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小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：14
1
作者 赵文华 杨仕标 +1 位作者 高华峰 王金萍 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第3期65-71,共7页
为实现山羊2种疫病病原体——小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于PPRV的N基因及GTPV的ITR基因,分别设计合成2套特异性引物及探针;探针分别用5′FAM-TAMRA3′及5′JOE-Eclipse3′标记物进行标记以实现同步检测... 为实现山羊2种疫病病原体——小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于PPRV的N基因及GTPV的ITR基因,分别设计合成2套特异性引物及探针;探针分别用5′FAM-TAMRA3′及5′JOE-Eclipse3′标记物进行标记以实现同步检测。试验结果显示,所建立的N-ITR二联探针实时荧光定量RT-PCR方法可同步检测PPRV和GTPV,产生特异性荧光信号,而对禽痘病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)等相关病毒无荧光信号检出。以PPRV-N和GTPVITR的pMD18-T载体质粒为标准品,构建了二联标准曲线,N-ITR探针对PPRV和GTPV的检测敏感度可分别达102和103拷贝/μL。本研究初步建立了可同步快速特异性检测PPRV和GTPV的二联实时荧光定量RT-PCR方法。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 山羊痘病毒 二联实时荧光定量rt—pcr 探针
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荧光实时定量RT-PCR检测DD3mRNA方法的建立 被引量：3
2
作者 毛晓露 陶志华 +6 位作者 陈晓东 陈占国 林晓梅 王瑜敏 朱燕英 温秀姝 余凯远 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期335-337,共3页
目的建立荧光实时定量RT—PCR（FQ—RT—PCR）检测前列腺癌（PCa）特异基因DD3mRNA的方法。方法在DD3基因的外显子1和3之间设计一对引物和一条TaqMan—MGB探针，优化反应体系，建立DD3mRNA的FQ—RT—PCR方法，并进行方法学评价。将PCR... 目的建立荧光实时定量RT—PCR（FQ—RT—PCR）检测前列腺癌（PCa）特异基因DD3mRNA的方法。方法在DD3基因的外显子1和3之间设计一对引物和一条TaqMan—MGB探针，优化反应体系，建立DD3mRNA的FQ—RT—PCR方法，并进行方法学评价。将PCR扩增产物经凝胶电泳纯化后与pBluescript Ⅱ SK载体连接，再将重组质粒转化感受态细胞进行克隆；提取重组质粒在紫外分光光度计上定量，作为定量检测的标准品。结果重组质粒经PCR扩增及序列测定，表明pBluescriptⅡSK—DD3cDNA克隆成功。PCR扩增产物经测序分析证实为DD3 mRNA特异性片段。本法灵敏度为6拷贝／反应，线性范围为6～6×10^8拷贝／反应，相关系数为0．9985，批内、批间变异系数分别为1.0％～2.0％和1、3％～6、6％。结论成功建立了FQ—RT—PCR检测DD3mRNA的方法。为DD3 mRNA作为前列腺癌的诊断指标提供了方法学依据，也为其他肿瘤基因的检测提供了方法学启示。 展开更多
关键词 DD3基因 MRNA 实时荧光定量rt—pcr 前列腺癌
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鸭IFN-γ mRNA实时荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：7
3
作者 谢秀兰 汤承 +1 位作者 杨发龙 岳华 《动物医学进展》 CSCD 2008年第5期17-20,共4页
为建立检测鸭IFN-γ mRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法，根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green Ⅰ染料，建立检测鸭IFN-γ mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法（real-time RT-PCR）。试验以PCR产... 为建立检测鸭IFN-γ mRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法，根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green Ⅰ染料，建立检测鸭IFN-γ mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法（real-time RT-PCR）。试验以PCR产物为标准品，建立标准曲线，随后进行熔解曲线分析和稳定性研究。结果Ct值线性范围为12．0～33．0，相关系数为0．997；熔解曲线显示产物为单特异峰，Tm为82．5±0℃；组内变异系数（CV％）为4．26％；纽间试验无显著差异（P〉0．05）。建立的检测鸭IFN-γ mRNA的Real—time RT—PCR方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。 展开更多
关键词 鸭 Γ干扰素 实时荧光定量rt—pcr SYBR Green Ⅰ
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马铃薯病毒病实时荧光定量PCR检测技术
4
作者 杨茹薇 刘易 +2 位作者 古丽米拉·热合木土拉 孙慧 江应红 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期2484-2490,共7页
【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV... 【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)的检测引物,完成引物浓度及系统优化。【结果】建立3种马铃薯病毒病的实时荧光定量PCR检测技术体系(real-time fluorescent quantitative RT-PCR,RT-qPCR),其标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为99.42%以上,扩增效率均为84.48%以上,可快速、准确检测出3种马铃薯病毒。【结论】实时荧光定量PCR检测技术是一种高灵敏度、特异性强的检测方法,可实时监测马铃薯生产中病毒病的感染情况。 展开更多
关键词 马铃薯 病毒病 实时荧光定量pcr
