Mixture与响应面法结合开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基 被引量：2

1

作者 汪梁 刘旭平 谭文松 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期70-78,共9页

采用Mixture与响应面实验设计相结合的方法开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基。在实验室已知配方的6种培养基A-F的基础上,通过Mixture实验筛选出BHK-21细胞无血清培养基的最优组合为A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。利用响应面法针... 采用Mixture与响应面实验设计相结合的方法开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基。在实验室已知配方的6种培养基A-F的基础上,通过Mixture实验筛选出BHK-21细胞无血清培养基的最优组合为A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。利用响应面法针对培养基中的几种关键组分进行浓度优化,确定谷氨酰胺、酪氨酸、牛血清白蛋白和钙离子的最优浓度分别为3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。该无血清悬浮培养基能很好地支持BHK细胞悬浮生长,培养时细胞最大活细胞密度可达140.21×105个/m L,比商业培养基提高了1.95倍。采用Mixture试验设计和响应面分析法能够在较短的时间内开发出适合BHK-21细胞生长的无血清悬浮培养基,为采用BHK-21细胞大规模工业化生产口蹄疫疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 BHK-21细胞 无血清悬浮培养基 Mixture实验设计 响应面分析

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无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响

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作者 周伟 刘旭平 +3 位作者 张艳敏 彭雯娟 赵亮 谭文松 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2397-2405,共9页

【目的】建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗的工艺,提高PCV2疫苗生产效率,降低PCV2疫苗生产成本。【方法】首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化,并在无血清悬浮培养体系下,采用... 【目的】建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗的工艺,提高PCV2疫苗生产效率,降低PCV2疫苗生产成本。【方法】首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化,并在无血清悬浮培养体系下,采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数(MOI)(0.10、0.05、0.01和0.001)和不同PK-15细胞接种密度(CDI)(1.0×10^(6)、3.0×10^(6)、5.0×10^(6)/mL)对PCV2增殖的影响,同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养,且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^(-1)增加到0.6 d^(-1);悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代,连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^(-1)附近波动,且细胞活率始终>90%;以1.0×10^(6)/mL接种,第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10^(6)/mL,并可维持1 d,第4天前活率均>90%,此后快速下降;病毒增殖最佳工艺参数为:感染复数为0.05,细胞接种密度为1.0×10^(6)/mL,最终收获时病毒滴度可达10^(6.2)TCID_(50)/mL;对细胞感染前后的代谢分析发现,病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前,且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累,之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株,PK-15细胞可用于PCV2增殖,结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。 展开更多

关键词 PK-15细胞 无血清悬浮培养 猪圆环病毒2型(PCV2) 增殖 氨基酸代谢

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F81细胞无血清悬浮驯化后培养猫泛白细胞减少症病毒的研究 被引量：4

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作者 张久鑫 邵宝顺 +6 位作者 朱辉 贾浩苒 梁琳 汤新明 崔尚金 梁瑞英 王龙涛 《动物医学进展》 北大核心 2023年第1期48-53,共6页

为解决国内猫泛白细胞减少症生物制品短缺的问题,筛选出适用于猫泛白细胞减少症病毒增殖的猫肾细胞系(F81),通过对贴壁F81进行降血清悬浮驯化培养,得到了无血清全悬浮培养F81细胞系。研究建立的F81细胞系在初始传代细胞密度为1×10^... 为解决国内猫泛白细胞减少症生物制品短缺的问题,筛选出适用于猫泛白细胞减少症病毒增殖的猫肾细胞系(F81),通过对贴壁F81进行降血清悬浮驯化培养,得到了无血清全悬浮培养F81细胞系。研究建立的F81细胞系在初始传代细胞密度为1×10^(6)cells/mL时,培养48 h后细胞密度可达到7.02×10^(6)cells/mL。对培养猫泛白细胞减少症病毒工艺进行摸索,确定最佳接毒工艺为同步接毒法,初始接毒细胞密度为1×10^(6)cells/mL、MOI为3.5×10^(-2),培养72 h后收毒,病毒滴度可达到10^(7.25)TCID_(50)/0.1 mL。该方法使用同源细胞系且未添加动物血清,为猫泛白细胞减少症生物制品生产降低了下游生产纯化难度,同时降低了生产成本,可显著提高产品核心竞争力。研究结果可为其他猫用生物制品相关研究提供参考。 展开更多

