位现象。进一步研究发现,核定位人源α-syn转基因小鼠在2月龄时开始表现出了运动功能障碍,发生了星形胶质细胞增生和炎症反应,于9月龄时表现出了明显的焦虑样症状,γ-氨基丁酸(GABA)基因表达减少,这些表现一直持续到小鼠12月龄。结论 成功构建了核定位人源α-syn转基因小鼠,小鼠表现出明显的运动功能障碍和焦虑样症状。该模型的成功建立可以为研究α-syn核定位现象在帕金森病中的作用提供一定的研究基础。 展开更多
关键词 人源α-突触核蛋白 小鼠 核定位 转基因 运动功能障碍
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含uPA裂解位点的人sTrail融合基因的构建及其原核蛋白表达与纯化 被引量：4
6
作者 梁宇佳 缪殿南 +2 位作者 闫国和 戴晓天 熊玮 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期789-792,共4页
目的构建含尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点的人可溶性凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand,sTrail)基因的原核载体,表达并纯化其融合蛋白sTrail-uPA。方法 RT-PCR法克隆sTrai... 目的构建含尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点的人可溶性凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand,sTrail)基因的原核载体,表达并纯化其融合蛋白sTrail-uPA。方法 RT-PCR法克隆sTrail基因后,经引物延伸法构建his-uPA-sTrail融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a中,诱导其表达蛋白并将其纯化,肠肽酶(enterokinase,EK)切与再次纯化回收该蛋白,Western blot检测其抗原性。结果表达载体经诱导成功获约38×103含载体表达标签(Trx)的融合蛋白,EK酶切该蛋白获约19.5×103的目的蛋白uPA-sTrail。检测表明,该目的蛋白具人Trail抗原性。结论成功克隆uPA-sTrail融合基因并构建至原核表达载体,并获约19.5×103的融合蛋白,且该蛋白具人Trail抗原性。 展开更多
关键词 克隆 融合基因 融合蛋白 抗原性
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猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用 被引量：24
7
作者 倪建强 张春玲 +5 位作者 李海燕 崔尚金 仇华吉 王云峰 田志军 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期18-21,共4页
根据GenBank中A/Swine/HongKong/126/82(H3N2)株猪流感病毒(SIV)NP基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT＿PCR扩增了我国SIV分离株A/Swine/Heilongjiang/3/2000(H3N2)的核蛋白(NP)基因。将扩增所得NP基因克隆于pMD18＿T载体,酶切鉴定后... 根据GenBank中A/Swine/HongKong/126/82(H3N2)株猪流感病毒(SIV)NP基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT＿PCR扩增了我国SIV分离株A/Swine/Heilongjiang/3/2000(H3N2)的核蛋白(NP)基因。将扩增所得NP基因克隆于pMD18＿T载体,酶切鉴定后对其序列分析表明NP基因与香港分离株同源性高达93.8%,然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有NP基因的重组质粒命名为pET＿NP。用pET＿NP转化受体菌BL21,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品。经SDS＿PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG诱导下,6h其表达量达到高峰,经Westernblot分析证实表达的重组核蛋白具有反应活性,大小约为60kD。用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与SIV抗血清可形成清晰的反应沉淀线,而与其它9种猪病原阳性血清不发生反应。正常菌体蛋白与SIV阳性血清也不发生反应。通过对40份送检血清样品的检测结果显示其与HI试验的相符率高达95%以上。试验证明利用原核表达系统制备的重组核蛋白作为诊断用抗原,不仅制备过程简单而且所建立的琼扩诊断方法特异、快速、简便,其灵敏度也能满足现地的使用要求。目前正在进行现地的中试试验。 展开更多
关键词 SIV 琼脂扩散试验 猪流感病毒 核蛋白 基因表达 疾病诊断
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猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核蛋白基因在原核系统中的高效表达与初步应用 被引量：14
8
作者 周艳君 童光志 +4 位作者 薛强 仇华吉 王云峰 赵永刚 王玫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期401-404,共4页