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鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
5
作者 张玉霞 董雯雯 +2 位作者 袁小远 孟凯 徐怀英 《山东农业科学》 北大核心 2024年第6期128-132,共5页
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基... 鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 鸡喉气管炎病毒 TK基因 实时荧光定量pcr 特异性 敏感性 重复性
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低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价
6
作者 林珲 裘波音 +1 位作者 朱海生 温庆放 《福建农业科技》 CAS 2024年第8期1-15,共15页
为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差... 为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。 展开更多
关键词 茄子 内参基因 实时荧光定量pcr 标准化 基因表达
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牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用 被引量：6
7
作者 王荣 李文文 +3 位作者 王研 刘亚刚 余琼 任永刚 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第2期35-39,共5页
持续性感染和免疫耐受是牛病毒性腹泻病的重要特征,这一特征给该病的诊断、检疫及防控造成很大困难,为此,建立快速实用、高效敏感的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)检测方法具有重要意义。据GenBank中登录的BVDV 5... 持续性感染和免疫耐受是牛病毒性腹泻病的重要特征,这一特征给该病的诊断、检疫及防控造成很大困难,为此,建立快速实用、高效敏感的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)检测方法具有重要意义。据GenBank中登录的BVDV 5′UTR保守区域设计并合成1对特异性引物,以SYBR GreenⅠ染料为扩增指示剂,建立了BVDV实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异、重复性好等优点。该方法的建立为牛病毒性腹泻病的早期快速诊断和有效检出持续性感染动物提供了手段,是该病检疫和诊断方法的补充和完善。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 实时荧光定量rt—pcr 5′UTR 检测方法
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鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：3
8
作者 孔刚锐 吴志明 +7 位作者 闫若潜 赵明军 王东方 赵雪丽 闫志玲 程俊贞 陈慧娟 靳利粉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第12期27-33,共7页
据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV)的非结构蛋白2(Nsp2)基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条... 据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV)的非结构蛋白2(Nsp2)基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescent quantitative RTPCR)检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LPPRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达101拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。 展开更多
关键词 高 低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重实时荧光定量rt—pcr TAQMAN MGB荧光探针 检测 应用
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猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用 被引量：4
9
作者 刘莹 李峰 +3 位作者 殷宗俊 王敬茹 李书光 郑先瑞 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期34-38,共5页
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方... 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 Taq Man探针 实时荧光定量pcr
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氟胁迫条件下茶树叶部实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证 被引量：1
10
作者 李庆会 李睿 +3 位作者 温晓菊 倪德江 王明乐 陈玉琼 《茶叶科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期27-36,共10页
为了筛选氟胁迫条件下茶树(Camellia sinensis)叶部用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析的内参基因,以课题组前期筛选的低氟茶树品种福鼎大白茶和高氟茶树品种金观音为试验材料,利用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件,... 为了筛选氟胁迫条件下茶树(Camellia sinensis)叶部用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析的内参基因,以课题组前期筛选的低氟茶树品种福鼎大白茶和高氟茶树品种金观音为试验材料,利用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件,分析氟胁迫条件下(0.42 mmol·L^(-1)NaF)8个候选内参基因(CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC)在茶树不同叶位(新梢和老叶)、不同胁迫时间(0、1、3、7 d)的表达稳定性。结果显示,在氟胁迫条件下,茶树新梢中最优内参基因组合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN,老叶中最优内参基因组合是CsPP2A和CsUBC。利用筛选得到的最优内参基因组合分析氟输出蛋白基因(CsFEX)的表达情况,发现CsFEX在两个茶树品种的新梢和老叶中的表达趋势一致,说明筛选的内参组合可用于氟胁迫条件下茶树新梢和老叶中目的基因的检测。 展开更多