关键词 F81细胞 细胞驯化 无血清悬浮培养 猫泛白细胞减少症病毒

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无血清培养基悬浮培养BHK21细胞驯化的研究 被引量：4

4

作者 井莲娜 付智财 黄炯 《草食家畜》 2013年第3期51-56,共6页

本研究主要探索用常规BHK21贴壁细胞(F38)驯化为适应无血清培养基的全悬浮细胞的过程并使用生物反应器放大进行了相关研究。实验表明:常规BHK21细胞通过运用相应的商品化培养基进行低血清贴壁驯化、再到低血清全悬浮驯化、最后到无血清... 本研究主要探索用常规BHK21贴壁细胞(F38)驯化为适应无血清培养基的全悬浮细胞的过程并使用生物反应器放大进行了相关研究。实验表明:常规BHK21细胞通过运用相应的商品化培养基进行低血清贴壁驯化、再到低血清全悬浮驯化、最后到无血清全悬浮驯化,使细胞达到全悬浮的状态。经过四十代的传代后,细胞在无血清悬浮培养基中生长细胞数量可达3.0×106/mL以上,且形态较好,倍增时间稳定,活力在90%以上。实验中采用速降和缓降两种方法进行过渡驯化,结果表明,在贴壁状态下,细胞对缓降方式比速降方式适应性要好,细胞的形态较好,活力在90%以上。细胞从低血清悬浮到无血清悬浮过程中,两种过渡方式无明显差异,均经过了5～10代驯化,细胞就完全适应了无血清悬浮培养基。无血清悬浮细胞从液氮中复苏后,采用直线放大的形式从1.5 mL到250 mL再到5 L反应器最后到650 L反应器中生长。在培养参数方面进行了摸索,最终验证用直线放大的方法是可行的。细胞数量可达4.5×106/mL左右,细胞活力在90%以上,且细胞在放大过程中,形态良好,倍增时间稳定在18 h。 展开更多

关键词 无血清悬浮培养 BHK21 驯化

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哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术研究进展 被引量：14

5

作者 王朋朋 黄书林 +2 位作者 张云科 王展慧 吴文学 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第3期839-845,共7页

随着生物制品行业的快速发展,哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术已经运用到越来越多的领域中。该技术能够扩大哺乳动物细胞培养的规模,提高生物制品的产量及质量,拓宽哺乳动物细胞的应用领域,并促进哺乳动物细胞生产实现工业化与产业化... 随着生物制品行业的快速发展,哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术已经运用到越来越多的领域中。该技术能够扩大哺乳动物细胞培养的规模,提高生物制品的产量及质量,拓宽哺乳动物细胞的应用领域,并促进哺乳动物细胞生产实现工业化与产业化。但悬浮驯化后的细胞,与父母代细胞相比,蛋白表达水平与生长调节通路均发生了不同程度的改变,使其生产性能受到影响。对此,国内外学者开展了大量的研究并取得了较好进展。作者阐述了哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的研究现状以及临床生产工艺的优化策略,以期为哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的发展提供参考。 展开更多

关键词 哺乳动物细胞 无血清全悬浮培养技术 优化工艺

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神经干细胞提取与培养方法的比较研究 被引量：8

6

作者 吴增 李媛 +2 位作者 靳晓飞 周晓红 高维娟 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期729-734,共6页

