结核分枝杆菌分泌蛋白早期分泌性抗原6(ESAT-6)的免疫学性质及其在新型疫苗中作用的研究进展 被引量：2

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作者 李玉洁 余海燕 +1 位作者 杨雨婷 杨国平 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期89-94,共6页

早期分泌性抗原6(ESAT-6)是结核分枝杆菌(MTB)关键的毒力因子,可通过抑制巨噬细胞的吞噬杀菌功能与自噬反应抵抗机体对MTB的清除,从而减弱机体对MTB感染的免疫防御功能。此外,ESAT-6诱导的巨噬细胞的凋亡与固有免疫细胞的大量坏死可促进... 早期分泌性抗原6(ESAT-6)是结核分枝杆菌(MTB)关键的毒力因子,可通过抑制巨噬细胞的吞噬杀菌功能与自噬反应抵抗机体对MTB的清除,从而减弱机体对MTB感染的免疫防御功能。此外,ESAT-6诱导的巨噬细胞的凋亡与固有免疫细胞的大量坏死可促进MTB的扩散、定植,引发MTB的全身感染。ESAT-6还可抑制Th1细胞的保护性免疫反应从而抑制相关促炎细胞因子的分泌,引发机体免疫功能的紊乱,加速MTB感染进程。在这一感染过程中,ESAT-6所具备的高度免疫原性使其可作为优势抗原用于新型结核病(TB)疫苗的研制,具有广阔的发展前景。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌(MTB) 早期分泌性抗原6(ESAT-6) 自噬 凋亡 优势抗原 综述

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脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6的检测及其早期诊断价值 被引量：7

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作者 职瑾 史明 +6 位作者 冯国栋 杨毅宁 代文 刘婷婷 边婷 袁子文 赵钢 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期387-390,共4页

目的探讨免疫荧光染色法检测脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)对结核性脑膜炎诊断的价值。方法收集36例确诊结核性脑膜炎患者的脑脊液为病例组,45例非结核性脑膜炎患者脑脊液为对照组。用双盲法对2组脑脊液细胞进行ESAT-6免... 目的探讨免疫荧光染色法检测脑脊液细胞中结核早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)对结核性脑膜炎诊断的价值。方法收集36例确诊结核性脑膜炎患者的脑脊液为病例组,45例非结核性脑膜炎患者脑脊液为对照组。用双盲法对2组脑脊液细胞进行ESAT-6免疫荧光染色,统计分析灵敏度和特异度等。结果病例组ESAT-6存在于中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞中,对照组脑脊液细胞中无ESAT-6表达。灵敏度为88.89%、特异度为93.33%;阳性预测值为91.43%、阴性预测值为91.30%;阳性似然比为13.33、阴性似然比为0.12;Youden指数为82.22%,ROC曲线下面积为0.94。结论免疫荧光染色检测脑脊液细胞中ESAT-6的灵敏度及特异度均较高,是结核性脑膜炎诊断的有效方法。 展开更多

关键词 免疫荧光染色法 早期分泌性靶抗原6 结核性脑膜炎 诊断

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6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)抑制巨噬细胞的自噬并促进BCG的增殖 被引量：1

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作者 徐雪维 赵润鹏 +5 位作者 张荣波 吴静 胡东 邢应如 倪升发 铁保贤 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期310-314,共5页

目的 6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)能够促进卡介苗(BCG)的增殖,巨噬细胞的自噬功能能有效杀伤BCG,研究ESAT6与自噬的相互作用,为揭示ESAT6介导的免疫逃逸提供实验依据。方法分别观察对照质粒pCMV-HA和重组质粒pCMV-HA-ESAT6转染以及Ea... 目的 6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)能够促进卡介苗(BCG)的增殖,巨噬细胞的自噬功能能有效杀伤BCG,研究ESAT6与自噬的相互作用,为揭示ESAT6介导的免疫逃逸提供实验依据。方法分别观察对照质粒pCMV-HA和重组质粒pCMV-HA-ESAT6转染以及Earle平衡盐溶液(EBSS)处理的小鼠RAW264.7巨噬细胞中BCG的生长情况,Western blot法检测转染pCMV-HA-ESAT6的RAW264.7细胞0、8、12、24、32 h后,微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白水平。转染pCMV-HA、pCMV-HA-ESAT6、氯喹(CQ)单独处理和CQ与pCMV-HA-ESAT6转染联合处理条件下,Western blot法检测LC3的水平,Lyso Tracker Red染料法计数溶酶体数量,观察罗琴培养基上BCG的情况。结果 pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中BCG的生长旺盛,而EBSS处理组生长受抑制;在0、8、12、24、32 h,pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换逐渐增强;与对照组相比,溶酶体荧光探针Lyso Tracker Red染色法显示pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的溶酶体较多且体积大,但后三组间均无显著性差异;pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的BCG生长旺盛。结论 ESAT6抑制RAW264.7细胞内的自噬水平,并且能够促进RAW264.7细胞中感染BCG的生长。 展开更多

