过表达果糖脱氢酶促进氧化葡萄糖酸杆菌高效合成5-酮果糖

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作者 钱雪 赵晨休 +1 位作者 林金萍 魏东芝 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期58-66,共9页

5-酮果糖(5-KetoFructose,5-KF)具有与D-果糖相似的甜度和自然甜味,且不能被人体代谢而具有低热量的优点,是一种具有发展前景的非营养型天然甜味剂。为了获得5-酮果糖高产菌株,作者将来源于Gluconobacter japonicus的膜结合的果糖脱氢... 5-酮果糖(5-KetoFructose,5-KF)具有与D-果糖相似的甜度和自然甜味,且不能被人体代谢而具有低热量的优点,是一种具有发展前景的非营养型天然甜味剂。为了获得5-酮果糖高产菌株,作者将来源于Gluconobacter japonicus的膜结合的果糖脱氢酶基因在Gluconobacter oxydans中过表达,通过对不同的宿主、表达载体和启动子的筛选,获得一株能够高效合成5-KF的工程菌QT-10。在3 L发酵罐中进行补料发酵优化,最终采用恒速连续流加果糖的方式,该工程菌可在82 h内消耗质量浓度为650 g/L的D-果糖,5-KF的产量高达608 g/L,产率为94.6%,时空产率为7.41 g/(L·h)。 展开更多

关键词 5-酮果糖 果糖脱氢酶 氧化葡萄糖酸杆菌 重组表达 发酵优化

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亮氨酸脱氢酶催化底物偶联法合成α-酮异己酸

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作者 丰险 穆晓清 +1 位作者 聂尧 徐岩 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2019年第4期698-704,共7页

构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系,打破氧化脱氨反应平衡,同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD^+的高效循环再生.基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数,考察了不同酮酸底物对于底物... 构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系,打破氧化脱氨反应平衡,同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD^+的高效循环再生.基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数,考察了不同酮酸底物对于底物偶联反应效率的影响,选择转化率最高的2-丁酮酸作为偶联底物,使α-KIC产率由单步氧化反应的2. 75%提高至66. 82%.通过考察底物浓度、pH值、NH_4^+浓度和辅酶NAD^+浓度等反应条件对偶联反应效率的影响,使α-KIC产率进一步提高至83. 25%,同时辅酶NAD^+的总转化数(TTN)达到5. 88×105.通过改变底物L-亮氨酸和2-丁酮酸的摩尔比,能够将α-KIC的产率进一步提高至92. 74%. 展开更多

关键词 亮氨酸脱氢酶 底物偶联 辅酶再生 α-酮异己酸 L-2-氨基丁酸

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睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达 被引量：5

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作者 张国华 徐国宾 +1 位作者 刘英民 夏铁安 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第6期966-969,共4页

从土壤中分离睾酮假单胞菌 ,提取其基因组DNA ,PCR扩增 3α 羟类固醇脱氢酶 (3α hsd)基因 ,将扩增产物用NdeⅠ /BamHⅠ消化 ,切下目的基因片段克隆到质粒 pET 15b中构建重组pET 15b .将重组 pET 15b转化入E .coliDH5α中 ,经酶谱分析... 从土壤中分离睾酮假单胞菌 ,提取其基因组DNA ,PCR扩增 3α 羟类固醇脱氢酶 (3α hsd)基因 ,将扩增产物用NdeⅠ /BamHⅠ消化 ,切下目的基因片段克隆到质粒 pET 15b中构建重组pET 15b .将重组 pET 15b转化入E .coliDH5α中 ,经酶谱分析和测序 ,鉴定出正确的重组质粒 pET 15b .将重组pET 15b转化入宿主菌E .coliBL2 1(DE3) pLysS中 ,用硫代半乳糖苷 (IPTG)进行诱导表达 .提取细菌总蛋白质进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分析并测定酶活性 .粗提物中酶活性高达 2 4 5× 10 5U/L .利用重组蛋白中的 6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析 ,经一步金属螯合亲和层析纯化后 ,重组蛋白在SDS PAGE上呈现出均一的单一条带 ,回收率达 6 8% .活性和纯度均较高的目的蛋白 3α HSD的获得 。 展开更多