关键词 茶树 氟 内参基因 实时荧光定量pcr 基因表达
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PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：2
11
作者 李欣 杨莉 +4 位作者 刘光亮 王文秀 刘海隆 曹宗喜 张艳 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期7-14,共8页
为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Ma... 为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Man探针,并进行反应体系优化,敏感性、特异性验证,建立了同时检测上述4种病原的四重实时荧光定量PCR。结果显示,所建立的四重荧光PCR扩增效率(E)、相关系数(R^(2))及曲线斜率均在正常范围内,检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2 E值、R^(2)、斜率分别为92.9%、0.998、-3.504,90.7%、0.998、-3.566,94.3%、0.996、-3.466,94.2%、0.997及-3.470。PRRSV、CSFV、PRV、PCV2重组质粒最低检出限分别达到10^(2)、10^(2)、10^(2)、10^(3) copies/μL;四重qPCR反应体系中的多条引物间不发生交叉反应,经评价该方法特异性良好;批内和批间重复性试验结果显示,变异系数(CV)均在1%以下,具有良好的重复性。分别使用该方法和相应的国标荧光定量检测法对采集的298份临床样品进行检测对比,两种方法检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2阳性符合率分别为96.08%、96.38%、100%、94.95%,均在94%以上。结果表明,建立的检测方法方便、灵敏、高效、特异性强,适用于猪呼吸道疾病病原学、流行病学研究以及临床病例的诊断,并为猪呼吸道疾病的预防和控制提供技术支撑。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 猪伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 四重实时荧光定量pcr
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牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：22
12
作者 范晴 谢芝勋 +5 位作者 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基 彭宜 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第10期10-14,共5页
根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′端非编码区核苷酸序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BVDV的实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法只能检测到BVDV,而与CSFV、BRV、MT及IBRV没有交叉反应,具有高度的特异性,在1010~102... 根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′端非编码区核苷酸序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BVDV的实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法只能检测到BVDV,而与CSFV、BRV、MT及IBRV没有交叉反应,具有高度的特异性,在1010~102模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.991,最低可检测到100个拷贝的阳性质粒。所建立的BVDV实时荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、灵敏等特点。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 实时荧光定量pcr 检测
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血清3型鸭甲型肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用 被引量：5
13
作者 孙庆歌 薛霜 +7 位作者 肖爱芳 马慧慧 朱薇 漆世华 温文生 舒银辉 谢红玲 苏敬良 《中国兽药杂志》 2013年第4期1-5,共5页
通过对GenBank公布的鸭甲型肝炎病毒全序列比对,在3型鸭甲肝炎病毒(DHVA-3)5’非编码区的保守区,设计了一对检测引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的阳性重组质粒经体外转录合成的RNA作为标准品绘制标准曲线,建立了一种快速检测DHAV-3... 通过对GenBank公布的鸭甲型肝炎病毒全序列比对,在3型鸭甲肝炎病毒(DHVA-3)5’非编码区的保守区,设计了一对检测引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的阳性重组质粒经体外转录合成的RNA作为标准品绘制标准曲线,建立了一种快速检测DHAV-3的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法能特异性地检测出DHAV-3,而与血清1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒(H9)、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒无交叉反应。在1.8×103～1.8×108copies/μL的检测范围内标准曲线线性关系较好,R2为0.992。敏感性试验表明,最低检测限为36拷贝数RNA。用该方法和胚半数致死量法对尿囊液中病毒含量进行检测,表明二种方法检测结果呈正相关。本研究所建立的检测方法特异性好,灵敏度高,且操作方便,可为该病毒的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。 展开更多