将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_1a株核蛋白基因克隆至原核表达载体pET30a的多克隆位点中 ,经鉴定后得到重组质粒pET30a_N ,将此重组质粒转化到受体菌BL2 1中 ,用诱导剂IPTG分别以不同浓度进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做S... 将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_1a株核蛋白基因克隆至原核表达载体pET30a的多克隆位点中 ,经鉴定后得到重组质粒pET30a_N ,将此重组质粒转化到受体菌BL2 1中 ,用诱导剂IPTG分别以不同浓度进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS_PAGE、Western_blot分析 ,并以此为包被抗原进行ELISA检测 ,结果发现以终浓度为 1mmol/L的IPTG进行诱导 ,4小时后表达可达到高峰 ,其大小约为 2 3kD ,薄层扫描结果表明该蛋白表达量约占菌体蛋白总量的 32 % ,该蛋白不仅与PRRSV阳性血清能发生特异性反应 ,而且可被PRRSV抗N蛋白单抗所识别 ,证实此大量表达的蛋白为核蛋白。将此表达产物应用ProBondTM纯化系统进行纯化 ,其纯度可达到 91% ,纯化后的蛋白以 5 0 μg/孔包被 96孔板 ,检测来自不同地区送检的猪血清 ,同时以全病毒ELISA为对照 ,结果发现二者的符合率高达 93.3% ,而应用该蛋白进行检测其反应更为敏感 ,且背景低 ,制备过程简单 ,这将为今后应用该蛋白作诊断抗原检测PRRSV奠定了基础。 展开更多
关键词 猪 CH-1A株 核蛋白基因 原核系统 应用 PRRSV 繁殖呼吸综合征病毒 基因表达
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狂犬病病毒SRV_9克隆株核蛋白基因的克隆、表达与特性分析 被引量：5
9
作者 袁慧君 扈荣良 +2 位作者 张守峰 张茂林 涂长春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期5-8,共4页
根据已发表的狂犬病病毒核蛋白基因序列 ,设计并合成了一对引物。从SAD株驯化的SRV9。蚀斑株中提取病毒RNA ,通过RT_PCR扩增出核蛋白的全长cDNA序列。测序结果显示 ,其序列与国外报道的SAD母源株序列一致。将核蛋白的cDNA克隆至原核表... 根据已发表的狂犬病病毒核蛋白基因序列 ,设计并合成了一对引物。从SAD株驯化的SRV9。蚀斑株中提取病毒RNA ,通过RT_PCR扩增出核蛋白的全长cDNA序列。测序结果显示 ,其序列与国外报道的SAD母源株序列一致。将核蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET_2 8b ( +)中 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3 )plyss,于 3 0℃ 1mmol/LIPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS_PAGE分析 ,在分子量约为 5 6kDa处出现一新的蛋白带 ,和预期的目的蛋白分子量相符。Western_blotting检测表明 ,表达产物能与狂犬病病毒阳性血清发生特异性反应 ,出现单一反应带。扫描分析显示 ,表达产物占菌体总蛋白的 2 3 %。包涵体分离、纯化后 ,纯度达 89%。上述结果为核蛋白在狂犬病基因免疫和免疫检测中的进一步应用奠定了基础。 展开更多
关键词 特性分析 狂犬病病毒 核蛋白 RT-PCR 基因克隆 基因表达
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禽流感A/鸡/北京/1/96(H9N2)株核蛋白基因克隆和序列分析 被引量：29
10
作者 陈福勇 夏春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 1999年第2期130-133,共4页
本研究采用ＰＴ－ＰＣＲ法从禽流感Ａ／鸡／北京／１／９６（Ｈ９Ｎ２）株克隆了核蛋白（ＮＰ）基因。ＮＰ基因全长１４９７ｂｐ，编码４９８个氨基酸。将其序列与数株Ａ型流感病毒ＮＰ序列进行比较，相互间同源性在９６．６％～９５．... 本研究采用ＰＴ－ＰＣＲ法从禽流感Ａ／鸡／北京／１／９６（Ｈ９Ｎ２）株克隆了核蛋白（ＮＰ）基因。ＮＰ基因全长１４９７ｂｐ，编码４９８个氨基酸。将其序列与数株Ａ型流感病毒ＮＰ序列进行比较，相互间同源性在９６．６％～９５．４％。 展开更多
关键词 禽 流感 核蛋白 鸡 基因克隆
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禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达 被引量：19
11
作者 邓国华 马文军 于康震 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 1999年第2期81-83,共3页
利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因，其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致，与其它毒株则有较大差异，说... 利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因，其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致，与其它毒株则有较大差异，说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中，再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中，经过三次蚀斑筛选，获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ，结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验，结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。 展开更多
关键词 禽流感病毒 重组杆状病毒 核蛋白基因
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黄芩苷联合连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达的影响 被引量：14
12
作者 黄智生 杨斌 +1 位作者 张清 孙坚 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2018年第10期1033-1037,共5页