关键词 睾酮假单胞菌 3α-羟类固醇脱氢酶基因 质粒载体 构建 表达 胆汁酸 血清

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烟曲霉Aspergillus Fumigatus 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆、异源表达和活性鉴定 被引量：2

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作者 陈苗苗 林良才 +2 位作者 马昱澍 王风清 魏东芝 《化学与生物工程》 CAS 2011年第7期29-34,共6页

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(A.fumigatus)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159... 微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(A.fumigatus)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159的kstD一致性为51%。构建pET28a(+)-kstDF表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(λDE3),获得高表达重组子菌株。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析,发现高温(37℃)有利于KstDF蛋白表达,低温(20℃)有利于酶活的保持。该重组菌显示出良好的甾体转化能力,在12 h内完全转化13.3 mg.L-1雄甾-4-烯-3,17-二酮,为构建高效转化3-酮基-4-烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。 展开更多

关键词 烟曲霉 烟曲霉酸 3-甾酮-Δ1-脱氢酶 雄甾-4-烯-3 17-二酮 雄甾-1 4-二烯-3 17-二酮

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粘质沙雷氏菌膜结合葡萄糖酸脱氢酶的分离纯化及其酶学特性 被引量：1

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作者 王贝贝 李昊聪 +4 位作者 孙文敬 崔凤杰 王大明 钱静亚 齐向辉 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第24期101-109,共9页

经超声破碎细胞、TritonX-114相分离、盐析、DEAE-sepharose离子交换层析和Hydroxyapatite吸附层析等步骤,从2-酮基葡萄糖酸(2-keogluconic acid,2KGA)生产菌株粘质沙雷氏菌JUIM03中获得比活力91.43 U/mg、纯化倍数160.4 倍的膜结合葡... 经超声破碎细胞、TritonX-114相分离、盐析、DEAE-sepharose离子交换层析和Hydroxyapatite吸附层析等步骤,从2-酮基葡萄糖酸(2-keogluconic acid,2KGA)生产菌株粘质沙雷氏菌JUIM03中获得比活力91.43 U/mg、纯化倍数160.4 倍的膜结合葡萄糖酸脱氢酶(gluconate dehydrogenase,GADH)。研究结果表明,粘质沙雷氏菌膜结合GADH由3 个亚基组成,其分子质量分别为65.0、45.0 kDa和23.0 kDa左右,是一种含有细胞色素C的黄素蛋白,能够催化氧化葡萄糖酸为2KGA。粘质沙雷氏菌膜结合GADH的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH 5.0,在30 ℃以下、pH 5.0~6.0的条件下较为稳定;该酶具有严格的底物特异性,只有在D-葡萄糖酸作为底物时才具有催化活性,其Km值为1.33 mmol/L;一些金属离子(如Fe3+、Cu2+ 和Zn2+ )、有机溶剂(乙醇、异丙醇、甲醇和丙酮)、变性剂(十二烷基硫酸钠和巯基乙醇)以及有机酸(草氨酸和草酸)对膜结合GADH的催化活性具有明显的抑制作用。研究为粘质沙雷氏菌2KGA生物合成的过程优化与控制提供了一定的理论依据。 展开更多

关键词 粘质沙雷氏菌 2-酮基葡萄糖酸 膜结合葡萄糖酸脱氢酶 分离纯化 酶学特性

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维生素C前体2-酮基-L-古龙酸二步混菌发酵研究新进展 被引量：2

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作者 吕淑霞 张云鹤 +2 位作者 白玲 张林 杨宇 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2015年第3期1-8,共8页

维生素C(Vc)二步混菌发酵是我国首创具有自主知识产权的唯一应用于工业化生产Vc的微生物转化方法,该方法利用混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体物质-2-酮基-L-古龙酸,再经化学转化合成Vc;具有简化工艺,减少污染,降低能耗等优点。本文主要从... 维生素C(Vc)二步混菌发酵是我国首创具有自主知识产权的唯一应用于工业化生产Vc的微生物转化方法,该方法利用混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体物质-2-酮基-L-古龙酸,再经化学转化合成Vc;具有简化工艺,减少污染,降低能耗等优点。本文主要从产酸菌代谢关键酶、伴生菌胞外物质、组学以及外源添加物等方面综述Vc二步混菌发酵的最新研究进展,并提出进一步研究和探索的方向。 展开更多