关键词 早期分泌型抗原靶点6(ESAT6) 巨噬细胞 自噬 卡介苗(BCG)

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抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原(Ag85B-ESAT-6)亚单位疫苗黏膜免疫对结核分枝杆菌的免疫应答 被引量：5

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作者 宁唤唤 张芳琳 +7 位作者 康健 王立飞 路延之 任瑞 白鹭 梁璇 谢燕玲 柏银兰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期886-892,共7页

目的评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法分别用AE、AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T... 目的评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法分别用AE、AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和Th2细胞的IL-10分泌水平,实时荧光定量PCR检测IFN-γ、IL-2、IL-10和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平。MTB静脉感染免疫小鼠,ELISA检测感染小鼠血清抗体及脾细胞细胞因子分泌水平,HE染色分析肺病理改变,平板法计数菌落形成单位(CFU)检测脾和肺荷菌数。结果AE和AE联合c-di-AMP经鼻黏膜免疫可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体,促进脾细胞增殖、脾和肺脏Th1/Th2型细胞因子和TNF-α转录增加、脾Th1/Th2型细胞因子分泌增加。小鼠MTB感染后,与对照组相比,AE和AE联合c-di-AMP免疫小鼠特异性抗体水平仍升高,Th1/Th2型细胞免疫应答增强,肺组织呈炎症反应,肺、脾荷菌数显著降低,且AE联合c-di-AMP免疫小鼠肺、脾荷菌数进一步降低。结论AE亚单位疫苗经黏膜接种可诱导小鼠产生体液与细胞免疫应答,并提供对MTB感染的保护力;c-di-AMP为佐剂可在一定程度上提高AE的免疫原性。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌(MTB) 亚单位疫苗 抗原85B(Ag85B) 6kDa早期分泌靶抗原(ESAT-6) 环二腺苷酸(c-di-AMP) 黏膜免疫

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转化生长因子-β1、Clara细胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6与支气管肺发育不良的相关性研究 被引量：6

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作者 贺成光 朱筛成 陈大业 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2021年第3期74-81,共8页

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、克拉拉细胞分泌蛋白16(clara cell secretory protein,CC16)、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6 (krebs yon denlungen-6,KL-6)在支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasi... 目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、克拉拉细胞分泌蛋白16(clara cell secretory protein,CC16)、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6 (krebs yon denlungen-6,KL-6)在支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)大鼠肺组织中的表达,以及这些蛋白的表达与肺细胞凋亡的关系。方法按随机数字表法随机将SD新生鼠随机分为对照组、模型组,模型组持续暴露在80%~85%氧中构建BPD模型,对照组始终暴露在空气中。每组在7 d,14 d,21 d时(简称为7 d模型组、14 d模型组、21 d模型组)随机选出8只新生鼠处死,留取5 m L血清。HE染色观察各组肺组织病理学改变,并分析辐射状肺泡计数(radial alveolar count,ROC),肺泡平均截距(mean linear intercept,MLI)。TUNEL染色检测各组肺组织中的细胞凋亡。ELISA检测各组新生鼠的血清中TGF-β1、CC16、KL-6的水平。Western blot检测各组肺组织中TGF-β1、CC16、KL-6的表达水平。同时分析肺组织中TGF-β1、CC16、KL-6的表达与肺组织细胞凋亡率的关系。结果与正常组相比,模型组肺组织随暴露氧时间的延长BPD损伤加剧,RAC、血清中CC16的水平以及肺组织中CC16的表达明显减少,MLI、细胞凋亡率、血清中TGF-β1、KL-6的水平,肺组织中TGF-β1、KL-6的表达明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,模型组新生鼠肺组织中TGF-β1、KL-6的表达与肺组织的细胞凋亡率呈正相关(r=0.977、0.970,均P=0.000),CC16的表达与细胞凋亡率呈现负相关(r=-0.982,P=0.000)。结论肺组织中TGF-β1、CC16、KL-6的表达与BPD肺组织的细胞凋亡密切相关。 展开更多

