以霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列作为靶序列设计引物,合成分子信标探针;以黑曲霉菌ATCC(16404)DNA为模板,通过PCR、分子克隆、转录构建靶标RNA,进而建立实时荧光核酸恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing,SAT),并对体系内...以霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列作为靶序列设计引物,合成分子信标探针;以黑曲霉菌ATCC(16404)DNA为模板,通过PCR、分子克隆、转录构建靶标RNA,进而建立实时荧光核酸恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing,SAT),并对体系内相应成分进行优化;最后利用优化的SAT体系检测食品污染中常见的病原微生物,评价SAT方法的特异性;针对不同浓度的黑曲霉菌孢子悬液,提取RNA进行SAT检测,评价SAT方法的灵敏性。结果表明,SAT检测体系中引物浓度为10μmol·L^-1及探针浓度为10μmol·L^-1时,反应曲线最佳;扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与培养的黑曲霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-7.061x+59.567,R^2=0.961 1),该方法的灵敏度为10^3个·mL^-1孢子,用该方法检测食品中常见污染菌,发现仅黑曲霉菌出现荧光信号。初步建立了黑曲霉菌的SAT检测体系,可与食品常见污染细菌相鉴别,特异性达100%,进一步提高灵敏度后,可成为食品中黑曲霉菌检测的新方法。展开更多
目的:建立一种用于单核细胞增生李斯特菌的实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计引物对,基于荧光定量聚合酶链式反应(polym...目的:建立一种用于单核细胞增生李斯特菌的实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计引物对,基于荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪的平台,提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA,以此作为模板,优化反应温度、反应时间及引物浓度。利用单核细胞增生李斯特菌及10株对照菌株,并与实时荧光PCR对比,来验证实时荧光HDA方法的特异性和灵敏度,并初步用于样品检测。结果:实时荧光HDA体系的最适引物浓度为0.075μmol/L,反应温度及反应时间为65℃、80 min(40个循环),具有良好的特异性和灵敏度。结论:建立了一种特异性强、灵敏度高的实时荧光HDA检测单核细胞增生李斯特菌的方法。展开更多
文摘以霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列作为靶序列设计引物,合成分子信标探针;以黑曲霉菌ATCC(16404)DNA为模板,通过PCR、分子克隆、转录构建靶标RNA,进而建立实时荧光核酸恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing,SAT),并对体系内相应成分进行优化;最后利用优化的SAT体系检测食品污染中常见的病原微生物,评价SAT方法的特异性;针对不同浓度的黑曲霉菌孢子悬液,提取RNA进行SAT检测,评价SAT方法的灵敏性。结果表明,SAT检测体系中引物浓度为10μmol·L^-1及探针浓度为10μmol·L^-1时,反应曲线最佳;扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与培养的黑曲霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-7.061x+59.567,R^2=0.961 1),该方法的灵敏度为10^3个·mL^-1孢子,用该方法检测食品中常见污染菌,发现仅黑曲霉菌出现荧光信号。初步建立了黑曲霉菌的SAT检测体系,可与食品常见污染细菌相鉴别,特异性达100%,进一步提高灵敏度后,可成为食品中黑曲霉菌检测的新方法。