目的病毒的高变异率,使得抗病毒药物的研发显得非常重要,文中探讨黄芩苷联合连翘苷对甲型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP)基因表达的影响。方法通过瞬时转染技术将甲型流感病毒核蛋白真核重组质粒pc DNA3.1(+)/核蛋白导入Hela细胞以... 目的病毒的高变异率,使得抗病毒药物的研发显得非常重要,文中探讨黄芩苷联合连翘苷对甲型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP)基因表达的影响。方法通过瞬时转染技术将甲型流感病毒核蛋白真核重组质粒pc DNA3.1(+)/核蛋白导入Hela细胞以建立甲型流感病毒核蛋白真核表达载体,检测黄芩苷(15.625μg/m L)联合连翘苷(12.5μg/m L)组核蛋白基因表达量。选用低、中浓度的黄芩苷(IC25、IC50)联合低、中、高浓度的连翘苷(IC25、IC50、IC75)进行药物联合实验,实验分为Hela细胞对照组;脂质体对照组;重组质粒转染组;黄芩苷IC25+连翘苷IC25组;黄芩苷IC25+连翘苷IC25组;黄芩苷IC25+连翘苷IC75组;黄芩苷IC50+连翘苷IC50组;黄芩苷IC50+连翘苷IC50组;黄芩苷IC25+连翘苷IC75组。转染后使用各实验组药物进行干预,继续培养48 h后,采用反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定各实验组Hela细胞内核蛋白基因的拷贝量,评价黄芩苷联合连翘苷对靶细胞核蛋白基因表达的影响,并分析药物联合作用效果。结果重组质粒转染组核蛋白基因表达量为(62.868±13.587)×104copies/μL,Hela细胞对照组为(2.131±0.172)×104copies/μL,脂质体对照组为(1.627±0.489)×104copies/μL,黄芩苷联合连翘苷组为(7.596±2.066)×104copies/μL。黄芩苷IC25+连翘苷IC25组、黄芩苷IC25+连翘苷IC50组、黄芩苷IC25+连翘苷IC75组对靶细胞核蛋白基因表达的抑制率分别为:(37.87±9.11)%、(58.65±5.53)%、(79.12±5.35)%。通过Compu Syn软件分析药物联合指数CI分别为:1.242、0.954、0.947。黄芩苷IC50+连翘苷IC25组、黄芩苷IC50+连翘苷IC50组、黄芩苷IC50+连翘苷IC75组对靶细胞核蛋白基因表达的抑制率分别为:(62.00±4.26)%、(70.87±3.06)%、(83.00±2.90)%。通过Compu Syn软件分析药物联合指数CI分别为:0.895、0.855、0.892。黄芩苷联合连翘苷对核蛋白基因的表达的抑制作用总体表现为协同作用,低浓度黄芩苷与低浓度连翘苷起拮抗作用CI>1;其余浓度间联合起协同作用CI<1。结论黄芩苷联合连翘苷能够下调转染Hela细胞的甲型流感病毒核蛋白基因表达量,并且在一定浓度范围内显示出协同作用。 展开更多
关键词 黄芩苷 连翘苷 甲型流感病毒核蛋白 联合作用 基因表达
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中国2005年～2006年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析 被引量：7
13
作者 马亚珍 韩宗玺 +3 位作者 邵昱昊 张庆霞 刘胜旺 孔宪刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期420-424,共5页
本研究应用RT-PCR方法扩增到我国2005年～2006年8个省市12株IBV病毒核蛋白基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析。以疫苗株H120作为参考毒株,对12株IBV分离株核蛋白基因序列进行分析。结果发现我国分离株的N基因及其局部功能区序列存... 本研究应用RT-PCR方法扩增到我国2005年～2006年8个省市12株IBV病毒核蛋白基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析。以疫苗株H120作为参考毒株,对12株IBV分离株核蛋白基因序列进行分析。结果发现我国分离株的N基因及其局部功能区序列存在广泛的氨基酸替代现象。同时还发现毒株CK/CH/LSD/05Ⅰ与疫苗株H120同源性最高(93.4%)。与GenBank中的11个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的大部分毒株(9株)分布于第Ⅰ群中,可见我国主要的IBV分离株在N基因进化关系上形成了自己独立的进化群。通过与S1基因系统发育进化树比较发现,毒株CK/CH/LSD/05Ⅰ存在基因重组现象。以上结果表明我国2005年～2006年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。 展开更多
关键词 传染性支气管炎病毒 核蛋白基因 基因突变 基因重组
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汉滩病毒囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端在昆虫细胞中的融合表达 被引量：4
14
作者 刘勇 徐志凯 +4 位作者 张芳琳 罗雯 吴兴安 白文涛 胡刚 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期215-217,共3页