关键词 转化生长因子-Β1 克拉拉细胞分泌蛋白16 Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6 支气管肺发育不良 肺细胞凋亡

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CDK4/6抑制剂后时代下的乳腺癌精准诊疗

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作者 李彬 陶中华 胡夕春 《中国癌症杂志》 北大核心 2025年第3期273-282,共10页

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4/6抑制剂联合内分泌治疗是激素受体阳性、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阴性晚期乳腺癌患者的标准一线治疗方案。CDK4/6抑制剂的出现使患... 细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4/6抑制剂联合内分泌治疗是激素受体阳性、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阴性晚期乳腺癌患者的标准一线治疗方案。CDK4/6抑制剂的出现使患者预后得到进一步提升,但也带来了新的临床问题,如许多患者在治疗后仍会出现进展和耐药,而目前对于CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗进展的患者缺乏标准的后续治疗方案。内分泌治疗药物耐药通过雌激素受体(estrogen receptor,ESR)依赖或非依赖性途径导致肿瘤进展,新型内分泌治疗药物可能使携带ESR1基因突变的乳腺癌患者获益。携带磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路变异的患者可能对该通路的靶向抑制剂治疗敏感。此外,已获批或正在早期开发的新型抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)、免疫联合治疗方案及新型细胞周期特异性药物也展现出积极的抗肿瘤活性。以精准药物为基础的组合方案在丰富临床选择的同时,也让个体化治疗成为可能,基于生物标志物的精准治疗策略成为CDK4/6抑制剂后时代的重要发展方向。 展开更多

关键词 激素受体阳性晚期乳腺癌 细胞周期蛋白依赖性激酶4和6抑制剂 精准诊疗 内分泌治疗 靶向治疗 抗体药物偶联物

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结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定 被引量：8

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作者 蒋玉凤 钟森 +3 位作者 史小玲 王明勇 张建军 邓存良 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第5期65-68,47,共5页

目的　用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法　以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物... 目的　用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法　以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体pUCm -T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR反应产物克隆于真核表达载体 pcDNA3 1(+)上。并用脂质体介导真核表达重组质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT - 6转染真核细胞COS - 7,72h后 ,通过SDS -PAGE和免疫印迹鉴定ESAT - 6基因表达的蛋白。结果　用结核杆菌基因ESAT - 6构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT-成功 ,通过SDS -PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量 6kDa的特异蛋白 ,免疫印迹证明该 6kDa蛋白能与抗ESAT - 6单克隆抗体反应。结论　结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒成功构建 ,该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6。 展开更多

关键词 结核分支杆菌 ESAT-6 真核表达质粒 蛋白表达 鉴定 早期分泌性抗原靶蛋白

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小鼠巨噬细胞内表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对细胞增殖和凋亡的影响 被引量：6

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作者 任琳 李轶 +2 位作者 王山梅 师娟 郭思 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1809-1814,共6页

目的:建立培养滤液蛋白10-早期分泌性抗原靶6(CFP10-ESAT6)真核表达质粒并转染RAW264.7巨噬细胞,观察胞内表达CFP10-ESAT6对细胞活性及凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法:将CFP10-ESAT6融合基因插入真核表达质粒pEGFP-N1,构建重组质粒... 目的:建立培养滤液蛋白10-早期分泌性抗原靶6(CFP10-ESAT6)真核表达质粒并转染RAW264.7巨噬细胞,观察胞内表达CFP10-ESAT6对细胞活性及凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法:将CFP10-ESAT6融合基因插入真核表达质粒pEGFP-N1,构建重组质粒,转染RAW264.7巨噬细胞。采用MTT的方法测定CFP10-ESAT6融合蛋白对RAW264.7巨噬细胞活性的影响,采用结核分枝杆菌19 kD脂蛋白和十字孢碱(staurosporine)处理RAW264.7巨噬细胞,并以流式细胞术检测细胞凋亡率以及Toll样受体2(TLR2)的表达。结果:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6并转染至RAW264.7巨噬细胞;与对照组相比,胞内表达CFP10-ESAT6不能影响巨噬细胞的活性,但可以明显抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡(P<0.05),并显著抑制了TLR2的表达(P<0.05)。结论:巨噬细胞内表达的CFP10-ESAT6融合蛋白不具有细胞毒性作用,但可以通过下调TLR2的表达来抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10 早期分泌性抗原靶6 巨噬细胞 细胞增殖 细胞凋亡