关键词 混菌发酵 伴生菌 普通生酮基古龙酸菌 L-山梨糖脱氢酶 2-酮基-L-古龙酸

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硫胺素对体外瘤胃发酵参数及支链脂肪酸合成的影响 被引量：2

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作者 郭鑫 姚瑞芬 +5 位作者 谭咏琪 沈旖帆 詹腾飞 温万 辛国省 卜登攀 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期5141-5151,共11页

本试验旨在通过体外法评估硫胺素对瘤胃发酵参数及支链脂肪酸(BCFA)合成的影响。试验分为6个组,每组5个重复,共发酵2批。各组均以0.5 g全混合日粮(TMR)作为发酵底物,并分别添加0(对照)、15、30、60、120、240 mg/kg DM硫胺素。体外39℃... 本试验旨在通过体外法评估硫胺素对瘤胃发酵参数及支链脂肪酸(BCFA)合成的影响。试验分为6个组,每组5个重复,共发酵2批。各组均以0.5 g全混合日粮(TMR)作为发酵底物,并分别添加0(对照)、15、30、60、120、240 mg/kg DM硫胺素。体外39℃恒温培养24 h后收集发酵液,测定瘤胃发酵参数、脂肪酸含量以及支链α酮酸脱氢酶(BCKD)活性。结果显示:1)30 mg/kg DM硫胺素组发酵液中总挥发性脂肪酸含量显著低于对照组和120、240 mg/kg DM硫胺素组(P<0.05),15、30 mg/kg DM硫胺素组发酵液中总支链挥发性脂肪酸含量显著低于对照组和120、240 mg/kg DM硫胺素组(P<0.05),15、30和60 mg/kg DM硫胺素组发酵液中微生物蛋白含量显著高于对照组和120、240 mg/kg DM硫胺素组(P<0.05)。2)60 mg/kg DM硫胺素组发酵液中饱和脂肪酸含量显著高于对照组和15、120、240 mg/kg DM硫胺素组(P<0.05),120和240 mg/kg DM硫胺素组发酵液中不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸含量显著高于30和60 mg/kg DM硫胺素组(P<0.05),60 mg/kg DM硫胺素组发酵液中总脂肪酸含量显著高于对照组和15 mg/kg DM硫胺素组(P<0.05)。3)30和60 mg/kg DM硫胺素组发酵液中异构支链脂肪酸(Iso)、反式异构支链脂肪酸(Anteiso)和BCFA含量显著高于对照组(P<0.05)。4)15、30、60、120 mg/kg DM硫胺素组发酵液中BCKD活性显著高于240 mg/kg DM硫胺素组(P<0.05)。5)相关性分析结果显示,发酵液中乙酸(r=-0.59)、丁酸(r=-0.61)、异戊酸(r=-0.54)、总挥发性脂肪酸(r=-0.57)含量与BCFA含量具有中等强度的负相关关系(P<0.05)。综上所述,体外条件下,硫胺素会影响瘤胃发酵特性和脂肪酸的合成,且挥发性脂肪酸含量与BCFA含量存在相关性。当硫胺素添加水平为60 mg/kg DM时,BCFA的合成效果最佳。 展开更多

关键词 硫胺素 支链脂肪酸 挥发性脂肪酸 支链α酮酸脱氢酶

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吐温-80对钝齿棒杆菌产L-赖氨酸的影响 被引量：2

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作者 赖木兰 万方 +1 位作者 朱蔷云 陈雪岚 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第23期173-177,共5页