目的 :在Bac to Bac杆状病毒表达系统中 ,融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端。方法 :构建含有汉滩病毒G2S0 .7嵌合基因的表达载体 pFBDHTa G2S0 .7,并转化DH10Bac感受态菌。利用其含有的细菌Tn7转座系统 ,将嵌合基因重组至... 目的 :在Bac to Bac杆状病毒表达系统中 ,融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端。方法 :构建含有汉滩病毒G2S0 .7嵌合基因的表达载体 pFBDHTa G2S0 .7,并转化DH10Bac感受态菌。利用其含有的细菌Tn7转座系统 ,将嵌合基因重组至杆状病毒穿梭质粒bacmid中 ,并筛选含有G2S0 .7嵌合基因的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中表达该融合蛋白。对表达产物用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹进行检测。结果 :构建了的含G2S0 .7嵌合基因的重组杆状病毒 ,感染昆虫细胞后 ,可表达相应大小的融合蛋白。该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体 (mAb)所识别。结论 :利用杆状病毒表达系统 ,成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0 .7。 展开更多
关键词 汉滩病毒 杆状病毒 昆虫细胞 核蛋白 糖蛋白 融合表达
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嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达 被引量：11
15
作者 潘晓艺 郝贵杰 +3 位作者 姚嘉赟 徐洋 尹文林 沈锦玉 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期591-597,共7页
嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hl... 嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hly),将基因Spe和Hly通过柔性片段进行融合,并将融合片段插入pET32a的多克隆位点,构建成重组融合表达载体pET32a-Spe-Hly。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得融合蛋白Spe-Hly。表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期大小约130kD相吻合的融合蛋白带。纯化融合蛋白并对鲫鱼进行免疫攻毒试验。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因融合表达载体构建成功,并成功获得了融合蛋白Spe-Hly,对鲫鱼的免疫保护率达81.4%。这为基因工程亚单位多价疫苗的开发提供基础。 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 丝氨酸蛋白酶基因 溶血素基因 融合表达
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鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达 被引量：6
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作者 刘胜旺 孔宪刚 +3 位作者 王玮 高磊 童光志 谷守林 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期401-403,共3页
利用反转录_聚合酶链式反应 (ReverseTranscription_polymeraseChainReaction ,PT_PCR)技术扩增鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)中国地方分离株的核蛋白基因 ,并对其序列进行了测定 ,结果表明该病毒株核蛋白基因长度为 12 3 0bp ,编码蛋白由... 利用反转录_聚合酶链式反应 (ReverseTranscription_polymeraseChainReaction ,PT_PCR)技术扩增鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)中国地方分离株的核蛋白基因 ,并对其序列进行了测定 ,结果表明该病毒株核蛋白基因长度为 12 3 0bp ,编码蛋白由4 0 9个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较 ,发现与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。在此基础上 ,本实验构建了杆状病毒重组转移载体pBlue_N ,将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞 ,经过三轮蚀斑纯化和PCR鉴定 ,获得重组杆状病毒rBac_N。SDS_PAGE分析和Westernblot检测的结果表明核蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞内获得表达 ,融合蛋白表达量占细胞蛋白总量的 19.4 展开更多
关键词 鸡传染性支气管炎病毒 核蛋白 基因序列 重组杆状病毒 表达
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嗜水气单胞菌外毒素和外膜蛋白双基因融合表达载体的构建和高效表达 被引量：8
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作者 何鸣筱 叶巧真 +2 位作者 陈诚 谢俊锋 何建国 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期169-173,共5页
用基因融合方式 ,以嗜水气单胞菌基因组DNA为模板 ,设计引物通过聚合酶链式反应 (PCR)把去除部分毒性活性编码区的细胞毒肠毒素基因 (act)与去除信号肽的外膜蛋白基因 (OmpTS)连接一起 ,两基因之间插入一个link er(Gly4Ser) 3 经BamHⅠ... 用基因融合方式 ,以嗜水气单胞菌基因组DNA为模板 ,设计引物通过聚合酶链式反应 (PCR)把去除部分毒性活性编码区的细胞毒肠毒素基因 (act)与去除信号肽的外膜蛋白基因 (OmpTS)连接一起 ,两基因之间插入一个link er(Gly4Ser) 3 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,得到 2 .1kb的双基因融合片段 ,克隆于表达质粒pQE 30中 ,构建了双基因重组表达载体pQE30 /act GS ompTS ,转化大肠杆菌M15 (pREP4 ) ,经IPTG诱导 ,表达出预期大小 (81.0kD)的融合蛋白Act GS OmpTS ,此蛋白占菌体总蛋白的 4 2 %。Westernblot检测结果显示 ,该蛋白与抗Act兔血清和抗OmpTS兔血清都呈阳性反应 ,表明融合蛋白保留了外毒素和外膜蛋白的反应原性 。 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 细胞毒肠毒素基因 外膜蛋白基因 融合基因表达