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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步评价 被引量：2

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作者 栾秀丽 范雪亭 +9 位作者 王瑞欢 李马超 于晋杰 钱程宇 曹斌 赵秀芹 刘志广 刘海灿 李桂莲 万康林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期589-596,共8页

目的融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpo... 目的融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpot与Luminex检测细胞因子,进行MTB体外生长抑制试验。卡介苗(BCG)为阳性对照。结果CE免疫小鼠,能诱导产生高效价的IgG、IgG1和IgG2a,且IgG1(t=19.1,P<0.0001)和IgG2a(t=8.7,P<0.0001)抗体水平均高于BCG组。CE组与BCG组诱导产生的分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)数量差异无统计学意义(t=0.4,P>0.05),但诱导分泌IL-4的SFC数量高于BCG组(t=8.0,P<0.0001)。CE组诱导分泌GM-CSF(t=8.4,P<0.05)、IL-6(t=8.3,P<0.05)、IL-10(t=2.5,P<0.05)和IL-4(t=7.0,P<0.05)均高于BCG组,而CE组诱导分泌IFN-γ(t=1.4,P>0.05)、TNF-α(t=1.8,P>0.05)、IL-2(t=2.0,P>0.05)、IL-12(t=0.9,P>0.05)和IL-17(t=1.3,P>0.05)均与BCG组相似,差异无统计学意义。CE组小鼠脾细胞的MTB体外生长抑制结果与BCG组相似(t=0.8,P>0.05)。结论CE免疫小鼠可诱导较强的Th1与Th2混合型免疫反应,且有较强的体外抑制MTB生长的能力,表明CE具有良好的结核疫苗研制应用价值。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10 早期分泌抗原靶6 重组融合蛋白CE 疫苗

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PstS1-ESAT-6抗原血清学和γ-干扰素释放试验辅助诊断结核病的价值 被引量：5

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作者 何秀云 黄香玉 +5 位作者 朱传智 陈红兵 张翠英 肖漓 高钰 孔祥瑞 《中国防痨杂志》 CAS 2016年第10期805-812,共8页

目的分析重组融合蛋白PstS1-ESAT-6抗原血清学和r干扰素释放试验辅助诊断结核病的潜在价值。方法选取40只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级BALB／c小鼠和18只SPF级豚鼠，均分别注射卡介苗（BCG）或热灭活结核分枝杆菌。... 目的分析重组融合蛋白PstS1-ESAT-6抗原血清学和r干扰素释放试验辅助诊断结核病的潜在价值。方法选取40只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级BALB／c小鼠和18只SPF级豚鼠，均分别注射卡介苗（BCG）或热灭活结核分枝杆菌。选取解放军第三0九医院全军结核病研究所于2012年3—8月收治入院的129例结核病患者（结核病组）、54例非结核性肺部相关疾病患者（非结核病组）和194名健康者（健康对照组）作为研究对象。研究对象均采集外周静脉血。外周血单个核细胞（PBMC）和免疫的小鼠脾淋巴细胞经重组融合蛋白PstS1-ESAT-6体外刺激，应用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测经抗原刺激后释放r干扰素（IFN-γ）的效应T淋巴细胞即斑点形成细胞（SFC）；应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测外周血血浆和免疫小鼠血清抗重组融合蛋白PstS1-ESAT-6的IgG；应用孟都法（Mantoux）检测健康者BCG-PPD皮试、免疫豚鼠BCG-PPD皮试及重组融合蛋白PstS1-ESAT-6皮试。结果结核病组PBMC体外经重组融合蛋白PstS1-ESAT-6刺激，分泌IFN-γ的SFC数为（45．02±68．03）／z．5x10。个PBMC，高于非结核病组的（11．87±38．63）／2．5×10。个PBMC和健康对照组的（5．24±15．46）／2．5×10。个PBMC（F=32．96，P=0．000）。ELISPOT诊断结核病患者的敏感度为82．2％（106／lZ9），诊断非结核病组患者和健康者的特异度分别为87．0％（47／54）和90．2％（175／194），两者特异度比较差异无统计学意义（χ^2=0.45，P=0．500）。结核病组血浆中抗重组融合蛋白PstS1-ESAT-6的IgG水平（平均A492值为0.82±0.66）高于非结核病组[平均A492值为（0.60±0.30）]和健康对照组[平均A492为（0．36±0．20）1（F=43．60，P=0.000）；ROC分析确定检测临界值为0.49，其用于诊断结核病的敏感度为62．2％（69／111）、诊断非结核病组的特异度为40．4％（19／47）、诊断健康者的特异度为84．5％（164／192），诊断非结核病组与健康组的特异度比较，差异有统计学意义（χ^2=42．60，P〈0．01）。热灭活结核分枝杆菌免疫豚鼠均产生BCG-PPD和重组融合蛋白PstS1-ESAT-6皮试反应，所有豚鼠皮肤出现红肿或硬结平均直径〉5mm；热灭活结核分枝杆菌免疫小鼠，重组融合蛋白PstS1-ESAT-6的ELISPOT和ELISA检测均为阴性。BCG免疫豚鼠只产生BCG-PPD皮试反应，硬结平均直径为（10．08±0．36）mm，不产生重组融合蛋白PstS1-ESAT-6皮试反应；BCG免疫小鼠，重组融合蛋白PstS1-ESAT-6的ELISPOT检测阴性，而ELISA检测为阳性。结论ELISPOT用于结核病诊断优于血清学诊断，但其诊断活动I生结核病价值还需进一步论证。 展开更多