对吐温-80提高L-赖氨酸产量的分子机制进行探究。以钝齿棒杆菌MT-M4Δpro B为出发菌株,在菌株生长至对数初期36 h时,添加5 mg/m L吐温-80进行摇瓶发酵,通过反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse translate?real-time?fluorescence?... 对吐温-80提高L-赖氨酸产量的分子机制进行探究。以钝齿棒杆菌MT-M4Δpro B为出发菌株,在菌株生长至对数初期36 h时,添加5 mg/m L吐温-80进行摇瓶发酵,通过反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse translate?real-time?fluorescence?quantitative?polymerase?chain?reaction,RT-q PCR)监控相关基因的转录水平、胞内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form,NADPH)水平及α-酮戊二酸脱氢酶复合物(α-oxoglutarate dehydrogenase complex,ODHC)的活力。摇瓶发酵结果表明,添加吐温-80使L-赖氨酸产量提高了215%;RT-q PCR结果表明,编码ODHC的基因odh A、suc B和lpd A、参与ODHC调控的基因pkn G、dts R和ppp以及合成NADPH的磷酸戊糖途径基因zwf的转录水平均发生了变化,其中odh A、suc B、lpd A、pkn G及dts R1基因分别发生了上调,ppp基因下调,相应ODHC活力提高了32.9%;zwf基因上调了17.6倍,相应胞内NADPH水平提高了137%。因此,在对数生长初期36 h添加吐温-80具有双重功效,既提高了ODHC的表达又使NADPH积累,从而诱导L-赖氨酸的高产。 展开更多

关键词 钝齿棒杆菌 吐温-80 L-赖氨酸 α-酮戊二酸脱氢酶复合物 NADPH

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支链氨基酸对不同负荷运动后丙氨酸—葡萄糖循环影响的研究 被引量：3

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作者 欧明毫 刘建红 +2 位作者 周志宏 王奎 石幼琪 《体育科学》 CSSCI 北大核心 2004年第6期19-21,共3页

采用实验法,探讨支链氨基酸(BCAA)对划船运动员不同负荷运动后丙氨酸--葡萄 糖循环的影响。结果表明,补充BCAA影响丙氨酸-葡萄糖循环代谢中酶的活性,促进运动中及 恢复期丙氨酸-葡萄糖循环,有利于糖的异生、提高运动耐力、延缓疲劳发生... 采用实验法,探讨支链氨基酸(BCAA)对划船运动员不同负荷运动后丙氨酸--葡萄 糖循环的影响。结果表明,补充BCAA影响丙氨酸-葡萄糖循环代谢中酶的活性,促进运动中及 恢复期丙氨酸-葡萄糖循环,有利于糖的异生、提高运动耐力、延缓疲劳发生和促进运动后疲劳 的消除。 展开更多

关键词 支链氨基酸 运动 负荷 丙氨酸-葡萄糖循环 乳酸脱氢酶 谷丙转氨酶 影响

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过表达PP2Cm减轻阿托伐他汀诱导的胰岛素抵抗

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作者 赵诗晗 唐才林 +3 位作者 陈宇 黄伟康 罗凤蓉 白雪 《中国药理学通报》 北大核心 2025年第7期1273-1282,共10页

目的探讨蛋白磷酸酶2Cm(protein phosphatase 2Cm,PP2Cm)特异性过表达对阿托伐他汀(atorvastatin)诱导胰岛素抵抗的潜在作用及相关机制。方法饲养♂C57BL/6J小鼠、成纤维细胞生长因子21敲除小鼠(FGF21-KO)和野生型(WT)小鼠12周后建模。... 目的探讨蛋白磷酸酶2Cm(protein phosphatase 2Cm,PP2Cm)特异性过表达对阿托伐他汀(atorvastatin)诱导胰岛素抵抗的潜在作用及相关机制。方法饲养♂C57BL/6J小鼠、成纤维细胞生长因子21敲除小鼠(FGF21-KO)和野生型(WT)小鼠12周后建模。分为Atorvastatin组、Control组、Atorvastatin+PP2Cm OE组、FGF21-KO+vehicle组、FGF21-KO+PP2Cm OE组、WT+vehicle组、WT+PP2Cm OE组。在第4、8、12周监测小鼠体质量、空腹血糖、空腹胰岛素,进行腹腔葡萄糖耐量实验;运用qRT-PCR、Western blot、ELISA法,测定阿托伐他汀治疗后小鼠细胞、组织和血清中支链氨基酸(branched-chain amino acid,BCAA)浓度,BCAA分解代谢酶mRNA及蛋白表达水平;探究过表达PP2Cm对上述指标的影响,并对变化最明显的FGF21进行体内外实验验证。结果阿托伐他汀治疗诱导小鼠胰岛素抵抗,影响胰岛素、耐糖水平,使BCAA水平升高,而过表达PP2Cm可减轻以上变化。在Atorvastatin+PP2Cm OE组中,FGF21的mRNA、蛋白、浓度表达均上调。无论PP2Cm是否过表达,敲除FGF21均使BCAA、空腹胰岛素和血糖水平高于WT组。结论FGF21可能是PP2Cm参与调控阿托伐他汀诱导胰岛素抵抗的关键因子,过表达PP2Cm可通过调节FGF21减轻该抵抗。 展开更多