目的探讨神经干细胞(neural stem cells,NSCs)提取、培养的最佳方法,为NSCs的基础研究提供技术参考。方法对NSCs的不同提取、培养方法进行比较:提取胎鼠与乳鼠的大脑皮质、采用不同类型培养基、不同接种密度、不同培养方法、不同换液方... 目的探讨神经干细胞(neural stem cells,NSCs)提取、培养的最佳方法,为NSCs的基础研究提供技术参考。方法对NSCs的不同提取、培养方法进行比较:提取胎鼠与乳鼠的大脑皮质、采用不同类型培养基、不同接种密度、不同培养方法、不同换液方法、不同传代方法,观察NSCs的成球率和NSCs未分化状态的稳定性。用多功能微孔板读数仪检测NSCs活性。结果 (1)胎龄14 d胎鼠较新生24 h内乳鼠的大脑皮质提取NSCs的比例高,杂细胞少,形成的神经球数量多。(2)采用无血清培养基,NSCs可以稳定在未分化状态;而采用含血清培养基,NSCs多数分化为神经元和胶质细胞。(3)以1.0×109·L^(-1)密度接种的NSCs,培养形成的神经球数量多,且状态良好。(4)悬浮培养法较贴壁培养法,可以形成稳定的神经球,有利于保持NSCs处于未分化的状态。(5)半量换液法和只加液不弃液法培养形成的神经球的状态优于全量换液法。(6)原代和1代的神经球用机械吹打法传代后,NSCs的活细胞比例高,再次形成的神经球状态好,且较其他两种方法简便;2代及以后的神经球用Accutase酶传代后,NSCs的活细胞比例高,再次形成的神经球状态好。(7)14 d胎鼠Accutase酶消化组的NSCs活性高于另外3组,差异均具有显著性(P<0.05)。结论提取胎龄14 d胎鼠的大脑皮质,采用无血清培养基,以1.0×10~9·L^(-1)1的密度接种于25 cm^2培养瓶,采取悬浮培养法,每2~3 d加液1~1.5m L,每6~7 d传代1次,所得到的NSCs增殖分裂旺盛,成球率高,神经球状态良好,可以保持稳定的未分化状态。 展开更多

关键词 神经干细胞 细胞提取 悬浮培养法:无血清培养基 细胞活性 巢蛋白

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全悬浮MDCK细胞驯化与H9亚型禽流感疫苗毒种制备 被引量：2

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作者 赖汉漳 谭文松 +10 位作者 詹烜子 刘旭平 麦康聪 刘玉鹏 汤钦 盘伟岚 王小芬 陈华坚 陈培军 许东蕾 陈瑞爱 《广东畜牧兽医科技》 2021年第6期45-49,共5页

为了研制悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗,笔者对细胞和疫苗毒种进行了驯化。将贴壁的MDCK细胞利用直接适应无血清法经过方瓶预驯化3代、摇瓶培养驯化13代得到了一株适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系,命名为MDCK(DHN)细胞系。该细胞密... 为了研制悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗,笔者对细胞和疫苗毒种进行了驯化。将贴壁的MDCK细胞利用直接适应无血清法经过方瓶预驯化3代、摇瓶培养驯化13代得到了一株适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系,命名为MDCK(DHN)细胞系。该细胞密度高,呈单个分散生长,形态饱满,大小均一,活性强。在此基础上,将H9亚型禽流感CN株鸡胚毒通过悬浮MDCK(DHN)细胞连续传代驯化9代后得到了在细胞中稳定、高效复制的CN株细胞毒,并且该CN株细胞毒与CN株鸡胚毒在抗原性和免疫原性等生物学特性均保持了一致。本研究成功研制了可用于悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗生产的MDCK(DHN)悬浮细胞系和细胞毒种。 展开更多

关键词 MDCK细胞 无血清全悬浮培养 禽流感病毒 驯化

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人大细胞肺癌干细胞样细胞的富集及其功能研究 被引量：10

8

作者 月文科 焦锋 +2 位作者 刘彬 尤嘉琮 周清华 《中国肺癌杂志》 CAS 2011年第6期484-491,共8页

背景与目的目前国内外还没有确切的、得到公认的肺癌干细胞的筛选标记分子、指标和方法,常用方法为通过流式细胞技术,借鉴其他肿瘤干细胞分选标记来分选肺癌干细胞,但其筛选特异性低、工作量巨大。本研究采用无血清悬浮培养法富集肺癌... 背景与目的目前国内外还没有确切的、得到公认的肺癌干细胞的筛选标记分子、指标和方法,常用方法为通过流式细胞技术,借鉴其他肿瘤干细胞分选标记来分选肺癌干细胞,但其筛选特异性低、工作量巨大。本研究采用无血清悬浮培养法富集肺癌干细胞,对肺癌干细胞的筛选方法进行探索。方法采用添加生长因子的无血清培养基对人大细胞肺癌细胞株L9981进行悬浮培养,获得肺癌细胞球体。对含血清培养贴壁L9981细胞和无血清培养成球后的L9981细胞,通过显微镜下观察比较二者的生物学形态,应用Vi-cell细胞活力分析仪计数细胞并绘制生长曲线比较二者的增殖能力,通过Transwell实验研究它们的侵袭能力差异,并通过接种裸鼠观察二者在体内的成瘤性来研究肺癌细胞球体的生物学功能。结果与血清贴壁培养L9981细胞相比,无血清培养L9981细胞成球形生长,贴壁L9981和L9981球体细胞的倍增时间分别为(56.05±1.95)h和(33.00±1.44)h,球体细胞的侵袭和成瘤能力分别为贴壁L9981细胞的5倍和20倍。结论通过无血清悬浮培养的L9981细胞可以形成肺癌球体细胞群,L9981球体细胞的侵袭和成瘤能力均明显高于贴壁L9981细胞,显示L9981球体细胞中富集了肺癌干细胞样的细胞。无血清悬浮培养肺癌球体细胞可作为富集肺癌干细胞样细胞的一种候选方法。 展开更多