关键词 血清3型鸭甲型肝炎病毒 实时荧光定量rt—pcr
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猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：11
14
作者 张太翔 凌宗帅 +5 位作者 岳志芹 徐彪 梁成珠 刘文鹏 张焕海 张艺兵 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第6期181-184,共4页
本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0... 本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0×102拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。 展开更多
关键词 猪流感病毒 实时荧光定量pcr TAQMAN探针
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采用实时荧光定量PCR法检测大曲中的3种高温放线菌
15
作者 陈政 柴丽娟 +7 位作者 张晓娟 许泓瑜 史劲松 王松涛 张宿义 沈才洪 许正宏 陆震鸣 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第18期300-308,共9页
建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)方法对大曲中3种高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris、T.intermedius和T.daqus)进行特异性定量检测。根据T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus全基因组中特... 建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)方法对大曲中3种高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris、T.intermedius和T.daqus)进行特异性定量检测。根据T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus全基因组中特异性单拷贝核心基因recA、mdH、gyrA为参考序列分别设计了一对可扩增278、233、291 bp片段的引物;经特异性、有效性、准确性实验显示,在常见的13种白酒酿造微生物中,引物TV、TI、TD分别可特异性检测T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus,检测范围为2.82~8.82 lg copies/μL,加标回收率95%~105%。进一步对大曲发酵过程样品检测,结果显示,T.vulgaris含量在呈现波动趋势,在第5天达到最高,为(6.06±0.02)lg copies/g;T.intermedius含量呈现先上升后下降的趋势,在第7天达到最高,为(6.33±0.13)lg copies/g;T.daqus含量在0~12 d呈现波动趋势,在12~14 d下降,随后一直上升,发酵结束时含量最高,为(7.62±0.02)lg copies/g。该研究建立的RT-qPCR方法可对大曲发酵过程中3种高温放线菌进行特异性鉴定和快速定量,为进一步监测高温放线菌在白酒酿造过程中的功能提供了方法。 展开更多
关键词 大曲 高温放线菌 特异性引物 实时荧光定量pcr
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西番莲中夜来香花叶病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
16
作者 顾佩佩 王莹 +2 位作者 杨之巽 韩俊娜 黄爱军 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期195-202,共8页
夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物,建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物,退火温度54℃,引物浓度0.6μmol/L的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法... 夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物,建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物,退火温度54℃,引物浓度0.6μmol/L的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性扩增TeMV基因组6 483~6 675 nt区域,所得标准曲线扩增效率为10^(2).77%,决定系数为0.996 1,最低检测浓度为2.370×10^(2)拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的1 000倍。应用该方法对接种TeMV的西番莲进行检测,发现接种3 d后可在叶片中检测到TeMV,定量分析不同温度下TeMV在叶片中的积累,发现26~28℃下病毒积累速度最快,且植株症状表现与病毒积累量密切相关。对赣南地区采集的76份西番莲田间样品进行检测,共检出71份阳性样品,检出率为93.4%。综上,本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强,灵敏度高,适于TeMV的快速检测。 展开更多
关键词 夜来香花叶病毒 西番莲 实时荧光定量pcr
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实时荧光定量PCR技术在食品检测中的应用进展 被引量：1
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作者 任瑞娟 《中国食品》 2024年第18期79-81,共3页
“民以食为天,食以安为先”。近年来,食品安全事件时有发生,泰国假香米、阿斯巴甜致癌疑云、“鼠头鸭脖”等事件不断被曝光,公众对食品安全的关注度日益提高。为了保障食品安全,监管部门加强了对食品检测技术的研发和应用。在各种检测... “民以食为天,食以安为先”。近年来,食品安全事件时有发生,泰国假香米、阿斯巴甜致癌疑云、“鼠头鸭脖”等事件不断被曝光,公众对食品安全的关注度日益提高。为了保障食品安全,监管部门加强了对食品检测技术的研发和应用。在各种检测技术中,PCR技术尤其是实时荧光定量PCR,因具有更灵敏、更省时、更特异等优点,在食品安全检测领域得到了广泛应用。本文综述了实时荧光定量PCR技术的原理,及其在食品中植物源性成分、转基因成分、过敏原、动物源成分和微生物等检测中的应用进展,并对该技术未来的发展方向进行了展望,以期该技术未来在食品检测领域得到更广泛的应用。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr技术 食品检测 阿斯巴甜 食品安全检测 转基因成分 食品安全事件 过敏原 香米