关键词 阿托伐他汀 胰岛素抵抗 支链氨基酸 蛋白磷酸酶2Cm 成纤维细胞生长因子21 支链-酮酸脱氢酶

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杂合子亲属活体肝移植治疗儿童BCKDHB基因新复合突变枫糖尿病1例并文献复习 被引量：2

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作者 吴越 顾广祥 夏强 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期588-594,共7页

目的总结枫糖尿病的杂合子亲属活体肝移植治疗效果。方法1例男性3岁患儿,因发现枫糖尿病半年于2017年7月5日入院。患儿空腹状态出现阵发性口齿不清、下肢运动功能障碍半年,枫糖样体味明显,语言发育稍迟缓,无其他生长发育异常和智力缺陷... 目的总结枫糖尿病的杂合子亲属活体肝移植治疗效果。方法1例男性3岁患儿,因发现枫糖尿病半年于2017年7月5日入院。患儿空腹状态出现阵发性口齿不清、下肢运动功能障碍半年,枫糖样体味明显,语言发育稍迟缓,无其他生长发育异常和智力缺陷。血清支链氨基酸(BCAA)检查示亮氨酸684μmol/L,缬氨酸559μmol/L,经基因检测结合BCAA检查诊断为枫糖尿病Ⅰb型。行亲属活体肝移植,供者为患儿父亲。术后常规应用免疫抑制、抗病毒、抗感染方案及维持水、电解质、酸碱平衡等必要营养支持。他克莫司剂量根据生化指标和受者细胞色素P450(CYP)3A5基因型进行调整。糖皮质激素于术后6个月左右停用。结果受者肝功能于术后1个月恢复至正常范围,术后3年基本趋于稳定。受者氨基酸水平术后即降至正常,术后正常饮食1个月BCAA继续降低。截止至投稿日,受者生长发育良好,情况稳定,生活质量高。结论突变杂合子亲属活体肝移植治疗枫糖尿病安全有效,降低了突发急性代谢事件的可能性,极大地改善了受者的生活质量,为枫糖尿病的外科治疗提供了新思路。 展开更多

关键词 枫糖尿病 活体器官捐献 杂合子 肝移植 支链α-酮酸脱氢酶(bckdh) 支链氨基酸(BCAA) 基因突变 急性代谢事件

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VC混菌发酵中大菌不同胞外组分对小菌的影响 被引量：7

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作者 吕淑霞 牛建双 +3 位作者 马镝 张良 陈宏权 张忠泽 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期700-704,共5页

在维生素C(VC)二步混菌发酵中,巨大芽孢杆菌可显著促进氧化葡萄糖酸杆菌产VC前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。采用硫酸铵分级盐析沉淀、柱层析及电泳技术对巨大芽孢杆菌胞外液中的活性物质进行了分离纯化。通过测定氧化葡萄糖酸杆菌生长细... 在维生素C(VC)二步混菌发酵中,巨大芽孢杆菌可显著促进氧化葡萄糖酸杆菌产VC前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。采用硫酸铵分级盐析沉淀、柱层析及电泳技术对巨大芽孢杆菌胞外液中的活性物质进行了分离纯化。通过测定氧化葡萄糖酸杆菌生长细胞转化L-山梨糖为2-KLG的生成量、产酸菌关键酶L-山梨糖脱氢酶(SDH)酶活性及产酸菌的活菌数,研究了VC两步发酵中大菌不同胞外组分对小菌的作用。结果表明:大菌胞外36 000和44 300两个组分蛋白质对小菌产酸、SDH酶活具有促进作用。 展开更多

关键词 氧化葡萄糖酸杆菌 巨大芽孢杆菌 2-酮基-L-古龙酸 L山-梨糖脱氢酶

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