通过PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)囊膜蛋白p74基因膜外区片段,对切胶纯化得到的DNA目的片段与原核表达载体pET28a进行连接,通过不同浓度的IPTG对含有pET28a-p74重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行...通过PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)囊膜蛋白p74基因膜外区片段,对切胶纯化得到的DNA目的片段与原核表达载体pET28a进行连接,通过不同浓度的IPTG对含有pET28a-p74重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE电泳。结果表明p74基因膜外区获得了表达;通过His单抗对原核表达产物进行Western blotting分析,其结果证实诱导蛋白带为融合有组氨酸的目的蛋白。对割胶获得的P74蛋白和免疫佐剂进行充分研磨,以研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,通过收获的抗血清对BmNPV ODV病毒粒子进行West-ern blotting分析,检测到一条分子量大小为74 kD的特异杂交带,表明获得的多抗可用于P74蛋白功能的进一步研究。展开更多
Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-eg...Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-egfp,并分别转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,研究Bm59基因在病毒侵染、增殖和组装中的功能。对病毒滴度的检测结果表明3种类型病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值均显著低于其他2种类型病毒(P<0.05)。电子显微镜下观察Bm59ko-Bacmid-polh-egfp转染的细胞中只有少量细长的杆状病毒粒子,而其他2种类型病毒转染细胞后则能产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qRT-PCR检测结果显示,Bm59缺失型病毒基因组DNA的复制能力显著降低(P<0.05),早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著低于野生型病毒(P<0.05)。综上所述,Bm59基因虽然是家蚕核型多角体病毒复制的非必需基因,但会显著影响病毒的增殖速度和病毒粒子的组装,对病毒各个时期的基因转录水平具有下调作用。展开更多
为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)基因orf98的功能,通过λRed重组系统定点敲除BmNPVorf98基因,构建缺失型重组病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系统补回BmNPVorf98基因,构建补回型重组病毒Bm98-re-B...为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)基因orf98的功能,通过λRed重组系统定点敲除BmNPVorf98基因,构建缺失型重组病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系统补回BmNPVorf98基因,构建补回型重组病毒Bm98-re-Bacmid;将野生型病毒(wtBacmid)、缺失型病毒(Bm98-koBacmid)和补回型病毒(Bm98-re-Bacmid)分别转染家蚕细胞BmN。病毒滴度检测结果显示,Bm98-ko-Bacmid可形成侵染性的病毒粒子,但数量显著降低(P<0.05).透射电子显微镜观察发现,Bm98-ko-Bacmid只产生游离的杆状病毒粒子,数量明显减少,而wtBacmid和Bm98-re-Bacmid产生大量具有囊膜结构的成熟病毒粒子。荧光定量聚合酶链反应分析结果表明,BmNPVorf98基因缺失对BmNPV病毒复制没有影响,而早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著降低(P<0.05)。综上所述,BmNPVorf98基因对病毒复制是非必需的,但显著影响病毒的繁殖速度和包装(P<0.05);对病毒各个时期的基因转录也具有重要影响。展开更多
家蚕中肠上皮是病毒经口侵入遇到的第一个组织。昆虫幼虫抵御杆状病毒的感染,可通过选择性的使感染的中肠上皮细胞发生调亡并在释放病毒粒子进入血淋巴之前使感染的细胞从中肠脱落。为研究家蚕抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopoled...家蚕中肠上皮是病毒经口侵入遇到的第一个组织。昆虫幼虫抵御杆状病毒的感染,可通过选择性的使感染的中肠上皮细胞发生调亡并在释放病毒粒子进入血淋巴之前使感染的细胞从中肠脱落。为研究家蚕抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopoledrovirus,BmNPV)病的机制,通过对BmNPV高度抗性和高度敏感性的家蚕品系杂交和回交构建了近等基因系。本文对家蚕高抗,敏感及近等基因系5龄起蚕中肠组织的蛋白质表达谱进行了二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分析,并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight,MALDI-TOF)质谱对差异蛋白进行鉴定。结果发现了5个差异表达的蛋白。推测这些蛋白可能与家蚕中肠对BmNPV的抗性或感性有关。展开更多
基于DNA载体的RNA i技术可以较长时间高效地抑制基因的活性。利用家蚕核型多角体病毒ie-1基因启动子,构建了在细胞内能转录形成与ie-1基因+19^+446区域互补同源的发夹状dsRNA的RNA i DNA载体。研究结果表明,该载体DNA在体外、体内均能...基于DNA载体的RNA i技术可以较长时间高效地抑制基因的活性。利用家蚕核型多角体病毒ie-1基因启动子,构建了在细胞内能转录形成与ie-1基因+19^+446区域互补同源的发夹状dsRNA的RNA i DNA载体。研究结果表明,该载体DNA在体外、体内均能较好地抑制家蚕核型多角体病毒在细胞中的复制。展开更多
文摘为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)基因orf98的功能,通过λRed重组系统定点敲除BmNPVorf98基因,构建缺失型重组病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系统补回BmNPVorf98基因,构建补回型重组病毒Bm98-re-Bacmid;将野生型病毒(wtBacmid)、缺失型病毒(Bm98-koBacmid)和补回型病毒(Bm98-re-Bacmid)分别转染家蚕细胞BmN。病毒滴度检测结果显示,Bm98-ko-Bacmid可形成侵染性的病毒粒子,但数量显著降低(P<0.05).透射电子显微镜观察发现,Bm98-ko-Bacmid只产生游离的杆状病毒粒子,数量明显减少,而wtBacmid和Bm98-re-Bacmid产生大量具有囊膜结构的成熟病毒粒子。荧光定量聚合酶链反应分析结果表明,BmNPVorf98基因缺失对BmNPV病毒复制没有影响,而早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著降低(P<0.05)。综上所述,BmNPVorf98基因对病毒复制是非必需的,但显著影响病毒的繁殖速度和包装(P<0.05);对病毒各个时期的基因转录也具有重要影响。
文摘家蚕中肠上皮是病毒经口侵入遇到的第一个组织。昆虫幼虫抵御杆状病毒的感染,可通过选择性的使感染的中肠上皮细胞发生调亡并在释放病毒粒子进入血淋巴之前使感染的细胞从中肠脱落。为研究家蚕抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopoledrovirus,BmNPV)病的机制,通过对BmNPV高度抗性和高度敏感性的家蚕品系杂交和回交构建了近等基因系。本文对家蚕高抗,敏感及近等基因系5龄起蚕中肠组织的蛋白质表达谱进行了二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分析,并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight,MALDI-TOF)质谱对差异蛋白进行鉴定。结果发现了5个差异表达的蛋白。推测这些蛋白可能与家蚕中肠对BmNPV的抗性或感性有关。
文摘基于DNA载体的RNA i技术可以较长时间高效地抑制基因的活性。利用家蚕核型多角体病毒ie-1基因启动子,构建了在细胞内能转录形成与ie-1基因+19^+446区域互补同源的发夹状dsRNA的RNA i DNA载体。研究结果表明,该载体DNA在体外、体内均能较好地抑制家蚕核型多角体病毒在细胞中的复制。