关键词 结核 早期分泌抗原靶6 结核菌素试验 酶联免疫斑点检测 酶联免疫吸附测定 对比研究

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结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

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作者 王敏 罗琴芳 黄韧 《中国比较医学杂志》 2008年第7期16-19,共4页

目的构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(Early secretary antigenic target,ESAT-6)基因的pET原核表达载体,诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物,用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因,产物通过... 目的构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(Early secretary antigenic target,ESAT-6)基因的pET原核表达载体,诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物,用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-32a(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21菌体中IPTG诱导表达,并经镍柱纯化、Western-blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致;表达融合蛋白相对分子质量约2.5×104,并能与特异性单抗结合,具有一定免疫学活性。结论成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 早期分泌性抗原靶ESAT-6 载体构建 融合表达

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活动性肺结核相关巨噬细胞M1/M2极化的改变及ESAT6对巨噬细胞极化的影响

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作者 盖林林 孙维策 +1 位作者 褚锦锦 徐栋花 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2024年第20期2867-2873,共7页

目的探讨活动性肺结核患者外周血中单核-巨噬细胞M1/M2极化的变化及结核分枝杆菌ESAT6对人源THP-1细胞极化的影响。方法收集14例活动性肺结核(活动性肺结核组)和10例健康人(健康对照组)肝素钠抗凝全血和血清,采用淋巴细胞液分离肝素钠... 目的探讨活动性肺结核患者外周血中单核-巨噬细胞M1/M2极化的变化及结核分枝杆菌ESAT6对人源THP-1细胞极化的影响。方法收集14例活动性肺结核(活动性肺结核组)和10例健康人(健康对照组)肝素钠抗凝全血和血清,采用淋巴细胞液分离肝素钠全血中单个核细胞(PBMCs),通过实时-定量PCR仪检测确诊的活动性肺结核患者PBMCs中HLA-DR、CD11C、CD68、CD206、Arg-1的mRNA水平,应用流式细胞仪检测细胞因子(IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-4等)的分泌情况。将人源THP-1细胞经佛波酯(PMA)诱导分化,将其变成巨噬细胞样细胞后,分为M0组、M1组、M2组、M0+ESAT6组,刺激24 h后,荧光定量PCR检测HLA-DR、CD11C、CD68、CD206、Arg-1的mRNA水平。ESAT6分别刺激THP-16 h、12 h、24 h后,流式技术检测细胞培养上清中相关细胞因子的水平(IL-2、IL-6、TNF-α、IL-4等)。结果与健康对照组相比,活动性肺结核组外周血PBMCs中M1极化表型分子HLA-DR、CD11C、CD68的mRNA表达水平均上调(P<0.05);M2极化表型分子CD206 mRNA的表达水平下降(P<0.05),Arg-1 mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。活动性肺结核组患者血清M1极化相关的促炎性细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均上升(P<0.05),抗炎性细胞因子IL-4水平降低(P<0.05)。体外诱导THP-1巨噬细胞分化为不同表型,细胞M1极化表型分子HLA-DR mRNA表达水平在各组之间有统计学意义(F=21.83,P=0.000),两两比较结果显示,M1表型组、M0+ESAT6表型组均较M0组明显上调(P<0.05),其余组间差异无统计学意义(P>0.05);但CD68 mRNA表达水平在各组之间差异无统计学意义(F=2.480,P=0.135)。细胞M2极化表型分子CD206、Arg-1 mRNA水平在各组之间差异无统计学意义(F=1.233,P=0.3597;F=6.059,P=0.068)。M1极化相关的促炎性细胞因子IL-2及抗炎性细胞因子IL-4在各组细胞培养不同时间节点均差异无统计学意义(P>0.05)。与M0和ESAT6表型组相比,M1表型组促炎性细胞因子IL-6和TNF-α水平在培养12 h、24 h均显著升高(P<0.05,P<0.05,P<0.001,P<0.001;P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01);其余组间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论活动性肺结核外周血单核-巨噬细胞向M1极化的能力增强,向M2极化的能力减弱。结核分枝杆菌ESAT6可以促进巨噬细胞向M1极化,影响肺结核病情活动及进展。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 巨噬细胞 极化 活动性肺结核 6KD早期分泌靶向蛋白