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印楝素胁迫下草地贪夜蛾幼虫实时荧光定量PCR内参基因表达稳定性评价
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作者 舒本水 黄玉婷 +4 位作者 余萱悦 刘翠婷 谢心怡 沈皓 林进添 《广东农业科学》 CAS 2024年第8期21-30,共10页
【目的】选择合适的内参基因对实时荧光定量PCR技术结果的准确性具有重要意义。通过评估印楝素胁迫下草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda J.E Smith)幼虫候选内参基因在不同样品中的表达稳定性,确定最适内参基因,为后续靶标基因功能分析... 【目的】选择合适的内参基因对实时荧光定量PCR技术结果的准确性具有重要意义。通过评估印楝素胁迫下草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda J.E Smith)幼虫候选内参基因在不同样品中的表达稳定性,确定最适内参基因,为后续靶标基因功能分析和印楝素分子毒理机制解析提供基础。【方法】选取草地贪夜蛾α-TUB、β-1-TUB、Actin、EF1α、EF2、GAPDH、RPL3和RPL138个候选内参基因,通过ΔCt、GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件对印楝素胁迫下各候选内参基因在草地贪夜蛾幼虫整虫、表皮、中肠、脂肪体和马氏管样品中转录水平表达量的稳定性进行评估,采用GeNorm软件确定最适内参基因数目,最终确定印楝素胁迫下不同样品中最适内参基因组合。【结果】印楝素胁迫下草地贪夜蛾幼虫样品中,ΔCt和Normfinder分析发现α-TUB和β-1-TUB的表达稳定性最高,GeNorm分析发现RPL3和RPL13的表达稳定性最高,BestKeeper分析则是α-TUB和RPL13表达稳定性最高。表皮样品中,β-1-TUB和α-TUB在ΔCt、GeNorm和Normfinder中表达稳定性最高,Actin和β-1-TUB在BestKeeper评估中最稳定。在中肠组织中,ΔCt分析发现EF2和β-1-TUB表达最稳定,GeNorm发现EF1α和RPL3表达最稳定,Normfinder分析发现EF2和β-1-TUB表达最稳定,BestKeeper分析发现RPL13和RPL3表达最稳定。在脂肪体组织中,ΔCt、GeNorm和Normfinder分析下RPL3和EF1α表达稳定性最高,BestKeeper分析则认为RPL13和RPL3稳定性最高。在马氏管组织中,ΔCt分析发现RPL3和EF2表达最稳定,GeNorm评估EF1α和EF2表达最稳定,Normfinder分析发现β-1-TUB和EF2表达最稳定,BestKeeper分析发现RPL13和β-1-TUB表达最稳定。此外,GeNorm软件分析发现各样品中最适内参基因数目均为2个。RefFinder综合分析结果为,α-TUB和β-1-TUB在幼虫和表皮组织样品中表达稳定性最高;EF2和RPL3在幼虫中肠和马氏管组织样品中表达稳定性最高;RPL3和EF1α在脂肪体组织样品中表达稳定性最高。【结论】印楝素胁迫下草地贪夜蛾幼虫和表皮中最适内参基因组合为α-TUB和β-1-TUB;幼虫中肠和马氏管组织样品中最适内参基因组合为EF2和RPL3;脂肪体组织样品中最适内参基因组合为RPL3和EF1α。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 草地贪夜蛾 印楝素 内参基因 表达稳定性
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猪传染性胃肠炎病毒S基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测 被引量：3
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作者 张云 王亚宾 +4 位作者 陈丽颖 张红英 侯贝贝 崔保安 胡慧 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期521-525,共5页
为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重... 为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量RT-PCR检测的标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增,并制作标准曲线,建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明:该方法检测灵敏度可达30拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有重复性好、特异性强、灵敏度高等优点,可用于临床TGEV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 实时荧光定量rt—pcr技术
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药品中白色念珠菌的实时荧光定量PCR快速检测法
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作者 李杰 陈学海 +2 位作者 林鹏 李学红 钱云开 《食品与药品》 CAS 2024年第6期537-541,共5页
目的建立一种药品中白色念珠菌的快速检测法。方法根据白色念珠菌ITS2基因序列,设计特异性引物和探针,通过优化扩增反应体系进行实时荧光定量PCR扩增,达到快速检测药品中白色念珠菌的目的。结果方法具有良好的重复性和稳定性,能满足试... 目的建立一种药品中白色念珠菌的快速检测法。方法根据白色念珠菌ITS2基因序列,设计特异性引物和探针,通过优化扩增反应体系进行实时荧光定量PCR扩增,达到快速检测药品中白色念珠菌的目的。结果方法具有良好的重复性和稳定性,能满足试验要求,药品中白色念珠菌的检测灵敏度达2 cfu/g(ml),仅需3~5 d即可完成检测,采用该方法检测4批药品,结果与药典方法一致。结论本方法检测特异性强、所需时间短、灵敏度高,可作为《中国药典》白色念珠菌检查法的补充方法。 展开更多
关键词 中国药典 药品 白色念珠菌 实时荧光定量pcr 检测
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