关键词 肺肿瘤 肺癌干细胞 无血清悬浮培养 肺癌球体细胞

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小鼠乳腺癌4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞的富集和鉴定 被引量：5

9

作者 王欣荣 单保恩 +5 位作者 艾军 刘丽华 刘月彩 张超 张海谱 刘登湘 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期381-385,共5页

目的：无血清培养基（serum-free medium,SFM）悬浮培养小鼠乳腺癌细胞株4T1,富集并鉴定4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞。方法：通过含EGF、bFGF和B27等细胞因子的SFM培养富集4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞,将其接种于含血清培养基（serum-su... 目的：无血清培养基（serum-free medium,SFM）悬浮培养小鼠乳腺癌细胞株4T1,富集并鉴定4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞。方法：通过含EGF、bFGF和B27等细胞因子的SFM培养富集4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞,将其接种于含血清培养基（serum-supplemented medium,SSM）,观察4T1肿瘤干细胞样细胞分化情况。应用细胞表面标志CD44^＋CD24^-/low和Hoechst33342染色法检测4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞的比例,小鼠致瘤实验验证不同培养条件下4T1肿瘤干细胞样细胞的致瘤能力。结果：4T1细胞在SFM中能够存活、增殖,并形成细胞球,细胞球可连续传代,若重新接种于SSM中可贴壁分化。4T1细胞球中CD44^＋CD24^-/low细胞比例为6.4%68.9%,侧群（side population,SP）细胞比例为7.3%61.2%,均显著高于SSM中培养的4T1细胞（P〈0.05）;随着SFM中细胞球传代次数增加,CD44^＋CD24^-/low细胞和SP细胞的比例逐渐升高。小鼠致瘤实验结果显示,富集了肿瘤干细胞的细胞球比常规培养4T1细胞的致瘤性更强。结论：乳腺癌4T1细胞可在含多种生长因子的SFM中悬浮生长并形成细胞球,4T1细胞中含有的乳腺癌干细胞样细胞可通过SFM培养法富集。 展开更多

关键词 无血清悬浮培养 乳腺癌4T1细胞 肿瘤干细胞 CD44^+CD24^-/low 侧群细胞

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卡铂短期诱导人卵巢癌类干细胞的分离及初步鉴定 被引量：4

10

作者 王宁 倪莎 周欣 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期713-719,共7页

目的分离卡铂耐药型人卵巢癌类干细胞,为研发和筛选针对卡铂耐药的卵巢癌二线治疗药物提供细胞模型。方法从卵巢癌组织或腹水中分离培养卵巢癌细胞,直接或采用卡铂短期诱导后无血清悬浮培养,分离纯化获得卵巢癌类干细胞球,采用免疫荧光... 目的分离卡铂耐药型人卵巢癌类干细胞,为研发和筛选针对卡铂耐药的卵巢癌二线治疗药物提供细胞模型。方法从卵巢癌组织或腹水中分离培养卵巢癌细胞,直接或采用卡铂短期诱导后无血清悬浮培养,分离纯化获得卵巢癌类干细胞球,采用免疫荧光法或流式细胞术检测干细胞标志物的表达。结果卵巢癌原代细胞直接或采用卡铂短期诱导后无血清悬浮培养能够形成类干细胞球,并高表达干细胞标记物CD133,ALDH1,ABCG2和CD24。卡铂短期诱导分离的卵巢癌干细胞球中CD24+细胞含量明显增加。结论原代培养卵巢癌细胞经卡铂短期诱导后无血清悬浮培养,能进一步富集纯化卵巢癌类干细胞,可作为卵巢癌耐药研究的理想细胞模型。 展开更多