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脑脊液单核细胞内ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值 被引量：5

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作者 杨笑 郭旻 谢鹏 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期330-333,共4页

目的通过检测结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者脑脊液单核细胞中的早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target,ESAT-6),探讨ESAT-6在TBM诊断中的价值。方法将42例TBM患者与47例对照组患者进行脑脊液生化、细胞... 目的通过检测结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者脑脊液单核细胞中的早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target,ESAT-6),探讨ESAT-6在TBM诊断中的价值。方法将42例TBM患者与47例对照组患者进行脑脊液生化、细胞学、抗酸染色检查,同时用免疫荧光细胞化学染色法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6。结果在临床诊断TBM的42例患者中有38例脑脊液单核细胞中检出ESAT-6,47例对照组中检出4例。TBM组ESAT-6的检出率明显高于对照组(P<0.05)。该方法诊断TBM的敏感性为90.48%,特异性为91.49%。约登指数达到0.82。结论检测脑脊液单核细胞内结核特异性抗原ESAT-6用于诊断TBM,具有灵敏度、特异度高的特点,而且简单易行,有望成为诊断TBM的一种新的辅助方法。 展开更多

关键词 结核性脑膜炎 脑脊液 早期分泌抗原靶蛋白6

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结核分枝杆菌Hsp65-Esat6与hGM-CSF联合DNA疫苗的构建与体外研究 被引量：1

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作者 王森林 张梦媛 +2 位作者 王学坤 周曙光 江振友 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期29-35,共7页

目的:应用分子生物学技术,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以p EGHsp65Esat-6为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,同时从质粒p ORF-h GM-CSF中扩增出基因佐剂h GM-CSF,分别克隆到真核表达载体p I... 目的:应用分子生物学技术,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以p EGHsp65Esat-6为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,同时从质粒p ORF-h GM-CSF中扩增出基因佐剂h GM-CSF,分别克隆到真核表达载体p IRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并转染Hep G-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.93 kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65-Esat6和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(h GM-CSF)序列与Gen Bank上公布序列完全一致;Western-bolt检测到Hsp65-Esat6融合蛋白相对分子质量(Mr)为75 000 k Da;RT-PCR方法检测出p IGM,p IHsp65GM和p IHsp65-Esat6GM转染组细胞均有h GM-CSF mRNA表达,三组细胞中h GM-CSF基因mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05).ELISA方法检测到p IHsp65-Esat6GM转染组细胞培养上清中h GM-CSF的表达,且与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:成功构建和表达了p IHsp65-Esat6GM质粒,为研制优于卡介苗(BCG)的新型抗结核病的DNA疫苗奠定了基础. 展开更多

关键词 热休克蛋白65kd-早期分泌性抗原靶6kd 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 双顺反子 基因佐剂

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瓜氨酸化蛋白在类风湿关节炎中的研究进展 被引量：2

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作者 高佩芳 姚茹冰 +1 位作者 蔡辉 虞伟 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 2010年第3期219-221,228,共4页