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HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗诱导小鼠持久的细胞免疫应答 被引量：13
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作者 赵平 姜春鹏 +2 位作者 赵兰娟 温新宇 戚中田 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第4期576-582,共7页
构建编码HBV包膜 核心蛋白融合基因的DNA疫苗pSC、pSS1S2C和编码HBV包膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗 pHBs、pHBc ,分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应 ,比较融合基因DNA疫苗与单基因... 构建编码HBV包膜 核心蛋白融合基因的DNA疫苗pSC、pSS1S2C和编码HBV包膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗 pHBs、pHBc ,分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应 ,比较融合基因DNA疫苗与单基因DNA疫苗诱生免疫应答的强度 ,发现融合基因DNA疫苗诱生抗体的效率明显不及单基因DNA疫苗 ,但其能诱导更强、更持久的细胞免疫应答 ,表明HBV包膜 核心蛋白融合基因DNA疫苗对于治疗慢性乙型肝炎可能比单基因DNA疫苗更为有效 . 展开更多
关键词 HBV 包膜-核心蛋白融合基因 DNA疫苗 诱导 小鼠 细胞免疫应答
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枯草杆菌DC-2纳豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达 被引量：21
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作者 彭勇 黄庆 张义正 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期559-563,共5页
纳豆激酶是一种纤维蛋白溶解酶 ,有望开发成为新型的溶栓药物 .从中国豆豉中分离的具有较强纤溶活性的枯草杆菌DC 2中提取总DNA ,根据纳豆激酶 (NK)基因序列设计引物 ,用PCR法扩增NK基因 .序列分析表明 ,NK基因成熟肽编码区含有 82 5bp ... 纳豆激酶是一种纤维蛋白溶解酶 ,有望开发成为新型的溶栓药物 .从中国豆豉中分离的具有较强纤溶活性的枯草杆菌DC 2中提取总DNA ,根据纳豆激酶 (NK)基因序列设计引物 ,用PCR法扩增NK基因 .序列分析表明 ,NK基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献报道的序列分别有 93 4 %和 94 5 %同源性 .将NK基因插入载体pGEX 4T1构建表达质粒pGEX NK ,转化大肠杆菌JM10 9后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,发现大量NK融合蛋白表达 ,并形成包涵体 .SDS PAGE分析表明 ,NK融合蛋白作为包涵体的分子量为 5 3kD .凝胶自动扫描结果显示 ,NK融合蛋白约占菌体可溶性蛋白的 2 6 % . 展开更多
关键词 枯草杆菌DC-2 纳豆激酶基因 融合蛋白 基因克隆 基因表达 大肠杆菌
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组织因子膜外区融合蛋白基因的表达及产物的分离纯化与活性分析 被引量：7
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作者 关明 吕元 +3 位作者 倪赞明 王云贵 戴金风 陈常庆 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期35-39,共5页
为构建表达组织因子 (TF)膜外区的融合载体 ,制备组织因子膜外区 ,抽提人胎盘组织的总RNA,通过 RT- PCR法扩增出 TF的 c DNA克隆至 p UC1 8并测定全序列 .然后以此为模板 ,再次PCR扩增出 TF膜外区 (soluble TF,s TF) c DNA,并将其插入... 为构建表达组织因子 (TF)膜外区的融合载体 ,制备组织因子膜外区 ,抽提人胎盘组织的总RNA,通过 RT- PCR法扩增出 TF的 c DNA克隆至 p UC1 8并测定全序列 .然后以此为模板 ,再次PCR扩增出 TF膜外区 (soluble TF,s TF) c DNA,并将其插入到谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体 p GEX4T- 1 ,构建了 tac启动子控制下的 GST- s TF融合蛋白的表达载体 .表达的融合蛋白经亲和层析、凝血酶切得到纯化的 s TF.表达产物经 ELISA验证 ,能特异性地与 TF抗体结合 .重新脂化后 ,该产物具有较大凝血活性 .以上说明采用融合蛋白表达系统可以大量制备组织因子膜外区 ,为研制国产重组凝血活酶试剂和研究 s TF的结构和功能创造条件 . 展开更多
关键词 组织因子 融合蛋白 基因表达 分离纯化 活性 跨膜糖蛋白
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