关键词 卵巢癌 无血清悬浮培养 卵巢癌类干细胞球 卡铂

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肝肿瘤细胞干性与糖代谢特点的相关性研究 被引量：7

11

作者 李懿皞 戴谦 +2 位作者 王蓓丽 潘柏申 郭玮 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期773-779,共7页

背景与目的:肝细胞肝癌是致死率第三的恶性肿瘤,肿瘤干细胞则被认为是肿瘤复发的种子,而温伯格效应指肿瘤细胞有氧糖酵解的代谢特点。旨在探究肝肿瘤细胞干性与细胞糖代谢特点的相关性。方法:利用流式细胞术分选肝肿瘤细胞系Huh-7、MHCC... 背景与目的:肝细胞肝癌是致死率第三的恶性肿瘤,肿瘤干细胞则被认为是肿瘤复发的种子,而温伯格效应指肿瘤细胞有氧糖酵解的代谢特点。旨在探究肝肿瘤细胞干性与细胞糖代谢特点的相关性。方法:利用流式细胞术分选肝肿瘤细胞系Huh-7、MHCC97H中干性标志物高表达的肿瘤细胞进行无血清悬浮培养,观察其形态变化并对其干性标志物、糖代谢酶的表达进行检测,随后对这两种细胞的葡萄糖摄取能力、乳酸生成能力进行对比。结果:肝肿瘤干细胞在无血清悬浮培养的体系中成球,相比非干性的肿瘤细胞,成球细胞的糖酵解关键酶和干性标志物的表达有明显的升高(P<0.05),对葡萄糖的摄取能力及乳酸的生成能力也有明显的增强(P<0.05),肿瘤细胞的干性与其糖酵解的活跃程度有相关性。结论:无血清悬浮培养技术可用于富集肝肿瘤干细胞;相比非干性肿瘤细胞,肝肿瘤干细胞的糖酵解转化程度更高,肿瘤细胞的干性和肿瘤细胞的糖酵解有相关性。 展开更多

关键词 温伯格效应 肿瘤干细胞 无血清悬浮培养

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不同MDCK单克隆细胞株对H5亚型禽流感病毒增殖条件和放大工艺的研究 被引量：1

12

作者 方琳 朱辉 +3 位作者 黄皓源 彭思力 覃海康 梁昭平 《动物医学进展》 北大核心 2020年第4期38-41,共4页

为了解H5亚型禽流感病毒rFJ56株在MDCK全悬浮细胞上的增殖规律,确定100 L生物反应器工艺的最适接毒量和收获时间,对H5亚型禽流感病毒rFJ56株敏感的MDCK全悬浮细胞进行单克隆筛选和全悬浮驯化,筛选出对该毒株最敏感的MDCK单克隆细胞株;... 为了解H5亚型禽流感病毒rFJ56株在MDCK全悬浮细胞上的增殖规律,确定100 L生物反应器工艺的最适接毒量和收获时间,对H5亚型禽流感病毒rFJ56株敏感的MDCK全悬浮细胞进行单克隆筛选和全悬浮驯化,筛选出对该毒株最敏感的MDCK单克隆细胞株;在摇瓶工艺的基础上,将该细胞在100 L生物反应器中接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,检测接种后不同时间病毒HA效价和病毒滴度(EID 50),确定最适接毒量和收获时间。共筛选出22株MDCK全悬浮细胞单克隆细胞株,其中5株对H5亚型禽流感病毒rFJ56株最敏感,接种后病毒HA效价均可达到9 log2;对MDCK单克隆细胞株按0.01%体积比接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,在100 L生物反应器中培养60 h,HA效价可达10 log2,病毒含量可达108.17 EID 50/0.1 mL,可为H5亚型禽流感病毒无血清全悬浮培养放大工艺提供参考。 展开更多

关键词 H5亚型禽流感病毒 MDCK单克隆细胞株 无血清全悬浮培养 接毒量 收获时间

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