研究发现,瓜氨酸化蛋白(Citrullinated Protein)是导致类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)发病的重要靶抗原之一,其相对应的血清抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体被认为是目前RA早期诊断的血清学指标中最有前途的特异性诊断抗体。本文主要对... 研究发现,瓜氨酸化蛋白(Citrullinated Protein)是导致类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)发病的重要靶抗原之一,其相对应的血清抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体被认为是目前RA早期诊断的血清学指标中最有前途的特异性诊断抗体。本文主要对瓜氨酸蛋白在RA中的研究进展做一简要综述。 展开更多

关键词 类风湿关节炎 瓜氨酸化蛋白 靶抗原 发病机制 早期诊断

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结核分枝杆菌ESAT-6 DNA疫苗的细胞和体液应答及保护效率研究 被引量：1

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作者 蔡宏 田霞 +2 位作者 呼西旦 李淑霞 朱玉贤 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期279-283,共5页

构建了含分枝杆菌抗原ESAT_6( 6kDa)分泌蛋白 (结构基因 )的真核表达载体pJW43 0 3 ,进行了酶切鉴定和序列分析 ,确定含有正确的读码框。用脂质体介导法将重组表达质粒导入COS7细胞内并瞬时表达 ,收集表达细胞或浓缩上清液 ,进行SDS_PAG... 构建了含分枝杆菌抗原ESAT_6( 6kDa)分泌蛋白 (结构基因 )的真核表达载体pJW43 0 3 ,进行了酶切鉴定和序列分析 ,确定含有正确的读码框。用脂质体介导法将重组表达质粒导入COS7细胞内并瞬时表达 ,收集表达细胞或浓缩上清液 ,进行SDS_PAGE电泳 ,用结核杆菌特异性抗体进行免疫印迹检测 ,证明上述重组质粒能在哺乳动物细胞中表达出特异蛋白。重组表达质粒肌注免疫小鼠 ,首免后 2 1d,未检测到特异性抗体 ,二免和三免 2 1d后ESAT_6的特异性抗体平均效价分别为 1∶40 0和 1∶80 0。三免后 2 1dESAT_6的特异性细胞因子γ_干扰素的浓度为 1 2 .8± 0 .4ng/mL,而阴性对照空载体DNA组三免后只诱导产生 <0 .1ng/mL的γ_干扰素。三免后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏的细菌数比对照空载体组减少了 90 %以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 ESAT-6分泌蛋白抗原 ESAT-6 DNA疫苗 免疫原性 保护

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ESAT-6刺激结核患者CD4^+ T淋巴细胞前后释放IFN-γ mRNA差异表达及信号通路变化 被引量：1

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作者 张焰 王晓玮 +1 位作者 程筱雯 徐元宏 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2016年第12期1727-1732,共6页

目的利用全基因组表达谱芯片对早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)刺激结核患者外周血CD4^+T淋巴细胞前后释放γ-干扰素(IFN-γ)mRNA进行检测,并对mRNA在刺激过程中可能涉及到的信号通路变化进行分析。方法抽取3例初诊结核患者外周静脉血各10 ml... 目的利用全基因组表达谱芯片对早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)刺激结核患者外周血CD4^+T淋巴细胞前后释放γ-干扰素(IFN-γ)mRNA进行检测,并对mRNA在刺激过程中可能涉及到的信号通路变化进行分析。方法抽取3例初诊结核患者外周静脉血各10 ml,密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞(PBMC),ESAT-6刺激PBMC,6 h后磁珠法分选CD4^+T淋巴细胞,提取细胞总RNA,全基因组表达谱芯片检测刺激前后差异表达基因。利用GO分析对差异表达的基因进行功能分类,KEGG进行信号通路分析。结果 ESAT-6刺激后差异表达的mRNA共有2 297条,相对高表达的mRNA有1 071条,相对低表达的mRNA有1 226条(>2倍变化且P<0.05)。信号通路分析显示差异表达的mRNA参与了17条信号通路的调控,其中JAK-STAT信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等5条信号通路与结核释放IFN-γ关系密切。结论 ESAT-6刺激后的CD4^+T淋巴细胞有大量mRNA发生差异表达,其在多个与结核释放IFN-γ密切相关的信号通路中发挥着重要的调控作用。 展开更多

关键词 早期分泌靶向抗原6 Γ-干扰素 基因芯片 信号通路 结核

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CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒的构建和表达 被引量：1

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作者 冯鑫 杨静 +5 位作者 张春燕 穆柳青 徐蕾 何永林 董志玲 杨春 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期408-412,共5页

目的:构建结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tb)CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:以M.tb H37Rv株DNA作为模板,PCR法扩增ESAT6和PPE68基因,利用基因拼接技术中的Gene-SOEing法扩增E... 目的:构建结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tb)CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:以M.tb H37Rv株DNA作为模板,PCR法扩增ESAT6和PPE68基因,利用基因拼接技术中的Gene-SOEing法扩增ESAT6-PPE68融合基因,克隆至原核表达质粒pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68。再分别以H37Rv株DNA和重组质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68为模板扩增CFP10和ESAT6-PPE68基因,Gene-SOEing法获取目的基因CFP10-ESAT6-PPE68,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果:CFP10-ESAT6-PPE68酶切片段大小与理论值符合,基因测序结果显示融合基因CFP10-ESAT6-PPE68的序列与Genbank中序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达了目的蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,相对分子量约为77 kD。结论:成功构建了M.tb CFP10-ESAT6-PPE68融合基因的原核表达质粒,并诱导表达出了融合蛋白,为该融合蛋白在结核病血清诊断学中的应用奠定了实验基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10 6kD早期分泌抗原靶 戊糖-5-磷酸-3差向异构酶 融合蛋白

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评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB在肺外结核病诊断中的敏感性 被引量：46

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作者 霍霏霏 张丽帆 刘晓清 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期449-452,共4页

目的评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB检测在肺外结核病诊断中的敏感性。方法对北京协和医院根据细菌学或/和组织学诊断的肺外结核患者31例,应用酶联免疫斑点技术检测6kD早期分泌靶向抗原和10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后外周血中释放γ-... 目的评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB检测在肺外结核病诊断中的敏感性。方法对北京协和医院根据细菌学或/和组织学诊断的肺外结核患者31例,应用酶联免疫斑点技术检测6kD早期分泌靶向抗原和10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后外周血中释放γ-干扰素的特异性T细胞。结果31例肺外结核患者中29例T-SPOT.TB检测阳性,敏感性为93.5%(95%CI84.8%～100%),6kD早期分泌靶向抗原肽段库刺激后斑点形成细胞数中位数为196/106PB-MCs(4分位间距72～532/106PBMCs),10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后斑点形成细胞数中位数为276/106PBMCs(4分位间距72～568/106PBMCs),对两个肽段库总的斑点形成细胞中位数为612/106PBMCs(4分位间距192～1152/106PBMCs)。结论T-SPOT.TB检测对肺外结核诊断具有较高的敏感性。 展开更多

关键词 肺外结核 敏感性 T-SPOT.TB 6kD早期分泌靶向抗原肽段库 10kD培养滤过蛋白肽段库 γ干扰素释放分析

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结核分枝杆菌EsxV亚单位疫苗黏膜免疫诱导的免疫应答 被引量：3

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作者 白鹭 宁唤唤 +6 位作者 康健 梁璇 谢燕玲 彭钰君 张婧瑶 路延之 柏银兰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期379-386,共8页

目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。... 目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以EsxV和/或联合环二腺苷酸(c-di-AMP)经鼻黏膜免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠特异性抗体水平及亚类,MTS法检测脾细胞增殖,qRT-PCR检测脾和肺脏细胞因子表达水平,ELISA法检测脾细胞因子分泌水平。结果成功构建EsxV的原核表达载体pET28a(+)-esxV并诱导表达目的蛋白,亲和层析法获得了纯化的重组EsxV蛋白。EsxV经黏膜免疫可诱导显著的体液免疫应答,但诱导的细胞免疫应答水平不高。EsxV与c-di-AMP经黏膜接种可诱导特异性IgG水平增加,EsxV蛋白特异的脾细胞增殖,脾和肺细胞的IFN-γ转录增加。c-di-AMP显著提高EsxV特异的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17细胞因子分泌,而不诱导炎症因子TNF-α和IL-6表达。结论EsxV与c-di-AMP佐剂构建的亚单位疫苗可诱导特异性体液和细胞免疫应答,可进一步用于新型结核病亚单位疫苗的研制。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 6kDa早期分泌靶抗原分泌系统蛋白V(EsxV) 亚单位疫苗 黏膜免疫 环二腺苷酸

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